LFY est un facteur de transcription clé dans le développement des plantes, et en particulier dans la floraison des angiospermes. Il a un rôle important, d'abord, dans l'établissement des méristèmes floraux et plus tard, dans la spécification de leurs identités d'organes floraux. Cette activité implique des réarrangements majeurs de la chromatine dans le noyau des cellules. Des loci cibles doivent passer d'un état fermé à un état ouvert. Au cours des deux dernières décennies, les Facteurs de Transcription Pionniers (PTF) ont été étudiés car ils peuvent lier leurs sites cibles à l'ADN nucléosomique, ils peuvent surmonter les contraintes stériques des nucléosomes et établir un état «compétent» dans une région particulière pour qu’il puisse être davantage régulé par d'autres partenaires (Iwafuchi-Doi & Zaret, 2014). Il a été démontré que LFY interagit physiquement et génétiquement avec deux ATPases appartenant à des complexes de remodelage de la chromatine ATP-dépendants, SYD et BRM (Wu et al., 2012). En outre, des analyses de données à l'échelle du génome suggèrent fortement que son domaine d'oligomérisation N-terminal, confère à LFY un accès à des régions fermées de la chromatine (Sayou et al., 2016). De cette manière, LFY présente des caractéristiques communes avec les PTF. Nous avons travaillé afin de mieux comprendre le mode d'action de LFY par rapport aux ATPases mentionnées ainsi qu'à la chromatine.Au chapitre I, à travers des expériences in vitro, l'interaction potentielle de LFY avec les nucléosomes a été évaluée. Nous avons reconstitué des nucléosomes, en identifiant des régions enrichies en nucléosomes dans le génome d'Arabidopsis, ciblées efficacement par LFY. Ces régions ont été sélectionnées à partir des données génomiques de ChIP-seq de LFY dans les lignes de surexpression ainsi que des données de DNAse-seq et de MNase-seq, qui ont été utiles pour analyser le paysage chromatinien (T. Zhang, Zhang, & Jiang, 2015; W. Zhang, Zhang, Wu, & Jiang, 2012). Une liaison forte mais non-spécifique de LFY de la gymnosperme Ginkgo biloba aux nucléosomes a été observée. Cependant, LFY d'Arabidopsis thaliana a montré une faible liaison aux nucléosomes.Au chapitre II, l'objectif était de cartographier les domaines d'interaction minimale nécessaires de LFY et les ATPases SYD et BRM. En utilisant la technique HTRF, nous avons montré que le domaine C-terminal de LFY interagit avec le domaine HSA de BRM. De plus, grâce à une approche in vivo, nous avons observé la perte du phénotype 35S:LFY dans les plantes F1 de chacun des trois croisements: 35S:LFY syd-5, 35S:LFY brm-1 et 35S:LFY brm-3. Cela suggère une interaction forte, ce qui signifie que lorsque BRM ou SYD ne sont pas fonctionnels, la fonction de LFY est affectée et aucune fleur ectopique n'est formée. / LFY is a key transcription factor in plant development, and especially in flowering for angiosperms. It has an important role, first, in the establishment of floral meristems and later, in the specification of their floral organ identities. This activity implicates on cells’ nucleus major chromatin rearrangements. Target loci need to pass from a closed to an opened state. In the last two decades, Pioneer Transcription Factors (PTFs) have been studied because they can bind their target sites at nucleosomal DNA, they are able to overcome the steric constraints of nucleosomes and establish a “competent state” in a particular region, so it can be further regulated by other partners (Iwafuchi-Doi & Zaret, 2014). LFY has been demonstrated to physically and genetically interact with two ATPases belonging to ATP-dependent chromatin remodeling complexes, SYD and BRM (Wu et al., 2012). Besides, genome-wide data analyses strongly suggest that its N-terminal oligomerization domain, confers LFY access to closed regions of chromatin (Sayou et al., 2016). In this way, LFY presents common features with PTFs. We worked in order to better understand LFY’s mode of action in relation to the mentioned ATPases as well as with chromatin.In Chapter I, through in vitro experiments, LFY’s potential interaction with nucleosomes, was assessed. We performed reconstituted nucleosomes by identifying nucleosome-enriched regions in Arabidopsis genome, efficiently targeted by LFY. These regions were selected used genome-wide data from ChIP-seq of LFY in overexpressing lines and DNAse-seq as well as MNase-seq data, which was useful to analyze chromatin landscape (T. Zhang, Zhang, & Jiang, 2015; W. Zhang, Zhang, Wu, & Jiang, 2012). A strong but non-specific binding of LFY from the gymnosperm Ginkgo biloba to nucleosomes was observed. However, LFY from Arabidopsis thaliana, showed a weak binding to nucleosomes.In Chapter II, the aim was to map the minimal necessary interacting domains of LFY and the ATPases SYD and BRM. Using the HTRF technique, LFY’s C-terminal domain was shown to interact with BRM’s HSA domain. In addition, through an in vivo approach, we observed the loss of the 35S:LFY phenotype in the F1 plants from each of the three crosses: 35S:LFY syd-5, 35S:LFY brm-1 and 35S:LFY brm-3. This suggested a strong interaction, meaning that when BRM or SYD are not functional, LFY’s function is affected and no ectopic flowers are formed.

