Der Band ist so etwas wie ein Reisebuch – eine Empfehlung zum Spazierengehen. Er durchstreift Pirna und sein Umland. Wir begeben uns auf die Spuren einer vergessenen Familie: der Familie Scooler. Außerdem besuchen wir Orte der Zwangsarbeit, der Verfolgung von politischen Gegner*innen, der Bücherverbrennung und der »Euthanasie« im Nationalsozialismus. Die Shoah, die Verfolgung und Ermordung der europäischen Jüdinnen und Juden, und das Erinnern an sie ist nicht Teil unseres Alltags. Zu wenig bekannt und gekennzeichnet ist diese Geschichte. Wer hat hier gelebt und gewirkt, wer war Teil der Nachbarschaft? Wer musste gehen, wurde verfolgt und ermordet? Wessen Spuren suchen wir auf diesem Spaziergang? Redaktionsschluss: 31. März 2021

L’infertilité est définie par l’OMS comme l’incapacité à concevoir un enfant dans un couple, après au moins douze mois de rapports sexuels réguliers sans protection. Elle concerne 15 % des couples qui désirent avoir un enfant, un facteur masculin est retrouvé dans 50 % des cas. Dans le cadre de cette thèse, les principaux objectifs étaient de déterminer des causes génétiques d’infertilité masculine chez des patients atteints d'oligozoospermie sévère (OS) ou d'asthénozoospermie en lien avec des anomalies morphologiques des flagelles, afin de mieux comprendre la spermatogénèse, d’améliorer la prise en charge des couple infertiles et d'évaluer les risques de transmission à leur descendance. Nous avons abordé ces problématiques par le séquençage d’exome entier d'hommes ayant un de ces phénotypes au sein de deux familles consanguines. L'ensemble des résultats de cette thèse apportent des éléments de réponses sur de nouvelles causes génétiques d’infertilité masculine liée à une anomalie quantitative ou qualitative de la spermatogénèse. De plus, nos résultats concernant EXD1 nous interrogent sur la possibilité de transmission de mutations génétiques ou modifications de marques épigénétiques à la descendance en Assistance Médicale à la Procréation pour certains patients avec une oligozoospermie. / Infertility is defined by the WHO as the inability of a couple to conceive a child after twelve months of unprotected regular sexual intercourse. It concerns 15% of couples who wish to have a child, and a male factor is found in 50% of cases. In this thesis, the main objectives were to determine genetic causes of male infertility in patients with severe oligozoospermia (SO) or asthenozoospermia related to morphological abnormalities of the flagella, in order to better understand spermatogenesis, improve the care of infertile couples and inform risk evaluation for their offspring. We addressed these objectives by sequencing the whole exome of men with one of these phenotypes within two consanguineous families.The results presented in this thesis reveal new genetic causes of male infertility related to a quantitative or a qualitative abnormality of spermatogenesis. Moreover our findings concerning EXD1 raise questions about the risk that, for some patients with oligozoospermia, medically assisted reproduction could transmit de novo genetic or epigenetic modifications to future generations.

During mammalian post-implantation development, germ cells are induced from the somatic tissues of the embryo. Following their induction, primordial germ cells undergo a genome-wide erasure and de novo re-establishment of DNA methylation marks. This epigenetic reprogramming re-instates pluripotency and allows parental imprints to be deposited. In the male germ line, a unique RNAi pathway involving PIWI proteins and their associated small RNAs (piRNAs) is necessary for proper de novo methylation. PIWI mutant mice are infertile and display methylation defects over transposon sequences. Using a transgenic approach, we investigated the signals necessary for piRNA production. We show that artificial piRNAs can be produced from reprogrammed loci outside of their native context. We then studied the genome-wide impact of piRNA loss on germ cell methylation. Whereas most of the genome is properly methylated, only a small group of transposons transiently reactivated in primordial germ cells is affected. Also we identified important structural differences in de novo methylation profiles between human sperm and ES cells. Finally, we compared sperm methylation profiles between human and chimpanzee and showed that the genome and the epigenome can evolve independently. Taken together, our results highlight the surprising plasticity of genome and epigenome interactions during development and evolution

