Os níveis de ácido pipecólico (AP) estão elevados em desordens metabólicas severas do sistema nervoso central como na Síndrome de Zellweger, Doença de Refsum Infantil, Adrenoleucodistrofia neonatal e Hiperlisinemia. Os indivíduos afetados apresentam disfunção neurológica progressiva, hipotonia e retardo no crescimento. Os mecanismos de dano cerebral nestas desordens ainda permanecem pouco compreendidos. Uma vez que o catabolismo do AP pode produzir H2O2 através de oxidases, o estresse oxidativo pode ser um possível mecanismo envolvido na fisiopatologia dessas doenças. O ácido lipoico (AL) é considerado um eficiente antioxidante e tem sido sugerido em estudos para o tratamento e prevenção do estresse oxidativo em vários modelos experimentais de desordens do sistema neurológico. Considerando que, para o nosso conhecimento, nenhum estudo investigou o papel do AP sobre o estresse oxidativo, no presente trabalho foram investigados os efeitos in vitro do AP em alguns parâmetros de estresse oxidativo e avaliada a eficácia do AL contra possíveis efeitos pró-oxidantes do AP em córtex cerebral de ratos de 14 dias de vida. Os sobrenadantes de córtex cerebral foram incubados por 1 h a 37ºC na presença de AP ou AL e os controles foram incubados somente com o meio que era constituído de tampão fosfato de sódio 20 mM contendo 140 mM de KCl, pH 7,4. As concentrações finais de AP no meio foram de 0,1, 0,25, 0,5 e 1,0 mM. O AL foi incubado sozinho na concentração de 0,1 mM e na presença de AP (1 mM). Alíquotas foram utilizadas para as medidas imediatamente após a incubação. As atividades da catalase, glutationa peroxidase, glicose 6-fosfato desidrogenase e glutationa S-transferase juntamente com o conteúdo de glutationa reduzida (GSH) foram significativamente reduzidas, enquanto a atividade da superóxido dismutase e as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) foram significativamente aumentadas pelo AP. O AL foi capaz de prevenir esses efeitos melhorando a atividade das enzimas antioxidantes, aumentando o conteúdo de GSH e reduzindo os níveis de TBA-RS. Em contraste, as atividades da glutationa redutase e 6-fosfogluconato desidrogenase e o conteúdo de sulfidrilas não foram alterados. Tomados em conjunto, pode-se presumir que o AP in vitro induz estresse oxidativo e o AL é capaz de prevenir estes efeitos. / Pipecolic acid (PA) levels are increased in severe metabolic disorders of the central nervous system such as Zellweger syndrome, infantile Refsum disease, neonatal adrenoleukodystrophy and hyperlysinemia. Affected individuals present progressive neurological dysfunction, hypotonia and growth retardation. The mechanisms of brain damage in these disorders remain poorly understood. Since PA catabolism produces H2O2 by oxidases, oxidative stress may be a possible mechanism involved in the pathophysiology of these diseases. Lipoic acid (LA) is considered an efficient antioxidant and has been suggested in studies for the treatment and prevention of oxidative stress in experimental models of many disorders of the neurologic system. Considering that, to our knowledge, no study has investigated the role of PA on oxidative stress, in the present work we investigated the in vitro effects of PA on some oxidative stress parameters and evaluated the LA efficacy against possible pro-oxidant effects of PA in cerebral cortex of 14 day-old rats. Cerebral cortex supernatants were incubated for 1 h at 37°C in the presence of PA or LA, and controls were incubated with medium only consisting of 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 and 140 mM KCl. The final concentrations of PA in the medium were 0.1, 0.25, 0.5 and 1.0 mM. The LA was incubated alone at a concentration of 0.1 mM and in the presence of PA (1mM). Aliquots were used for the measurements immediately after the incubation. The activities of catalase, glutathione peroxidase, glucose 6-phosphate dehydrogenase, and glutathione S-transferase along with reduced glutathione (GSH) content were significantly decreased, while superoxide dismutase activity and thiobarbituric acidreactive substances (TBA-RS) were significantly enhanced by PA. LA was able to prevent these effects by improving the activity of antioxidant enzymes, increasing GSH content and reducing TBA-RS. In contrast, glutathione reductase and 6- phosphogluconate dehydrogenase activities and sulfhydryl content were not altered. Taken together, it may be presumed that PA in vitro elicits oxidative stress and LA is able to prevent these effects.

