Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-01-25Bitstream added on 2014-06-13T18:41:52Z : No. of bitstreams: 1 santos_cep_dr_jabo.pdf: 1168209 bytes, checksum: 2540911ef2f78572789deec0360b9d72 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT) / Pythium insidiosum causa doença de pele e ocasionalmente de outros tecidos de mamíferos e aves que vivem em estreito contato com águas contaminadas. Pelas características bioclimáticas e ambientais da região do Pantanal, estima-se que seja uma das áreas com maior prevalência do mundo. Não obstante, certifica-se na literatura compilada poucos estudo enfatizando aspectos epidemiológicos nessa região, sendo esse o principal objetivo dessa pesquisa. As normais climatológicas foram obtidas de duas estações metereológicas de Instituição pública, que abrange a sub-região do estudo, complementados por dados dispostos em outras fontes. Obteve-se validação de 76 casos em equideos e sete bovinos, através do ELISA-teste, PCR, histopatologia e isolamento do agente. A doença apresentou dinâmica sazonal, com picos de incidência emergindo após os maiores índices pluviométricos. Evidenciaram-se também, um número expressivo de enfermidades confundíveis, coinfecções e reinfecções, demonstrando frágil imunidade do hospedeiro equino ao patógeno. Cabe ressaltar ainda, que ferramentas de diagnóstico são pouco utilizadas a campo. Resposta significativa relativa à imunoterapia (Pitium Vac®) no grupo de equideos tratados e aumento do intervalo de reinfecções, indica que o fármaco poderá ser aperfeiçoado, de modo a agregar características profiláticas, além das terapêuticas / The disease caused by Pythium insidiosum affects the skin and occasionally other tissues of mammals and birds which live in close contact with contaminated water. Due to its bio-climatic and environmental characteristics, the Pantanal region is estimated to be one of the areas with higher prevalence of pythiosis in the world. However, few studies have focused on epidemiological aspects this region, the main objective of this work. Climatological normals were obtained from two meteorological stations of a public institution which covers the subregion studied. Data from other sources were also used to complement the study. Seventy six cases of pythiosis in equidae and seven in cattle were confirmed by ELISA-test, PCR, histopathology and isolation of Pythium insidiosum. The disease showed seasonal dynamics with peaks of incidence emerging after the wettest pluviometric gradients. Similar diseases, co infections and reinfections were also realized, suggesting a suppression of equine immune system to Pythium insidiosum. It is worth mention that diagnosis tests tools available are not widely adopted in the field. Significant response on immunotherapy (Pitium Vac®) in equine treated group and increased of the intervals the reinfection, indicating that the drug could be improved by adding prophylactic and therapeutical properties

Orientador: Luiz Carlos Marques / Banca: Janio Morais Santurio / Banca: Thais Helena Constantino Patelli / Banca: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Banca: Fabianao Antonio Cadioli / Resumo: Pythium insidiosum causa doença de pele e ocasionalmente de outros tecidos de mamíferos e aves que vivem em estreito contato com águas contaminadas. Pelas características bioclimáticas e ambientais da região do Pantanal, estima-se que seja uma das áreas com maior prevalência do mundo. Não obstante, certifica-se na literatura compilada poucos estudo enfatizando aspectos epidemiológicos nessa região, sendo esse o principal objetivo dessa pesquisa. As normais climatológicas foram obtidas de duas estações metereológicas de Instituição pública, que abrange a sub-região do estudo, complementados por dados dispostos em outras fontes. Obteve-se validação de 76 casos em equideos e sete bovinos, através do ELISA-teste, PCR, histopatologia e isolamento do agente. A doença apresentou dinâmica sazonal, com picos de incidência emergindo após os maiores índices pluviométricos. Evidenciaram-se também, um número expressivo de enfermidades confundíveis, coinfecções e reinfecções, demonstrando frágil imunidade do hospedeiro equino ao patógeno. Cabe ressaltar ainda, que ferramentas de diagnóstico são pouco utilizadas a campo. Resposta significativa relativa à imunoterapia (Pitium Vac®) no grupo de equideos tratados e aumento do intervalo de reinfecções, indica que o fármaco poderá ser aperfeiçoado, de modo a agregar características profiláticas, além das terapêuticas / Abstract: The disease caused by Pythium insidiosum affects the skin and occasionally other tissues of mammals and birds