<p>PIWI proteins belong to an evolutionary conserved protein family as the sister sub-family of ARGONAUTE (AGO) proteins. While AGO proteins are functionally well-characterized and shown to mediate small-RNA guided gene regulation, the function of PIWI proteins remain elusive. Here we pursued functional characterization of PIWI proteins by studying MILI and MIWI, two PIWI proteins in the mouse.</p><p>We first show that both MIWI and MILI co-immunoprecipitate with a novel class of non-coding small RNAs from the post-natal mouse testis extract, which are named Piwi-interacting RNAs (piRNAs). Our cloning efforts identified thousands of different piRNA sequences, mostly derived from intergenic regions. Interestingly, both MILI and MIWI piRNAs correspond to the same regions on the genome and differ primarily in length. We propose piRNAs in the adult testis are produced by the processing of long, single stranded RNA precursors, based on the observation that piRNAs originate in clusters from a number of sites on the genome in a head-to-tail homology. In support, we bioinformatically predicted putative promoters, and yeast one hybrid analysis on two such regions found out that they interact with Krueppel C2H2 type zinc finger transcription factors. We did not observe the features of the "ping-pong" mechanism in their biogenesis: Both MILI and MIWI piRNAs are biased for 5` Uracil without an Adenine bias on the 10th nucleotide position, and do not significantly consist of sequences complementary to each other along their first 10nt. Moreover, MILI piRNAs are not down-regulated in Miwi-/- testis. These results indicate that the post-natal testicular piRNAs are produced independent of the ping-pong mechanism. </p><p>Although piRNAs are highly complex, PAGE and in situ analyses showed that piRNAs are germ cell-specific with predominant expression in spermatocytes and round spermatids, suggestive of a meiotic function. Correspondingly, we found that Miwi-/-; Mili-/- mice undergo only male infertility with terminal spermatogenic arrest during meiosis. piRNAs show a nucleo-cytoplasmic distribution, with enrichment in the chromatoid and dense bodies, two male germ cell-specific structures. The dense body has been implicated in synapsis and in the heterochromatinization of the sex chromosomes during male meiosis, a process known as meiotic sex chromosome inactivation (MSCI). Our histological analysis on Miwi-/-; Mili-/- testes showed that, while the overall synapsis is not affected, the sex chromosomes retain the euchromatin marker acetyl-H4K16 and lacks the heterochromatin marker H3K9-dimethyl. These observations indicate that murine PIWI proteins are necessary for MSCI. Moreover, we identified piRNA production from the X chromosome before MSCI, and propose PIWI proteins utilize piRNAs to target and silence unpaired chromosomal regions during meiosis.</p> / Dissertation

Les piwi-interacting RNAs (piRNA) interagissent avec les protéines qui font partie de la branche PIWI de la famille des Argonautes. Ils participent à la répression des transposons dans la ligne germinale. Chez la souris, les protéines PIWI sont indispensables pour la fertilité des mâles et sont responsables de la méthylation de l'ADN au niveau des promoteurs des transposons. Les piRNA sont produis à partir de deux mécanismes: la biogenèse primaire et le cycle d'amplification ping-pong. Nous avons fait des études fonctionnelles sur deux protéines qui participent à la voie des piRNA: l'hélicase d'ARN MOV10L1 et l'immunophiline FKBP6. Nous avons décrit le rôle de MOV10L1 en tant que facteur de biogenèse primaire. La disruption génétique du domaine hélicase de MOV10L mène à une activation des transposons et à une perte de la méthylation de l'ADN. Ainsi, les piRNA ne sont pas produits chez le mutant, ce qui suggère que MOV10L1 est essentielle pour la biogenèse des piRNA. Tdrd1 interagit avec les protéines PIWI et joue un rôle dans la voie des piRNA en recrutant quelques facteurs à partir de son domaine MYND N-terminal. Nous avons montré que le domaine MYND de Tdrd1 interagit avec FKBP6, une protéine qui appartient à une famille d'isomérases de prolines qui sont présentes dans des complexes de chaperonnes. Les études biochimiques réalisées indiquent que FKBP6 est inactive et qu'elle utilise son domaine isomérase comme un module structural qui interagit avec les protéines PIWI, alors qu'elle interagit avec Hsp90 avec son domaine TPR. L'analyse d'une souris mutante pour fkbp6 a révélé une dérépression des transposons et une perte de la méthylation de l'ADN, mais peu d'effets sur la biogenèse primaire. Ces résultats sont en accord avec un rôle de FKBP6 en aval de Tdrd1, et nous pouvons penser que ce rôle pourrait être le recrutement de Hsp90 pour participer au cycle d'amplification ping-pong.

Texte remanié de: Diss.--Medizinische Fakultät--Humboldt-Universität zu Berlin, 1997. / Bibliogr. p. 296-311. Index.