The TALE factors, comprising the pbx and prep/meis gene families, are transcription factors (TFs) vital to the proper formation of anterior anatomical structures during embryonic development. Although best understood as essential cofactors for tissue-specific TFs such as the hox genes during segmentation, the TALE factors also form complexes with nuclear factor Y (NFY) in the early zygote. In zebrafish, Pbx4, Prep1, and NFY are maternally deposited and can access their DNA binding sites in compact chromatin. Our results suggest that TALE/NFY complexes have a unique role in early embryonic development which is distinct from each factor’s independent functions at later stages. To characterize these TALE/NFY complexes, we employed high-throughput transcriptomic and genomic techniques in zebrafish embryos. Using dominant negatives to disrupt the function of each factor, we find that they display similar, but not identical, loss-of-function phenotypes and co-regulate genes involved in transcription regulation and embryonic development. Independently, the TALE factors regulate homeobox genes and NFY governs cilia-related genes. ChIP-seq analysis at zygotic genome activation reveals that the TALE factors occupy DECA sites adjacent to CCAAT boxes near genes expressed early in development and involved with transcription regulation. Finally, DNA elements containing TALE and NFY binding sites drive reporter gene expression in transgenic zebrafish, and disruption of TALE/NFY binding via mutation or dominant negatives eliminates this expression. Taken together, this data suggests that the TALE factors and NFY cooperate to regulate a set of development and transcription control genes in early zygotic development but also have independent roles after gastrulation.

Durant le développement embryonnaire, une seule cellule, le zygote, est à l’origine de la formation de tous les types de cellules de l’organisme. L’information génétique nécessaire au destin d’une cellule y est gardé dans la chromatine condensée, d’abord inaccessible, et se déploie progressivement au moment opportun de la différenciation cellulaire grâce à des facteurs pionniers. Les facteurs de transcription pionniers sont des acteurs clés des cascades génétiques et épigénétiques déterminant le destin cellulaire. Les facteurs pionniers ont la propriété unique de reconnaître leurs cibles dans la chromatine fermée. Leur action permet d’augmenter l’accessibilité à un répertoire d’enhancers spécifique à un destin cellulaire, ouvrant la voie aux autres facteurs de transcription. Les aspects entourant la reconnaissance initiale des facteurs pionniers à leurs cibles dans la chromatine fermée sont mal compris. Dans l’hypophyse, le facteur pionnier Pax7 est spécifique aux cellules du lobe intermédiaire et met en place le programme génétique mélanotrope. Pour se faire, Pax7 repère les régions régulatrices clé de l’identité mélanotrope dans la chromatine fermée, afin d’accroître l’accessibilité à l’ADN permettant la liaison d’autres facteurs non-pionniers. Pax7 possède deux domaines de liaison à l’ADN, le domaine paired (PD) et l’homéodomaine (HD), chacun liant un motif de séquence caractéristique. De plus, une séquence cible composite, formé de la juxtaposition des motifs reconnus par PD et HD, est enrichie aux sites pionniers de Pax7. Dans le but de définir les propriétés de liaison à l’ADN de Pax7, nous avons caractérisé les interactions de Pax7 avec ses différentes séquences cibles. Nous avons démontré par des expériences de liaison à l’ADN in vitro (retard sur gel) que l’interaction de Pax7 avec le motif composite est d’affinité supérieure et sous forme de monomère où le PD est principalement impliqué. Comme les sites cibles de Pax7 dans l’hétérochromatine sont marqués par la méthylation de l’ADN, nous avons montré que la méthylcytosine dans le motif de liaison n’interfère pas avec la liaison à l’ADN par Pax7. De plus, des mutations ponctuelles aux domaines de liaison à l’ADN de Pax7 ont montré que les deux domaines de liaison à l’ADN sont nécessaires pour le recrutement aux sites dans la chromatine fermée, a fortiori pour l’ouverture de la chromatine. Des études antérieures ayant identifié des transcrits alternatifs de Pax7, nous avons étudié l’impact fonctionnel des variants Pax7. Les quatre isoformes Pax7 comportent des résidus d’acides aminés alternatifs au niveau du PD : elles ont des propriétés de liaison à l’ADN in vitro