which live in close contact with contaminated water. Due to its bio-climatic and environmental characteristics, the Pantanal region is estimated to be one of the areas with higher prevalence of pythiosis in the world. However, few studies have focused on epidemiological aspects this region, the main objective of this work. Climatological normals were obtained from two meteorological stations of a public institution which covers the subregion studied. Data from other sources were also used to complement the study. Seventy six cases of pythiosis in equidae and seven in cattle were confirmed by ELISA-test, PCR, histopathology and isolation of Pythium insidiosum. The disease showed seasonal dynamics with peaks of incidence emerging after the wettest pluviometric gradients. Similar diseases, co infections and reinfections were also realized, suggesting a suppression of equine immune system to Pythium insidiosum. It is worth mention that diagnosis tests tools available are not widely adopted in the field. Significant response on immunotherapy (Pitium Vac®) in equine treated group and increased of the intervals the reinfection, indicating that the drug could be improved by adding prophylactic and therapeutical properties / Doutor

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica baseada na interação entre uma substância fotossensibilizadora e luz, na presença do oxigênio, para causar morte celular. Sob iluminação de comprimento de onda específico, o fotossensibilizador é excitado e reage com oxigênio celular, dando origem a espécies reativas de oxigênio capazes de promover danos a biomoléculas da célula-alvo. O mesmo processo ocorre para micro-organismos, como bactérias, vírus e fungos. A Pitiose é uma doença causada por um micro-organismo semelhante a fungo denominado Pythium insidiosum. Por não ser um fungo verdadeiro, o agente não apresenta ergosterol em sua membrana plasmática e por isso, não responde à maioria das drogas antifúngicas disponíveis. Procedimentos cirúrgicos extensos, como amputação de membros, são indicados; porém as recidivas são frequentes. Neste trabalho, foi avaliado o efeito da TFD em modelo in vitro, em infecção experimental de pitiose e em pitiose equina. Além disso, foram realizados ensaios de cinética dos fotossensibilizadores utilizados, porfirina, clorinas e azuleno. As taxas de inibição de crescimento in vitro do P. insidiosum foram superiores a 95% para os ensaios com Photodithazine&reg. Photogem&reg apresentou inativação satisfatória e o azul de metileno se mostrou ineficiente para a inativação do patógeno. A cinética comprova os resultados obtidos in vitro, e revelou possível afinidade das clorinas com o oomiceto. Dez minutos após a incubação em solução de Photodithazine&reg e clorina e6 foi possível observar os compostos em estruturas intracelulares específicas. Para maiores tempos de incubação, a distribuição destes compostos se dá por toda a hifa e parede celular. O Photogem&reg mostrou distribuição heterogênea na cultura. Este fato explica o crescimento de algumas hifas após a TFD. O azul de metileno não penetrou na célula microbiana e por isso não foi eficiente na inativação do patógeno. Ao observar a estrutura morfológica da hifa do patógeno após a TFD com diferentes tempos de incubação, ficou evidente que a TFD é mais eficiente para maiores tempos de incubação. Apenas o azul de metileno não inativou o patógeno em nenhum dos parâmetros avaliados. Os estudos em pitiose experimental mostraram que o Photodithazine&reg concentra-se na lesão 4 horas após a administração por via endovenosa, o que não foi observado para o Photogem®. Altas fluências e intensidades luminosas foram necessárias para o tratamento das lesões. Foram avaliados 21 coelhos com aproximadamente 95% de cura. O tratamento de equinos naturalmente infectados mostrou resultados animadores. Foram avaliados quatro cavalos, realizando-se apenas duas sessões de TFD em cada animal e foi possível observar regiões de cicatrização tecidual e recuperação da função motora dos animais. Mais uma vez as clorinas mostraram maior eficiência quando comparadas aos outros fotossensibilizadores. Além disso, observou-se a relação entre os tempos de incubação e resposta tecidual que condizem aos observados no estudo farmacocinético. O protocolo para o tratamento da pitiose, provavelmente basear-se-á em tempos de incubação do composto maiores que 1 hora, altas fluências e intensidades luminosas e clorinas como agente fotossensibilizador. Neste trabalho, a TFD mostrou potencial terapêutico e pode vir a se tornar uma importante ferramenta no tratamento da pitiose. / Photodynamic Therapy (PDT) is a therapy based