Os níveis de ácido pipecólico (AP) estão elevados em desordens metabólicas severas do sistema nervoso central como na Síndrome de Zellweger, Doença de Refsum Infantil, Adrenoleucodistrofia neonatal e Hiperlisinemia. Os indivíduos afetados apresentam disfunção neurológica progressiva, hipotonia e retardo no crescimento. Os mecanismos de dano cerebral nestas desordens ainda permanecem pouco compreendidos. Uma vez que o catabolismo do AP pode produzir H2O2 através de oxidases, o estresse oxidativo pode ser um possível mecanismo envolvido na fisiopatologia dessas doenças. O ácido lipoico (AL) é considerado um eficiente antioxidante e tem sido sugerido em estudos para o tratamento e prevenção do estresse oxidativo em vários modelos experimentais de desordens do sistema neurológico. Considerando que, para o nosso conhecimento, nenhum estudo investigou o papel do AP sobre o estresse oxidativo, no presente trabalho foram investigados os efeitos in vitro do AP em alguns parâmetros de estresse oxidativo e avaliada a eficácia do AL contra possíveis efeitos pró-oxidantes do AP em córtex cerebral de ratos de 14 dias de vida. Os sobrenadantes de córtex cerebral foram incubados por 1 h a 37ºC na presença de AP ou AL e os controles foram incubados somente com o meio que era constituído de tampão fosfato de sódio 20 mM contendo 140 mM de KCl, pH 7,4. As concentrações finais de AP no meio foram de 0,1, 0,25, 0,5 e 1,0 mM. O AL foi incubado sozinho na concentração de 0,1 mM e na presença de AP (1 mM). Alíquotas foram utilizadas para as medidas imediatamente após a incubação. As atividades da catalase, glutationa peroxidase, glicose 6-fosfato desidrogenase e glutationa S-transferase juntamente com o conteúdo de glutationa reduzida (GSH) foram significativamente reduzidas, enquanto a atividade da superóxido dismutase e as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) foram significativamente aumentadas pelo AP. O AL foi capaz de prevenir esses efeitos melhorando a atividade das enzimas antioxidantes, aumentando o conteúdo de GSH e reduzindo os níveis de TBA-RS. Em contraste, as atividades da glutationa redutase e 6-fosfogluconato desidrogenase e o conteúdo de sulfidrilas não foram alterados. Tomados em conjunto, pode-se presumir que o AP in vitro induz estresse oxidativo e o AL é capaz de prevenir estes efeitos. / Pipecolic acid (PA) levels are increased in severe metabolic disorders of the central nervous system such as Zellweger syndrome, infantile Refsum disease, neonatal adrenoleukodystrophy and hyperlysinemia. Affected individuals present progressive neurological dysfunction, hypotonia and growth retardation. The mechanisms of brain damage in these disorders remain poorly understood. Since PA catabolism produces H2O2 by oxidases, oxidative stress may be a possible mechanism involved in the pathophysiology of these diseases. Lipoic acid (LA) is considered an efficient antioxidant and has been suggested in studies for the treatment and prevention of oxidative stress in experimental models of many disorders of the neurologic system. Considering that, to our knowledge, no study has investigated the role of PA on oxidative stress, in the present work we investigated the in vitro effects of PA on some oxidative stress parameters and evaluated the LA efficacy against possible pro-oxidant effects of PA in cerebral cortex of 14 day-old rats. Cerebral cortex supernatants were incubated for 1 h at 37°C in the presence of PA or LA, and controls were incubated with medium only consisting of 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 and 140 mM KCl. The final concentrations of PA in the medium were 0.1, 0.25, 0.5 and 1.0 mM. The LA was incubated alone at a concentration of 0.1 mM and in the presence of PA (1mM). Aliquots were used for the measurements immediately after the incubation. The activities of catalase, glutathione peroxidase, glucose 6-phosphate dehydrogenase, and glutathione S-transferase along with reduced glutathione (GSH) content were significantly decreased, while superoxide dismutase activity and thiobarbituric acidreactive substances (TBA-RS) were significantly enhanced by PA. LA was able to prevent these effects by improving the activity of antioxidant enzymes, increasing GSH content and reducing TBA-RS. In contrast, glutathione reductase and 6- phosphogluconate dehydrogenase activities and sulfhydryl content were not altered. Taken together, it may be presumed that PA in vitro elicits oxidative stress and LA is able to prevent these effects.