Ces dernières années, de nombreuses études transcriptomiques à grande échelle ont clairement mis en évidence que la grande majorité du génome des eucaryotes est transcrite.Ce réseau complexe de transcrits inclus des petits ARN non codants qui interviennent généralement en tant que régulateurs transcriptionnels, post-transcriptionnels et/ou traductionnels de l’expression de certains ARNm cibles spécifiques. Ils sont classés selon leur origine biologique et leur mode d’action. Une catégorie de petits ARN non codants, les Piwi-interacting RNAs (piRNA), maintient l’intégrité du génome dans les tissus reproducteurs des métazoaires en réprimant les éléments transposables endogènes, des séquences ADN capables de se déplacer et de se dupliquer à l’intérieur du génome. Les piRNA sont produits par deux mécanismes : i) La biogenèse primaire à partir de longs ARN simple brin produits par certains loci spécifiques du génome, les clusters de piRNA, des loci énigmatiques, localisés dans les régions hétérochromatiques et composés de fragments d’éléments transposables actifs, ii) La boucle d’amplification appelée ping-pong. Durant ma thèse, j’ai étudié un cluster de piRNA majeurs dans les cellules somatiques des gonades femelles de Drosophila melanogaster, le locus flamenco. Tout d’abord, j’ai mis en évidence que la transcription de flamenco est initiée à partir d’un promoteur contenant une séquence INR et un élément DPE, reconnu par l’ARN polymerase II, et qu’elle nécessite la présence du facteur de transcription Cubitus Interruptus. Ensuite, j’ai montré que le transcrit de flamenco subit de l’épissage alternatif pour générer divers précurseurs ARN qui seront ensuite maturés en piRNA. De plus, j’ai montré que le promoteur de flamenco serait suffisant pour déclencher l’adressage du transcrit vers la voie de maturation des piRNA. Dans un autre axe, je me suis intéressée à l’organisation tridimensionnelle du locus flamenco au sein du noyau en recherchant ses partenaires d’interaction en utilisant la technique de 4C (capture de la conformation des chromosomes). J’ai pu voir que flamenco semble interagir physiquement avec des régions génomiques fortement transcrites en cis. En trans, le locus flamenco interagit majoritairement avec des régions génomiques péricentromériques et avec d’autres clusters de piRNA. Cette disposition tridimensionnelle particulière pourrait être le reflet d’une organisation fonctionnelle.Dans l’ensemble, ces travaux permettent de mieux comprendre l’expression et le fonctionnement du locus flamenco et ouvrent la voie vers de nouvelles recherches prometteuses. / The past few years it has become clear from many transcriptomic studies that most of the eukaryotic genome is pervasively transcribed. This complex network of transcripts include several types of small RNAs classified as non-coding RNAs. The vast majority of small RNA act as transcriptional, posttranscriptional and/or translational regulators, controlling specific target mRNAs involved in various cellular functions. They are classified based on their biogenesis and mode of action. A subclass of small non-coding RNAs, the Piwi-interacting RNAs (piRNA), ensures genomic stability by silencing endogenous transposable elements, endogenous sequence that are able to move and duplicate into the genome, in both germline and somatic gonadal tissues of metazoan. piRNA are produced through two mechanisms, i) The primary processing pathway from long single-stranded precursors produced by some specific loci in the genome, the piRNA clusters, ii) The secondary pathway by the amplification loop called the ping-pong. piRNA clusters are enigmatic loci localized in heterochromatic region and composed of transposable element fragments.During my PhD, I studied a major piRNA cluster in the somatic cells of Drosophila melanogaster female gonads, the flamenco locus. First, I demonstrated that flamenco transcription is initiated from an RNA Polymerase II promoter containing Inr and DPE elements, and requires the transcription factor, Cubitus interruptus. Then, I showed that the flamenco precursor transcript undergoes differential alternative splicing to generate diverse RNA precursors that are processed into piRNA. Moreover, I showed that the flamenco promoter could be sufficient to target transcripts into the piRNA processing pathway. In an other hand, I was interested to the tridimensional nuclear organization of the flamenco locus using the 4c technology. I saw that the flamenco locus interacts physically with strongly transcribed genomic region in cis. In trans, the flamenco interacts with other peri-centromeric genomic regions and with two other piRNA cluster. This particularly three-dimensional positioning could be the reflect of a functional organization.In the main, this work allows to better understand the expression and the mode ofaction of the flamenco locus and paves the way for new promising research.