on the interaction of photosensitizer and light, in the presence of oxygen, to induce cellular death. Under the incidence of light, at an appropriated wavelength, these chemical compounds produce reactive oxygen species which affects the biomolecules of the target-cells. Pythiosis is a lifethreatening emerging disease caused by a fungus-like organism called Pythium insidiosum. Since it is not a true fungus, this microorganism does not present ergosterol in its plasmatic membrane, and so, does not respond satisfactorily to most antifungal drugs. Extensive surgical debridements are required, such as limb amputation, however, reccurence frequently occurs. In this study the PDT effect was investigated in an in vitro model, experimental in vivo infection and naturally occurred equine pythiosis. Besides, pharmacokinetic assays with chlorine, porphyrin and methylene blue were also carried out. It was observed inhibition rates greater than 95% for chlorine, while porphyrin showed satisfactory inhibition and methylene blue was inefficient to inactivate the pathogen. Pharmacokinetics assays corroborate with obtained in vitro results and demonstrated a possible affinity between chlorine and oomicetes. After ten minutes of incubation, for both chlorine and clorin e6 solutions, it was observed that these compounds were concentrated in intracellular specific structures. For longer incubation times the distribution of these compounds was observed along the hyphae and cellular wall. Porphyrin has shown heterogeneous distribution on cell culture. This fact may explain hyphal growth observed after PDT with this photossensitizer. Methylene blue was present only in the cell surface and so, did not inhibit the pathogen. By observing the morphological structure of the pathogen after PDT with different incubation times, it was evident that PDT is more efficient when employing longer incubation times. Only methylene blue did not inactivate the pathogen in none of the evaluated protocols. Concerning experimental infection, it was observed that chlorine concentrates in lesion 4 hours after intravenous administration, while the same was not observed for porphyrin. High light doses and irradiances were necessary for treating the lesions. It was evaluated 21 rabbits with complete response around 95%. The treatment of naturally infected equines showed promising results. Four horses were treated with two PDT sessions. Treated regions of healing and recovery of motor function of the animals were observed. Once again, chlorins showed improved results when compared to the other photosensitizers. Besides, it was observed the relation between incubation time and tissue response correlated to those observed in the kinetics study. The protocol for treating pythiosis, probably will be based on chlorine incubation time greater than 1 hour, high light dose and irradiance, that the results of the present study demonstrate that PDT is a potential treatment option for pythiosis.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-21Bitstream added on 2014-11-10T11:58:49Z : No. of bitstreams: 1 000788565_20150121.pdf: 356283 bytes, checksum: 3276919567e151473e1788abb4db5a09 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-01-23T10:59:21Z: 000788565_20150121.pdf,Bitstream added on 2015-01-23T10:59:53Z : No. of bitstreams: 1 000788565.pdf: 1433793 bytes, checksum: 2b92d3c0d4ec57e0d39cea267d13b5f1 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-05-04T13:08:17Z: 000788565_20180601.pdf, 000788565.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-04T13:09:28Z : No. of bitstreams: 1 000788565_20180601.pdf: 369806 bytes, checksum: 218f3f99e53aa6061d9074553ff60e64 (MD5) Bitstreams deleted on 2018-06-05T12:59:16Z: 000788565_20180601.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2018-06-05T13:00:20Z : No. of bitstreams: 1 000788565.pdf: 1471839 bytes, checksum: a6b86534cf13ddfff7c89c9fe4c59fc3 (MD5) / A pitiose é uma doença causada pelo oomiceto denominado Pythium insidiosum e acomete animais domésticos, silvestres e o homem. O tratamento de escolha é o procedimento cirúrgico, porém, dependendo da localização e extensão da lesão, é inviável e as recidivas são frequentes. Até o momento não há protocolos terapêuticos efetivos contra o agente, pois não há fármacos com eficácia comprovada in vivo. Em virtude da gravidade e da ausência de tratamentos específicos, fazem-se necessárias pesquisas por novos protocolos terapêuticos. Desta forma, avaliaram-se o efeito do extrato da casca de barbatimão, ácido tânico purificado, anfotericina B, DMSO e corticosteróide no tratamento da pitiose experimental em coelhos. Foram utilizados um