Os níveis de ácido pipecólico (AP) estão elevados em desordens metabólicas severas do sistema nervoso central como na Síndrome de Zellweger, Doença de Refsum Infantil, Adrenoleucodistrofia neonatal e Hiperlisinemia. Os indivíduos afetados apresentam disfunção neurológica progressiva, hipotonia e retardo no crescimento. Os mecanismos de dano cerebral nestas desordens ainda permanecem pouco compreendidos. Uma vez que o catabolismo do AP pode produzir H2O2 através de oxidases, o estresse oxidativo pode ser um possível mecanismo envolvido na fisiopatologia dessas doenças. O ácido lipoico (AL) é considerado um eficiente antioxidante e tem sido sugerido em estudos para o tratamento e prevenção do estresse oxidativo em vários modelos experimentais de desordens do sistema neurológico. Considerando que, para o nosso conhecimento, nenhum estudo investigou o papel do AP sobre o estresse oxidativo, no presente trabalho foram investigados os efeitos in vitro do AP em alguns parâmetros de estresse oxidativo e avaliada a eficácia do AL contra possíveis efeitos pró-oxidantes do AP em córtex cerebral de ratos de 14 dias de vida. Os sobrenadantes de córtex cerebral foram incubados por 1 h a 37ºC na presença de AP ou AL e os controles foram incubados somente com o meio que era constituído de tampão fosfato de sódio 20 mM contendo 140 mM de KCl, pH 7,4. As concentrações finais de AP no meio foram de 0,1, 0,25, 0,5 e 1,0 mM. O AL foi incubado sozinho na concentração de 0,1 mM e na presença de AP (1 mM). Alíquotas foram utilizadas para as medidas imediatamente após a incubação. As atividades da catalase, glutationa peroxidase, glicose 6-fosfato desidrogenase e glutationa S-transferase juntamente com o conteúdo de glutationa reduzida (GSH) foram significativamente reduzidas, enquanto a atividade da superóxido dismutase e as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) foram significativamente aumentadas pelo AP. O AL foi capaz de prevenir esses efeitos melhorando a atividade das enzimas antioxidantes, aumentando o conteúdo de GSH e reduzindo os níveis de TBA-RS. Em contraste, as atividades da glutationa redutase e 6-fosfogluconato desidrogenase e o conteúdo de sulfidrilas não foram alterados. Tomados em conjunto, pode-se presumir que o AP in vitro induz estresse oxidativo e o AL é capaz de prevenir estes efeitos. / Pipecolic acid (PA) levels are increased in severe metabolic disorders of the central nervous system such as Zellweger syndrome, infantile Refsum disease, neonatal adrenoleukodystrophy and hyperlysinemia. Affected individuals present progressive neurological dysfunction, hypotonia and growth retardation. The mechanisms of brain damage in these disorders remain poorly understood. Since PA catabolism produces H2O2 by oxidases, oxidative stress may be a possible mechanism involved in the pathophysiology of these diseases. Lipoic acid (LA) is considered an efficient antioxidant and has been suggested in studies for the treatment and prevention of oxidative stress in experimental models of many disorders of the neurologic system. Considering that, to our knowledge, no study has investigated the role of PA on oxidative stress, in the present work we investigated the in vitro effects of PA on some oxidative stress parameters and evaluated the LA efficacy against possible pro-oxidant effects of PA in cerebral cortex of 14 day-old rats. Cerebral cortex supernatants were incubated for 1 h at 37°C in the presence of PA or LA, and controls were incubated with medium only consisting of 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 and 140 mM KCl. The final concentrations of PA in the medium were 0.1, 0.25, 0.5 and 1.0 mM. The LA was incubated alone at a concentration of 0.1 mM and in the presence of PA (1mM). Aliquots were used for the measurements immediately after the incubation. The activities of catalase, glutathione peroxidase, glucose 6-phosphate dehydrogenase, and glutathione S-transferase along with reduced glutathione (GSH) content were significantly decreased, while superoxide dismutase activity and thiobarbituric acidreactive substances (TBA-RS) were significantly enhanced by PA. LA was able to prevent these effects by improving the activity of antioxidant enzymes, increasing GSH content and reducing TBA-RS. In contrast, glutathione reductase and 6- phosphogluconate dehydrogenase activities and sulfhydryl content were not altered. Taken together, it may be presumed that PA in vitro elicits oxidative stress and LA is able to prevent these effects.