ainsi qu’un potentiel de transactivation très similaires. Bien que les isoformes de Pax7 aient des activités pionnières variables, leur action différentielle n’est pas dû à leurs propriétés intrinsèques de liaison à l’ADN ou de transactivation. Nos travaux ont identifié les particularités de Pax7 par rapport à d’autres facteurs pionniers dans les mécanismes de reconnaissance des sites dans l’hétérochromatine. Ainsi, les enhancers sujet à l’action pionnière de Pax7 contiennent typiquement plus de motifs cibles que les cibles d’action transcriptionnelle et l’action pionnière de Pax7 un recrutement fort aux sites pionniers ; de plus, les deux domaines de liaison à l’ADN intacts sont essentiels pour ce recrutement et l’action pionnière. Nos travaux ont défini les paramètres requis pour le reprogrammage cellulaire par un pionnier, Pax7, tout particulièrement en regard des sites de recrutement dans la chromatine fermée. La reprogrammation de cellules souches pour la production de cellules différenciées présente un potentiel thérapeutique unique en médecine régénérative et nos travaux supportent le rôle critique des pionniers dans ce contexte. / During embryonic development, a single cell, the zygote, is responsible for the formation of all cell types in the body. The genetic information necessary for cell fates is stored there in condensed chromatin, initially inaccessible, and is gradually deployed at the opportune moment of cell differentiation by the pioneer factors. Pioneer transcription factors are key determinants in the genetic and epigenetic cascades leading to cell fate. Pioneer factors have the unique property of recognizing their DNA targets in closed chromatin. Their action provides accessibility to a repertoire of enhancers specific to a cell fate, opening the way for other transcription factors. We poorly understand initial recognition of pioneer factors at their targets in closed chromatin. In the pituitary gland, the pioneer factor Pax7 is specific to the intermediate lobe and implements the melanotrope genetic program. To do so, Pax7 identifies key regulatory regions of melanotrope identity in closed chromatin to provide DNA accessibility allowing the binding of other non-pioneer factors. Pax7 has two DNA binding domains (DBD), the paired domain (PD) and the homeodomain (HD), each binding a characteristic sequence motif. In addition, a composite target sequence, formed from the juxtaposition of PD and HD motifs, is enriched at the pioneer sites of Pax7. In order to define the DNA binding properties of the pioneer factor Pax7, we characterized the interactions of Pax7 with its different target sequences. We have demonstrated by in vitro DNA binding experiments (gel shift) that the interaction of Pax7 with the composite motif is of higher affinity and as a monomeric form in which the PD is primarily involved. As Pax7 target sites in heterochromatin are marked by DNA methylation, we showed that methylcytosine within the binding motif does not interfere with Pax7 DNA binding. Using point mutations in the Pax7 DBDs, we showed that both DBDs are required for the recruitment to sites in closed chromatin, furthermore for chromatin opening. Since previous studies identified alternative Pax7 transcripts, we investigated the functional impact of Pax7 variants. The four Pax7 isoforms contain alternative amino acid residues in the PD: they have similar in vitro DNA binding properties and transactivation potential. Although Pax7 isoforms have varying pioneering activities, their differential action is not due to their intrinsic DNA-binding or transactivation properties. Our work has identified the particularities of Pax7 compared to other pioneering factors in the mechanisms of site recognition in heterochromatin. Thus, the enhancers subject to the pioneer action of Pax7 typically contain more target motifs than the targets of transcriptional action and the pioneer action of Pax7 a strong recruitment to the pioneer sites; moreover, the two intact DNA-binding domains are essential for this recruitment and pioneering action. Our work has defined the parameters required for cellular reprogramming by a pioneer, Pax7, particularly with regard to recruitment to sites in closed chromatin. The reprogramming of stem cells for the production of differentiated cells has unique therapeutic potential in regenerative medicine and our work supports the critical role of pioneers in this context.