total de 21 coelhos, divididos em 6 diferentes protocolos terapêuticos e observou-se que não houve diferenças entre as formas de tratamento e o grupo controle. Questiona-se o modelo experimental da pitiose, que é único na literatura. Em condições experimentais as lesões são diferentes das naturalmente adquiridas em cavalos e cães. Este modelo experimental talvez não seja o mais apropriado para a avaliação de novas formas de tratamento / Pythiosis is caused by the oomycete Pythium insidiosum and affects domestic and wild animals and man. Treatment of choice for pythiosis is surgery, however, depending on the size and location of the lesion, it is an unfeasible procedure and relapses are frequently observed. Until this moment, there are no effective protocols for treatment, since there are no drugs with proved effectiveness in vivo. Due to the severity and absence of specific treatment for pythiosis, new researches are necessary to search new compounds that can be used in therapeutic protocols. So, it was evaluated the effect of bark extract of “barbatimão”, purified tannic acid, amphotericin B, DMSO and corticosteroid in the treatment of experimental pythiosis in rabbits. It was evaluated 21 rabbits which were divided into six different therapeutic protocols and it was not observed differences among them and control group. It is questioned the experimental model in rabbits, which is unique in literature. The lesions in this experimental model differ from that of natural condition in horses and dogs. This actual experimental model perhaps could not be suitable for new therapeutic protocols evaluation

Orientador: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Banca: Hélio Langoni / Banca: Lúcia Helena O'Dwyer de Oliveira / Resumo: A pitiose é uma doença causada pelo oomiceto denominado Pythium insidiosum e acomete animais domésticos, silvestres e o homem. O tratamento de escolha é o procedimento cirúrgico, porém, dependendo da localização e extensão da lesão, é inviável e as recidivas são frequentes. Até o momento não há protocolos terapêuticos efetivos contra o agente, pois não há fármacos com eficácia comprovada in vivo. Em virtude da gravidade e da ausência de tratamentos específicos, fazem-se necessárias pesquisas por novos protocolos terapêuticos. Desta forma, avaliaram-se o efeito do extrato da casca de barbatimão, ácido tânico purificado, anfotericina B, DMSO e corticosteróide no tratamento da pitiose experimental em coelhos. Foram utilizados um total de 21 coelhos, divididos em 6 diferentes protocolos terapêuticos e observou-se que não houve diferenças entre as formas de tratamento e o grupo controle. Questiona-se o modelo experimental da pitiose, que é único na literatura. Em condições experimentais as lesões são diferentes das naturalmente adquiridas em cavalos e cães. Este modelo experimental talvez não seja o mais apropriado para a avaliação de novas formas de tratamento / Abstract: Pythiosis is caused by the oomycete Pythium insidiosum and affects domestic and wild animals and man. Treatment of choice for pythiosis is surgery, however, depending on the size and location of the lesion, it is an unfeasible procedure and relapses are frequently observed. Until this moment, there are no effective protocols for treatment, since there are no drugs with proved effectiveness in vivo. Due to the severity and absence of specific treatment for pythiosis, new researches are necessary to search new compounds that can be used in therapeutic protocols. So, it was evaluated the effect of bark extract of "barbatimão", purified tannic acid, amphotericin B, DMSO and corticosteroid in the treatment of experimental pythiosis in rabbits. It was evaluated 21 rabbits which were divided into six different therapeutic protocols and it was not observed differences among them and control group. It is questioned the experimental model in rabbits, which is unique in literature. The lesions in this experimental model differ from that of natural condition in horses and dogs. This actual experimental model perhaps could not be suitable for new therapeutic protocols evaluation / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-31Bitstream added on 2014-06-13T20:41:27Z : No. of bitstreams: 1 doria_rgs_dr_jabo.pdf: 805921 bytes, checksum: 7baf913cbb38741225210e93ed796dd6 (MD5) / Avaliaram-se os efeitos da perfusão regional intravenosa com anfotericina B, um antimicótico, em membros de equinos acometidos por pitiose, combinada com a excisão cirúrgica. Foram utilizados 16 equinos, jovens e adultos, da raça pantaneira, com pitiose em membro torácico ou pélvico, distalmente às articulações do cotovelo ou