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Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

[ES] El tiempo de floración es uno de los caracteres más importantes que influyen en la productividad y el rendimiento de los cultivos. La identificación de compuestos sintéticos que sean bioactivos en el control de la inducción floral es de gran interés. Su identificación podría permitirnos ajustar el tiempo de floración en los cultivos, adaptándolos a las condiciones ambientales más favorables. Para identificar estos compuestos, hemos tomado dos enfoques diferentes: un cribado genético químico y la caracterización del metaboloma de transición floral. En primer lugar, realizamos un rastreo de genética química para identificar moléculas pequeñas que tengan el potencial de controlar la expresión del florígeno, FLOWERING LOCUS T (FT) o la actividad o señalización de FT en Arabidopsis. Para ello, hemos utilizado plantas transgénicas que expresan el gen ß-GLUCURONIDASE (GUS) bajo el control del promotor FT para probar una librería de 360 moléculas preseleccionadas. Los resultados positivos obtenidos se volvieron a analizar mediante un cribado secundario basado en la expresión del gen reportero LUCIFERASE (LUC) bajo el control del promotor FT. Utilizando este enfoque, hemos identificado una molécula que induce con éxito la floración en condiciones de cultivo in vitro. En segundo lugar, hemos caracterizado la función del ácido pipecólico (Pip), una molécula previamente identificada como candidata a regular la floración. Hemos confirmado que las mutaciones en las enzimas responsables de la biosíntesis de Pip muestran una alteración en la respuesta del tiempo de floración. Además, hemos identificado un nuevo papel del Pip relacionado con el crecimiento y el tamaño de la roseta de Arabidopsis. Finalmente, utilizamos un sistema inducible basado en el promotor de CONSTANS (CO) que controla la expresión del gen endógeno de CO fusionado con el receptor de glucocorticoides de rata (CO::GR). De manera que con un solo tratamiento con dexametasona podemos inducir la floración. Con este sistema, realizamos un estudio del metaboloma de muestras de ápices y hojas mediante técnicas de metabolómica dirigida, lipidómica, cuantificación hormonal y transcriptómica. La integración de estos conjuntos de datos ómicos nos ha permitido identificar rutas metabólicas que se encuentran alteradas durante la transición floral. A su vez, la caracterización de mutantes de pérdida de función que codifican enzimas clave de esas vías metabólicas, reveló que algunos de estos mutantes mostraban un fenotipo afectado para el tiempo de floración. Entre ellos, nos enfocamos en la caracterización de los genes relacionados con el metabolismo de la rafinosa, un oligosacárido de reserva. Mutantes afectados en el gen RAFFINOSE SYNTHASE 5 (RS5) presentan un fenotipo de floración temprana y fertilidad reducida. En base a los resultados obtenidos, proponemos un modelo en el que, durante la transición floral, se produce una reestructuración de las ratios entre carbohidratos sencillos (monosacáridos y disacáridos) y de reserva, como la rafinosa. Estos cambios podrían ser modulados por el ácido abscísico (ABA) y por genes relacionados con la floración, desencadenando cambios en el metabolismo de la trehalosa y promoviendo una expresión temprana de FT. / [CA] El temps de floració és un dels caràcters amb més influència en la productivitat i el rendiment dels cultius. La identificació de compostos sintètics bioactius per al control de la inducció floral és de gran interés, ja que la seua identificació podria permetre ajustar el temps de floració dels cultius, aspecte que podria contribuir a l'adaptació a condicions ambientals més favorables. Per a identificar aquests compostos, hem portat a terme dues aproximacions diferents: un garbellat genètic químic i la caracterització del metaboloma de la transició floral. En primer lloc, hem realitzat un cribratge genètic-químicper a identificar xicotetes molècules amb potencial per a controlar l'expressió del florígen, FLOWERING LOCUS T (FT) o l'activitat o la senyalització de FT a Arabidopsis. Per a portar a terme aquest cribratge, hem utilitzat plantes transgèniques que expressen el gen ß-GLUCURONIDASE (GUS) sota el control del promotor de FT amb les quals hem assajat una llibreria de 360 molècules preseleccionades de manera prèvia. Els resultats positius obtinguts en aquest cribratge t s'han sotmés a un cribratge secundari basat en l'expressió del gen reporter LUCIFERASE (LUC) sota el control del promotor FT. La utilització d'aquesta primera aproximació ha permés la idenfiticació d'una molècula que indueix amb èxit la floració en condicions de cultiu in vitro. En En segon lloc, hem caracteritzat la funció de l'àcid pipecòlic (Pip), una molècula prèviament identificada com a candidata a