Regulation of gene expression in response to cellular and organismal needs is essential for sustaining organisms' survival and successful competition in the evolution of life forms. This regulation is executed at multiple levels starting with regulation of gene transcription, followed by regulation at multiple posttranscriptional levels. In this thesis, I focused on posttranscriptional mechanisms that contribute to gene expression regulation in the model organism Caenorhabditis elegans which enables powerful genetic and genomic techniques and allows the visualization of experimental genetic manipulations in toto, on the level of the complete organism during its life span. For this, we analysed the function of the orthologue of mammalian transcriptional corepressor NCOR, GEI-8. We used a functionally defective mutant gei-8(ok1671). I analysed the whole genome expression of homozygous gei- 8(ok1671) mutant and its link with observed mutant phenotype that includes defective gonad development and sterility and performed experiments leading to the proposition that disbalances in 21-U RNAs of piRNA class present in the most derepressed gene, the predicted mitochondrial sulfide:quinine reductase encoded by Y9C9A.16, are associated with the gonadal phenotype. In the second part of the thesis, I focused on...

Chez les métazoaires, la mobilisation des éléments transposables est régulée par de petits ARN non codants appelés piARN pour "PIWI interacting RNA". Cette répression est très étudiée dans la lignée germinale adulte où elle est particulièrement efficace. Néanmoins, la mobilisation de ces éléments doit être régulée tout au long du développement de la lignée germinale, qui transmet l’information génétique à travers les générations. Durant ma thèse, j’ai utilisé le modèle D. melanogaster pour étudier la répression des éléments transposables au cours du développement de la lignée germinale femelle. J’ai ainsi pu montrer qu’une répression fonctionnelle par les piARN existe dès la fin de l’embryogenèse et que les gènes liés à la régulation chez l'adulte sont également nécessaires pour la répression au cours du développement. L’analyse de données de séquençage haut débit m’a permis de mettre en évidence la production de novo de piARN fonctionnels dans les gonades en formation. De plus, comme dans les ovaires adultes, j'ai pu remarquer une répression incomplète, ressemblant à la variégation, à tous les stades du développement. Des expériences de lignage cellulaire suggèrent fortement qu'une mémoire épigénétique précoce est initiée dans les cellules germinales embryonnaires et maintenue jusqu'au stade adulte. L'implication de l'Heterochromatin Protein 1a (HP1a) dans la production des piARN télomériques montrée par séquençage des piARN pourrait expliquer ce phénomène . Les données présentées ici montrent que piARN et leurs partenaires protéiques sont les composants d'un système de répression épigénétique continu tout au long de la vie des cellules germinales. / In metazoan germ cells, transposable element activity is repressed by small noncoding PIWI-associated RNAs (piRNAs). Numerous investigations in Drosophila have enlightened the mechanism of this repression in the adult germline. However, very little is known about piRNA-mediated repression during germline development. Nevertheless, to maintain the integrity of the genome, repression should occur throughout the lifespan of germ cells. During my PhD, I show that piRNA-mediated repression is active in the female germline, from late embryonic to pupal primordial germ cells, and that genes related to the adult piRNA pathway are required for repression during development. rhino-dependent piRNAs, exhibiting the molecular signature of the piRNA pathway "ping-pong" amplification step, are detected in larval gonads, arguing for de novo biogenesis of functional piRNAs during development. I also show that production of telomeric piRNAs depends on Heterochromatin Protein 1a (HP1a). Furthermore, as in adult ovaries, I observe an incomplete, bimodal and stochastic repression resembling variegation at all developmental stages. Clonal analyzes of this incomplete silencing strongly suggest that a cellular memory of an early repression decision is initiated in embryonic germ cells and further maintained until the adult stage. Taken together, the data presented here show that piRNAs and their associated proteins are epigenetic components of a continuous repression system throughout germ cell development.