joelho, distribuídos em dois grupos experimentais. Um constituído de 12 equinos tratados, após excisão cirúrgica e termocauterização, por perfusão regional intravenosa do membro com anfotericina B (Ganf) e outro constituído de quatro equinos não tratados (controle, Gc). As feridas foram fotografadas e avaliadas antes do início do tratamento (D0) e após sete (D7), catorze (D14), vinte e um (D21), vinte e oito (D28), trinta e cinco (D35) e sessenta (D60) dias e foi realizado exame do aparelho locomotor. No Ganf, 92% dos animais apresentaram cicatrização das feridas de pitiose e no Gc 100% apresentaram recrudescência da afecção. No Ganf, 58% exigiram administração única de anfotericina B pela técnica de perfusão regional do membro e 42% exigiram uma readministração, após 14 dias. No Ganf, 33% apresentaram ulceração no local da administração da anfotericina B e 42% apresentaram aumento de volume do membro e dor à palpação na região perfundida pela anfotericina B. No Ganf, 100% dos animais apresentavam claudicação severa no D0 e 92% não apresentavam claudicação no D21. Conclui-se que a administração de anfotericina B, por perfusão regional intravenosa, promove a cura da pitiose, com mínimas reações adversas, sendo uma alternativa terapêutica para o tratamento de pitiose em membros de equinos. / The effects of intravenous regional perfusion with amphotericin B, an antifungal drug, in equine limbs with pythiosis associated with surgical excision were evaluated. 16 horses, young and adults, pantaneira breed, with pythiosis in thoracic or pelvic limbs, distally to the elbow or knee joints, were allocated into two experimental groups. One constituted by 12 horses treated, after surgical excision and thermocauterization, by intravenous regional limb perfusion with amphotericin B (Ganf) and other constituted by four not treated horses (control, Gc). The wounds were photographed and evaluated before the beginning of the treatment (D0) and after seven (D7), fourteen (D14), twenty-one (D21), twenty-eight (D28), thirty-five (D35) and sixty (D60) days and examination of the locomotor system was performed. 92% of the animals with pythiosis presented wound healing in Ganf and, in Gc, 100% presented recrudescence of the disease. In the Ganf, 58% of the animals needed single administration of amphotericin B by regional limb perfusion and 42% of the animals needed one more administration after 14 days. In the Ganf, 33% of the animals presented ulceration in the amphotericin B injection site and 42% of the animals presented limb edema and pain during palpation of the amphotericin B perfused region. In Ganf, 100% of the animals presented severe lameness at D0 and 92% of the animals presented no lameness at D21. It can be concluded that the administration of amphotericin B by intravenous regional perfusion promotes pythiosis remission with minimal side effects, being a therapeutic alternative to the pythiosis treatment in equine limbs.

Pythiosis is a granulomatous, life-threatening disease of humans and animals, which is caused by the oomycete Pythium insidiosum. The treatment of the infections caused by this pathogen is complicated because of its cell wall and cytoplasmic membrane characteristics. Therefore, immunotherapy obtained from P. insidiosum culture extracts has emerged as an alternative treatment for equine pythiosis. Notwithstanding, the mechanisms by which immunotherapy work are not yet fully understood. The aims of this study were: a) to evaluate the immunological parameters in immunotherapy by measuring interleukin-2 (IL-2) and interferon-γ (IFN-γ) levels; b) to evaluate the biochemical parameters (hepatic function) in the horses of the experiment. To address this issue, 10 horses were divided in two groups: control (n=5), composed of animals without pythiosis; and infected (n=5), composed of animals with the disease. Animals from both groups received four doses of the immunotherapeutic product PitiumVac®. A significant increase in IL-2 and IFN- γ levels was observed after 42 days of immunotherapy in the infected group, and the animals were considered cured. The immunotherapy also improved the hepatic function of the animals, decreasing alanine aminotransferase and alkaline phosphatase levels. This may be a result of the interaction of different immunotherapeutic antigen present in the immune system, causing an increase in the production of these cytokines and establishing a predominance of TH1. / A pitiose é uma doença infecciosa, com risco de morte, que acomete animais e humanos, caracterizada por lesões granulomatosas, tendo como agente etiológico o oomiceto Pythium insidiosum. O tratamento de infecções