regular la floració. Aquesta aproximació ens ha permet confirmar que mutacions als enzims responsables de la biosíntesi de Pip comporten una alteració al temps de floració. A més, en aquest treball hem identificat un nou paper del Pip relacionat amb el creixement i la grandària de la roseta d'Arabidopsis. Finalment, hem utilitzat un sistema induïble basat en el promotor de CONSTANS (CO) que controla l'expressió del gen endogen de CO fusionat al receptor de glucocorticoides de rata (CO::GR). Aquesta construcció ens proporciona una ferramenta amb la qual induir la floració amb un sol tractament amb dexametasona. A continuació, hem realitzat un estudi del metaboloma de mostres d'àpexs i fulles mitjançant tècniques de metabolòmica dirigida, lipidómica, quantificació hormonal i transcriptòmica. La integració d'aquest conjunt de dades ómiques ens ha permés identificar les rutes metabòliques que es troben alterades durant la transició floral. Al mateix temps, la caracterització de mutants de pèrdua de funció que codifiquen enzims clau per a aquestes rutes metabòliques, ha revelat que alguns d'aquests mutants mostren un fenotip afectat pel que fa al temps de floració. Dintre dels mutants analitzats, ens hem centrat en la caracterització dels gens relacionats amb el metabolisme de la rafinosa, un oligosacàrid de reserva. Els mutants del gen RAFFINOSE SYNTHASE 5 (RS5) presenten un fenotip de floració primerenca i fertilitat reduïda. Sobre la base dels resultats obtinguts, proposem un model en el qual, durant la transició floral, es produeix una reestructuració de les ràtios entre carbohidrats senzills (monosacàrids i disacàrids) i de reserva, com la rafinosa. Aquests canvis podrien ser modulats per l'àcid abscísic (ABA) i per gens relacionats amb la floració, i desencadenariencanvis al metabolisme de la trehalosa, així com la generació de l'expressió primerenca de FT. / [EN] Flowering time is one of the most important traits affecting crop productivity and yield. The identification of natural or synthetic bioactive compounds for the control of flowering induction is of great interest. The identification of compounds with the potential to regulate flowering could allow us to fine-tune flowering responses in crops and adapt them to the changing environmental conditions. To identify these compounds, we have taken two different approaches: a chemical genetic screening and the characterization of the metabolome of floral transition. First, we performed a chemical genetic screening to identify small molecules that have the potential to control the expression of the florigen FLOWERING LOCUS T (FT) or FT activity or signaling in Arabidopsis. We used transgenic plants expressing the ß-GLUCURONIDASE gene (GUS) under the control of the FT promoter to test a preselected library of 360 molecules. Positive hits were retested by a secondary screening based on the expression of the LUCIFERASE (LUC) reporter gene under the control of the FT promoter. Using this approach, we have identified one molecule that successfully induces flowering under in vitro culture conditions. Secondly, we have characterized the function of pipecolic acid (Pip), a molecule previously identified as a candidate to regulate flowering time. We have confirmed that mutations in enzymes responsible for Pip biosynthesis display an altered flowering response. A new role for Pip in rosette growth is also revealed in this work. Finally, we used an inducible system based on the promoter of CONSTANS (CO) driving the expression of CO fused to the rat glucocorticoid receptor (CO::GR). Such a construction provides a tool to induce flowering with a single dexamethasone treatment. We then performed a comprehensive metabolomic study of the shoot apex and leaf samples that included targeted metabolomics, lipidomics, hormone quantification, and transcriptomics. Integration of these omic datasets has allowed us to point out metabolic pathways that are altered during floral induction. Characterization of loss-of-function mutants coding key enzymes of those metabolic pathways revealed that some of these mutants showed a flowering time phenotype. Among them, we focused on the characterization of the contribution of the raffinose metabolism, a storage oligosaccharide, to the determination of flowering time. Mutants affecting RAFFINOSE SYNTHASE 5 (RS5) exhibit an early flowering phenotype and reduced fertility. We propose a model in which the balance between simple and storage carbohydrates in the apex changes during floral induction. This change could be modulated by ABA and flowering-related genes, and it triggers changes in trehalose metabolism, promoting flowering by an early FT upregulation. / Praena Tamayo, J. (2022). Identification of Bioactive Molecules in the Control of Flowering Time [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185177 / TESIS