La spermatogenèse est le processus par lequel les cellules germinales se différencient pour former les spermatozoides. Elle se déroule à l’intérieur des tubes séminifères. Pendant la période embryonnaire, les précurseurs des cellules germinales adultes constituent un pool de cellules appelées cellules germinales primordiales (Primordial Germ Cells, PGCs), qui vont migrer pour aller coloniser les gonades (Durcova-Hills and Capel, 2008; Surani et al., 2008). Au cours de leur migration, les PGCs vont subir une reprogrammation épigénétique de l’ensemble de leur génome, qui leur sera nécessaire pour passer de l’état somatique à l’état de totipotence (Ohinata et al., 2005). Durant cette reprogrammation, l’ADN est massivement démethylé, entrainant l’activation de plusieurs gènes qui sont importants pour le développement des PGCs, mais également l’activation des éléments transposables (ETs) (Hajkova et al., 2008; Sasaki and Matsui, 2008; Surani and Hajkova, 2010). Ces derniers constituent environ 50% du génome des mammifères. Ils sont subdivisés en deux classes et sont connus par leur capacité à être mobilisés dans le génome (Zamudio and Bourc'his, 2010). Cette mobilisation se fait au hasard et constitue ainsi un risque considérable de mutations, qui peuvent provoquer des tumeurs, des pathologies de développement et une infertilité (Zamudio and Bourc'his, 2010). Pour cela, leur expression doit être contrôlée pour maintenir l’intégrité du génome de la lignée germinale. Pour toutes ces raisons, les PGCs ainsi que les cellules germinales en cours de méiose ont développé des stratégies de défenses pour contrôler la mobilisation et l’expression des ETs basées entre autre sur la voie des piwi-interacting RNA (piRNA) (Chuma and Pillai, 2009; Pillai and Chuma, 2012b). Dans le laboratoire du Pr. Stéphane Viville, mes travaux de thèse se sont concentrés sur l’étude d’un gène nommé Tex19 pour Testis Expressed gene chez la souris. Nous avons démontré que ce gène est spécifique des mammifères et est dupliqué chez le rat et la souris en deux paralogues nommés Tex19.1 et Tex19.2. Deux domaines hautement conservés ont été identifiés par alignement multiple des protéines TEX19 et nommés MCP et VPTEL. Ces domaines ne présentent aucune homologie avec des domaines déjà caractérisés, prévenant ainsi toute prédiction de leurs fonctions (Kuntz et al., 2008). L’étude du profil d’expression de Tex19.1 et Tex19.2 a montré que ces deux gènes sont exprimés dans l’ectoderme et les PGCs. Ils sont aussi co-exprimés dans le testicule de l’âge embryonnaire à l’âge adulte. Néanmoins, seul Tex19.1 est exprimé dans les ovaires et le précurseur du placenta appelé cône ectoplacentaire (Celebi et al., 2012). Le knockout (KO) de Tex19.1 provoque une infertilité masculine chez la souris avec un arrêt de la spermatogenèse au stade pachytène, accompagnée d’une surexpression d’un rétrotransposon, MMERVK10C (Ollinger et al., 2008). Récemment, il a été démontré que Tex19.1 joue aussi un rôle dans le développement du placenta (Reichmann et al., 2013). Au cours de mes trois années de thèse, nous avons approfondie l’étude du KO de Tex19.1dans le testicule, les cellules embryonnaires souches (Embryonic Stem Cells, ESCs) et le placenta (Tarabay et al., 2013). Nous avons également étudié le phénotype observé suite au double KO de Tex19.1 et Tex19.2. [...] / We recently characterized two new mammalian specific genes, Tex19.1 and its paralog Tex19.2. Both genes are expressed in pachytene spermatocytes in adult testes. In addition, Tex19.1 is expressed in pluripotent cells (ES, EG, iPS and PGC cells), the inner cell mass of the blastocysts and the placenta. In order to decipher Tex19 functions, we generate three types of knockout (KO): i) KO of Tex19.1 ii) KO of Tex19.2 iii) double KO (DKO) of both genes. All Tex19.1-/- KO animals are growth-retarded and half of them die just after birth. This phenotype is probably linked to placenta defects. Surviving adults Tex19.1-/- KO males display a variable spermatogenesis phenotype, associated with an up-regulation of one endogenous retrovirus, MMERVK10C. Tex19.2 KO mice exhibit a subtle phenotype. Few seminiferous epitheliums are degenerated while the rest appear normal. DKO show a fully penetrant phenotype similar to the most severe Tex19.1-/- phenotype. DKO males exhibit small testes. Despite the presence of spermatogonia and spermatocytes, spermatogenesis is blocked at the pachytene stage. By RNA deep-sequencing on 10 days old DKO and WT testes, prior to histological phenotype, 114 genes are significantly up-regulated and 320 genes significantly down-regulated in the DKO compared to the WT. Gene ontology analyses show that among of these genes, two essential pathways are altered: meiosis and the piRNA pathway. Consistent with that, GST-pulldown and immunoprecipitation experiments demonstrate that MIWI, MILI, MAEL and MVH are partners of TEX19. Considering PIWI proteins function in the silencing of transposable elements through the piRNA pathway, we checked if TEX19 paralogs bind piRNA. By immunoprecipitation using WT and KO testes, we show that both TEX19.1 and TEX19.2 bind small RNA of 30 nucleotides through their VPTEL domain. This study highlights the pivot role of Tex19 paralogs in three essential functions of mammalian life cycle, i.e. pluripotency, placenta-supported in utero growth and fertility. The functional similarities of both paralogs, through the expression control of one endogenous retrovirus and the binding of piRNAs, lead us to propose that Tex19 paralogs are new members of the piRNA pathway.