causadas por P. insidiosum em animais e humanos é complicado pelas características do agente, sobretudo a composição de sua parede celular e membrana plasmática. A imunoterapia surgiu como uma alternativa para o tratamento da pitiose equina, com a produção de imunoterápico a partir de culturas do próprio agente. Apesar dos estudos sobre a doença e a imunoterapia, ainda não há um completo conhecimento dos mecanismos envolvidos. . Os objetivos deste trabalho foram: a) analisar os parâmetros imunológicos envolvidos na resposta frente à imunoterapia por meio da quantificação da interleucina 2 (IL2) e interferon gama (IFN-γ); b) analisar os parâmetros bioquímicos (função hepática) dos equinos envolvidos no experimento. Para tal foram utilizados 10 equinos, divididos em 2 grupos: controle n=5( animais hígidos sem a doença) e infectado n=5( com pitiose clínica). Todos os 10 animais dos 2 grupos receberam 4 doses do imunoterápico PitiumVac a cada 14 dias. Os parâmetros imunológico dos animais demostraram uma diferença estatística significativa no grupo infectado após o tratamento com o imunoterápico PitiumVac®. Após 42 dias de imunoterapia foi observado um aumentando de forma significativa os níveis séricos de IL-2 e IFN-γ no grupo dos animais infectados, culminando com a cura clínica destes animais. Após a imunoterapia foi constatada uma melhora na função hepática, com a diminuição da alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (FA). Este resultado pode ser decorrente da interação distinta do antígeno presente no imunoterápico com o sistema imunológico, provocando o aumento na produção destas citocinas e estabelecendo um predomínio de resposta TH1.

Orientador: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Resumo: A pitiose, cujo agente etiológico é o oomiceto Pythium insidiosum, é umadoença que acomete diversas espécies animais, incluindo-se a humana, sendomais prevalente em equinos. A doença é de difícil diagnóstico e tratamento.Estudos sobre a caracterização proteica de P. insidiosum são escassos. Oobjetivo deste estudo foi determinar o perfil proteico de Pythium insidiosum pormeio da estratégia espectrometria de massas e bioinformática, a fim deidentificar fatores de virulência. Para isso, foi padronizada uma técnica deextração de proteínas totais de P. insidiosum, as quais foram quantificadas. Apartir do protocolo de extração de proteínas foi obtido o perfil das proteínasexpressas pelo oomiceto P. insidiosum por meio da análise por eletroforesebidimensional. Os géis analisados apresentaram 186 spots com massamolecular de 12 a 89 KDa, e ponto isoelétrico entre 4-7, destes 103 foramrecortados e sequenciados. Um total de 36 proteínas foram identificadas eagrupadas de acordo com suas funções, seis delas foram classificadas comoproteínas relacionadas à virulência - β 1,3 glucano sintetase, Hsp 70, enolase,peroxirredoxina 2, proteína G e proteassoma unidade β. Os resultados dopresente trabalho contribuirão para o melhor entendimento dos mecanismospatogênicos de P. insidiosum, bem como para novos estudos no campoterapêutico e diagnóstico. / Abstract: Pythiosis, whose etiologic agent is the oomycete Pythium insidiosum, is a disease that affects several animal species, including human, being more prevalent in horses. The disease has difficult diagnosis and treatment. Studies on protein characterization of P. insidiosum are scarce. The objective of this study was to determine the protein profile of Pythium insidiosum by mass spectrometry and bioinformatics strategies aiming to identify virulence factors. To this end, an extraction was standardized technique of total proteins of P. insidiosum, which were quantitated. From the protein extraction protocol it was obtained the profile of proteins expressed by the oomycete P. insidiosum through analysis by two-dimensional electrophoresis. The gels had 186 spots analyzed with molecular weight 12-89 kDa and an isoelectric point of 4-7, 103 of these were cut and sequenced. A total of 36 proteins were identified and grouped according to their functions, six of them were classified as proteins related to virulence - β 1,3 glucan synthase, Hsp 70, enolase, peroxiredoxin 2, G protein and the proteasome β unit. The results of this work will contribute to better understanding of the pathogenic mechanisms of P. insidiosum as well as for further studies in the therapeutic field and diagnosis. / Mestre

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica baseada na interação entre uma substância fotossensibilizadora e luz, na presença do oxigênio, para causar morte celular. Sob iluminação de comprimento de onda específico, o fotossensibilizador é excitado e reage com oxigênio celular, dando origem a espécies reativas de oxigênio capazes de promover danos a biomoléculas da célula-alvo. O mesmo processo ocorre para micro-organismos, como bactérias, vírus e fungos. A Pitiose é uma doença causada por um micro-organismo semelhante a fungo denominado Pythium insidiosum. Por não ser um fungo verdadeiro, o agente não apresenta ergosterol em sua membrana plasmática e por isso, não responde à maioria das drogas antifúngicas disponíveis. Procedimentos cirúrgicos extensos, como amputação de membros, são indicados; porém as recidivas são frequentes. Neste trabalho, foi avaliado o efeito da TFD em modelo in vitro, em infecção experimental de pitiose e em pitiose equina. Além disso, foram realizados ensaios de cinética dos fotossensibilizadores utilizados, porfirina, clorinas e azuleno. As taxas de inibição de crescimento in vitro do P. insidiosum foram superiores a 95% para os ensaios com Photodithazine&reg. Photogem&reg apresentou inativação satisfatória e o azul de metileno se mostrou ineficiente para a inativação do patógeno. A cinética comprova os resultados obtidos in vitro, e revelou possível afinidade das clorinas com o oomiceto. Dez minutos após a incubação em solução de Photodithazine&reg e clorina e6 foi possível observar os compostos em estruturas intracelulares específicas. Para maiores tempos de incubação, a distribuição destes compostos se dá por toda a hifa e parede celular. O Photogem&reg mostrou distribuição heterogênea na cultura. Este fato explica o crescimento de algumas hifas após a TFD. O azul de metileno não penetrou na célula microbiana e por isso não foi eficiente na inativação do patógeno. Ao observar a estrutura morfológica da hifa do patógeno após a TFD com diferentes tempos de incubação, ficou evidente que a TFD é mais eficiente para maiores tempos de incubação. Apenas o azul de metileno não inativou o patógeno em nenhum dos parâmetros avaliados. Os estudos em pitiose experimental mostraram que o Photodithazine&reg concentra-se na lesão 4 horas após a administração por via endovenosa, o que não foi observado para o Photogem®. Altas fluências e intensidades luminosas foram necessárias para o tratamento das lesões. Foram avaliados 21 coelhos com aproximadamente 95% de cura. O tratamento de equinos naturalmente infectados mostrou resultados animadores. Foram avaliados quatro cavalos, realizando-se apenas duas sessões de TFD em cada animal e foi possível observar regiões de cicatrização tecidual e recuperação da função motora dos animais. Mais uma vez as clorinas mostraram maior eficiência quando comparadas aos outros fotossensibilizadores. Além disso, observou-se a relação entre os tempos de incubação e resposta tecidual que condizem aos observados no estudo farmacocinético. O protocolo para o tratamento da pitiose, provavelmente basear-se-á em tempos de incubação do composto maiores que 1 hora, altas fluências e intensidades luminosas e clorinas como agente fotossensibilizador. Neste trabalho, a TFD mostrou potencial terapêutico e pode vir a se tornar uma importante ferramenta no tratamento da pitiose. / Photodynamic Therapy (PDT) is a therapy based on the interaction of photosensitizer and light, in the presence of oxygen, to induce cellular death. Under the incidence of light, at an appropriated wavelength, these chemical compounds produce reactive oxygen species which affects the biomolecules of the target-cells. Pythiosis is a lifethreatening emerging disease caused by a fungus-like organism called Pythium insidiosum. Since it is not a true fungus, this microorganism does not present ergosterol in its plasmatic membrane, and so, does not respond satisfactorily to most antifungal drugs. Extensive surgical debridements are required, such as limb amputation, however, reccurence frequently occurs. In this study the PDT effect was investigated in an in vitro model, experimental in vivo infection and naturally occurred equine pythiosis. Besides, pharmacokinetic assays with chlorine, porphyrin and methylene blue were also carried out. It was observed inhibition rates greater than 95% for chlorine, while porphyrin showed satisfactory inhibition and methylene blue was inefficient to inactivate the pathogen. Pharmacokinetics assays corroborate with obtained in vitro results and demonstrated a possible affinity between chlorine and oomicetes. After ten minutes of incubation, for both chlorine and clorin e6 solutions, it was observed that these compounds were concentrated in intracellular specific structures. For longer incubation times the distribution of these compounds was observed along the hyphae and cellular wall. Porphyrin has shown heterogeneous distribution on cell culture. This fact may explain hyphal growth observed after PDT with this photossensitizer. Methylene blue was present only in the cell surface and so, did not inhibit the pathogen. By observing the morphological structure of the pathogen after PDT with different incubation times, it was evident that PDT is more efficient when employing longer incubation times. Only methylene blue did not inactivate the pathogen in none of the evaluated protocols. Concerning experimental infection, it was observed that chlorine concentrates in lesion 4 hours after intravenous administration, while the same was not observed for porphyrin. High light doses and irradiances were necessary for treating the lesions. It was evaluated 21 rabbits with complete response around 95%. The treatment of naturally infected equines showed promising results. Four horses were treated with two PDT sessions. Treated regions of healing and recovery of motor function of the animals were observed. Once again, chlorins showed improved results when compared to the other photosensitizers. Besides, it was observed the relation between incubation time and tissue response correlated to those observed in the kinetics study. The protocol for treating pythiosis, probably will be based on chlorine incubation time greater than 1 hour, high light dose and irradiance, that the results of the present study demonstrate that PDT is a potential treatment option for pythiosis.

Orientador: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Resumo: A pitiose, cujo agente etiológico é o oomiceto Pythium insidiosum, é uma doença emergente que ocorre principalmente em países tropicais e subtropicais, afetando diversas espécies animais, sendo mais frequente em cavalos no Brasil e humanos na Tailândia. A doença é difícil de diagnosticar, porque as hifas do patógeno são frequentemente confundidas com mucormicoses ou entomoftoromicoses em cortes histológicos. Além disso, não há antígeno eficiente e específico que possa ser utilizado para o diagnóstico rápido e o tratamento eficiente da pitiose em diferentes espécies. Os antígenos são moléculas que o sistema imunológico reconhece, tornando essas moléculas importantes alvos para o diagnóstico de micro-organismos. Para a identificação de antígenos, a imunoproteômica é considerada uma ferramenta poderosa. Nesse sentido, investigamos quais antígenos de P. insidiosum são reconhecidos pelo soro de equinos no Brasil e por soro de pacientes tailandeses com pitiose, a fim de encontrar proteínas semelhantes que possam ser utilizadas para futuros testes de diagnóstico ou terapia para pitiose. Para identificar as proteínas imunorreativas de P. insidiosum, foram utilizadas abordagens imunoproteômicas, técnica de Western blot, seguida pela identificação de antígenos por espectrometria de massas. Consequentemente, foi possível identificar 23 antígenos reconhecidos entre os soros de equinos e humanos. Sete antígenos foram correspondentes aos soros em ambas espécies: heat shock cognate 70 KDa p... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Pythiosis, whose etiological agent is the oomycete Pythium insidiosum, is an lifethreatening disease that occurs mainly in tropical and subtropical countries, affecting several animal species, being more frequent in horses in Brazil and humans in Thailand. The disease is difficult to diagnose, because the pathogen's hyphae are often confused with Mucorales or Entomophthorales fungi in histological sections. In addition, there is no efficient and specific antigen that can be used for the rapid diagnosis and efficient treatment of pythiosis in different species. Antigens are molecules that the immune system recognizes, making these molecules important targets for the diagnosis of microorganisms. For the identification of antigens, immunoproteomics is considered a powerful tool. In this sense, we investigated which P. insidiosum antigens are recognized by horses in Brazil and Thai humans’ serum with pythiosis, in order to find similar proteins that could be used for future diagnostic tests or therapy approaches for pythiosis. To identify the immunoreactive proteins of P. insidiosum, immunoproteomic approaches were used, using the Western blot technique followed by the identification of antigens by mass spectrometry. Consequently, it was possible to identify 23 antigens recognized between the serum of horses and humans. Seven antigens were similar to the two types of serum, being heat shock cognate 70 KDa protein, heat shock 70 KDa protein, glucan 1,3-beta-glucosidase, fructosebi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor