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Modulação do trofoblasto bovino na gestação de embriões clonados / Modulation of bovine trophoblast in cloned pregnancyBarreto, Rodrigo da Silva Nunes 24 August 2015 (has links)
O sucesso da gestação, e nascimento da prole saudável, depende da adequada formação, desenvolvimento e funcionamento da placenta. Entretanto, são observadas altas perdas durante o primeiro terço da gestação de embriões bovinos produzidos por transferência de núcleo de célula somática (TNCS), principalmente causadas por alterações placentárias, decorrentes da incompleta reprogramação epigenética no desenvolvimento embrionário. Normalmente, após a fecundação, o DNA paterno é desmetilado durante as primeiras horas do desenvolvimento, enquanto o DNA materno é desmetilado de forma passiva. Entretanto nos embriões TNCS a desmetilação do DNA é tardia e incompleta, resultando numa alteração do padrão epigenético, principalmente nos níveis de metilação (5mC) e hidroximetilação (5hmC) do DNA e nas histonas. Além disso, na gestação TNCS há expressão precoce das moléculas do complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC-I), associada ao aumento de infiltrados inflamatórios na placenta e à rejeição imunológica ao feto. O objetivo desse trabalho foi de verificar, na placenta bovina TNCS e controle, os níveis globais de 5mC e 5hmC, e de algumas modificações de histonas importantes na formação do trofectoderma ou por serem modificações clássicas, além de imunolocalizar moléculas de MHC-I. Para tanto foram utilizadas amostras de placentônio TNCS no primeiro (n = 5) e terceiro (n = 6) terço gestacional; e como controle, placentônios com controle no primeiro (n = 6) e terceiro (n = 6). Foram realizadas reações de imunohistoquímica para modificações no DNA (5mC, 5hmC) e nas histonas (H3K4me3, H3K27me3, H3K9ac, H3K9me2/3) e para MHC-I (Qa-2 e IL-A88); além de reações de PCR quantitativo para enzimas responsáveis pelas modificações no DNA (DNMT1, TET1, TET3), para alguns genes relacionados com o desenvolvimento da placenta (PAG9, PHDLA2, SNRPN e TSSC4) e para isoformas de MHC-I (NC1-4 e JSP-1). Houve aumento dos níveis globais de metilação, e diminuição de hidroximetilação, na placenta TNCS durante o primeiro trimestre gestacional. Os níveis de H3K4me3 foram estáveis na placenta controle e crescentes na placenta TNCS, enquanto que a H3K27me3 decresceu na placenta controle e foi estável na placenta TNCS. Na placenta TNCS, aos 60 dias, foram observados os menores níveis globais H3K9ac, porém H3K9me2/3 não diferiram entre as idades e tipos gestacionais estudados. Foi identificado MHC-I no trofoblasto do placentônio bovino nas idades analisadas, com variações de intensidade dependendo da isoforma detectada, além de que a placenta controle e a TNCS apresentam padrões diferentes na expressão de MHC-I. De modo geral, o menores níveis de metilação do DNA encontrados na placenta TNCS aos 60 dias de gestação, indica ser um mecanismo compensatório para ativar a expressão gênica. Visto que a as modificações de histona levam a um estado repressivo da expressão gênica, já que a bivalência entre H3K4me3 e H3K27me3 e os níveis de H3K9ac estão diminuídos. Ainda na placenta TNCS aos 60 dias, há uma alta expressão de MHC-I, levando a resposta imune do sistema materno contra os tecidos fetais. Portanto vários eventos são presentes e parecem contribuir para instabilidade da gestação inicial em clones, coincidindo com a alta taxa de perdas gestacionais nessa fase / Pregnancy success depends of adequate placental formation, development and function. Therefore, the highest loses rates are found during first trimester pregnancies of bovine embryos produced by somatic cell nuclear transfer (NT), majorly by placental alterations, due to incomplete epigenetic reprogramming during embrionary development. Normally, after fecundation, paternal DNA is actively demethylated at first hours of development; where as maternal DNA is passively demethylated. However in NT embryos the DNA demethylation is late and incomplete, resulting in changes of epigenetic patterns, majorly in methylation (5mC), hydroxymethylation (5hmC) and histone levels. Furthermore, in NT pregnancy there is premature expression of class I major histocompatibility complex (MHC-I), associated with inflammatory infiltrates increases and immunological rejection against fetus. The aim of this work was to evaluate global levels of 5mC, 5hmC and some posttranslational histone modifications and MHC-I molecules expression of bovine placenta in NT and control models. For this, NT and control bovine placentome were collected at first (n = 6) and third (n = 6) trimester of pregnancy. Immunohistochemistry reactions were performed to assay DNA methylation (5mC) and (5hmC) and posttranslational histone modifications (H3K4me3, H3K27me3, H3K9ac, H3K9me2/3) and MHC-I molecules (Qa-2 e IL-A88). Quantitative PCR reactions were performed to evaluate the expression of DNA modifications related enzymes (DNMT1, TET1 and TET2), MHC-I classical (JSP-1) and non-classical (NC1-4) isoforms, and imprinted genes expression (SNRPN, TSSC4 and PHDLA2). In the NT placenta there was an increase in the global methylation and decreased hydromethylation level at first trimester. Levels of H3K4me3 were constant at control placenta while increased in NT placenta. For H3K27me3, the levels decreased in control placenta and were stable at NT counterparts. At 60 days of pregnancy in NT placenta, were observed low levels of global H3K9ac, but no differences of H3K9me2/3 levels were found between pregnancy ages or type. We identified MHC-I at bovine placentomal trophoblast in all ages analyzed, with intensity variation of different isoforms. In general, low levels of DNA methylation at day 60 of pregnancy of TNCS placenta, indicates a compensatory mechanism to active genic expression. Since histone modifications, in this period, leads to repressive status, because bivalence of H3K4me3 and H3K27me3 and levels of H3K9ac were diminished. Also at day 60 of pregnancy of TNCS placenta, MHC-I is highly expressed and leads to maternal immune response against fetus tissue. In conclusion, several events are present and apparently contribute to early clone pregnancy instability, coinciding with high pregnancy losses in that phase
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Modulação do trofoblasto bovino na gestação de embriões clonados / Modulation of bovine trophoblast in cloned pregnancyRodrigo da Silva Nunes Barreto 24 August 2015 (has links)
O sucesso da gestação, e nascimento da prole saudável, depende da adequada formação, desenvolvimento e funcionamento da placenta. Entretanto, são observadas altas perdas durante o primeiro terço da gestação de embriões bovinos produzidos por transferência de núcleo de célula somática (TNCS), principalmente causadas por alterações placentárias, decorrentes da incompleta reprogramação epigenética no desenvolvimento embrionário. Normalmente, após a fecundação, o DNA paterno é desmetilado durante as primeiras horas do desenvolvimento, enquanto o DNA materno é desmetilado de forma passiva. Entretanto nos embriões TNCS a desmetilação do DNA é tardia e incompleta, resultando numa alteração do padrão epigenético, principalmente nos níveis de metilação (5mC) e hidroximetilação (5hmC) do DNA e nas histonas. Além disso, na gestação TNCS há expressão precoce das moléculas do complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC-I), associada ao aumento de infiltrados inflamatórios na placenta e à rejeição imunológica ao feto. O objetivo desse trabalho foi de verificar, na placenta bovina TNCS e controle, os níveis globais de 5mC e 5hmC, e de algumas modificações de histonas importantes na formação do trofectoderma ou por serem modificações clássicas, além de imunolocalizar moléculas de MHC-I. Para tanto foram utilizadas amostras de placentônio TNCS no primeiro (n = 5) e terceiro (n = 6) terço gestacional; e como controle, placentônios com controle no primeiro (n = 6) e terceiro (n = 6). Foram realizadas reações de imunohistoquímica para modificações no DNA (5mC, 5hmC) e nas histonas (H3K4me3, H3K27me3, H3K9ac, H3K9me2/3) e para MHC-I (Qa-2 e IL-A88); além de reações de PCR quantitativo para enzimas responsáveis pelas modificações no DNA (DNMT1, TET1, TET3), para alguns genes relacionados com o desenvolvimento da placenta (PAG9, PHDLA2, SNRPN e TSSC4) e para isoformas de MHC-I (NC1-4 e JSP-1). Houve aumento dos níveis globais de metilação, e diminuição de hidroximetilação, na placenta TNCS durante o primeiro trimestre gestacional. Os níveis de H3K4me3 foram estáveis na placenta controle e crescentes na placenta TNCS, enquanto que a H3K27me3 decresceu na placenta controle e foi estável na placenta TNCS. Na placenta TNCS, aos 60 dias, foram observados os menores níveis globais H3K9ac, porém H3K9me2/3 não diferiram entre as idades e tipos gestacionais estudados. Foi identificado MHC-I no trofoblasto do placentônio bovino nas idades analisadas, com variações de intensidade dependendo da isoforma detectada, além de que a placenta controle e a TNCS apresentam padrões diferentes na expressão de MHC-I. De modo geral, o menores níveis de metilação do DNA encontrados na placenta TNCS aos 60 dias de gestação, indica ser um mecanismo compensatório para ativar a expressão gênica. Visto que a as modificações de histona levam a um estado repressivo da expressão gênica, já que a bivalência entre H3K4me3 e H3K27me3 e os níveis de H3K9ac estão diminuídos. Ainda na placenta TNCS aos 60 dias, há uma alta expressão de MHC-I, levando a resposta imune do sistema materno contra os tecidos fetais. Portanto vários eventos são presentes e parecem contribuir para instabilidade da gestação inicial em clones, coincidindo com a alta taxa de perdas gestacionais nessa fase / Pregnancy success depends of adequate placental formation, development and function. Therefore, the highest loses rates are found during first trimester pregnancies of bovine embryos produced by somatic cell nuclear transfer (NT), majorly by placental alterations, due to incomplete epigenetic reprogramming during embrionary development. Normally, after fecundation, paternal DNA is actively demethylated at first hours of development; where as maternal DNA is passively demethylated. However in NT embryos the DNA demethylation is late and incomplete, resulting in changes of epigenetic patterns, majorly in methylation (5mC), hydroxymethylation (5hmC) and histone levels. Furthermore, in NT pregnancy there is premature expression of class I major histocompatibility complex (MHC-I), associated with inflammatory infiltrates increases and immunological rejection against fetus. The aim of this work was to evaluate global levels of 5mC, 5hmC and some posttranslational histone modifications and MHC-I molecules expression of bovine placenta in NT and control models. For this, NT and control bovine placentome were collected at first (n = 6) and third (n = 6) trimester of pregnancy. Immunohistochemistry reactions were performed to assay DNA methylation (5mC) and (5hmC) and posttranslational histone modifications (H3K4me3, H3K27me3, H3K9ac, H3K9me2/3) and MHC-I molecules (Qa-2 e IL-A88). Quantitative PCR reactions were performed to evaluate the expression of DNA modifications related enzymes (DNMT1, TET1 and TET2), MHC-I classical (JSP-1) and non-classical (NC1-4) isoforms, and imprinted genes expression (SNRPN, TSSC4 and PHDLA2). In the NT placenta there was an increase in the global methylation and decreased hydromethylation level at first trimester. Levels of H3K4me3 were constant at control placenta while increased in NT placenta. For H3K27me3, the levels decreased in control placenta and were stable at NT counterparts. At 60 days of pregnancy in NT placenta, were observed low levels of global H3K9ac, but no differences of H3K9me2/3 levels were found between pregnancy ages or type. We identified MHC-I at bovine placentomal trophoblast in all ages analyzed, with intensity variation of different isoforms. In general, low levels of DNA methylation at day 60 of pregnancy of TNCS placenta, indicates a compensatory mechanism to active genic expression. Since histone modifications, in this period, leads to repressive status, because bivalence of H3K4me3 and H3K27me3 and levels of H3K9ac were diminished. Also at day 60 of pregnancy of TNCS placenta, MHC-I is highly expressed and leads to maternal immune response against fetus tissue. In conclusion, several events are present and apparently contribute to early clone pregnancy instability, coinciding with high pregnancy losses in that phase
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Efeito de hormônios e citocinas na expressão da Indoleamina 2,3-dioxigenase e na capacidade proliferativa de células de placenta bovina / Effects of hormones and citokynes in the indoleamine 2,3-dioxygenase expression and the proliferative capacity of cells from bovine placentaLima, Ana Rita de 28 September 2009 (has links)
A Indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) é uma enzima que apresenta um importante papel na prevenção da rejeição fetal. A IDO demonstra efeitos na supressão da ativação de células T por catabolizar o aminoácido essencial Triptofano. Nós estudamos a expressão da IDO em cultura celulares de placenta com a adição individual de Estradiol, Progesterona, Interferon , Triptofano e 1-Metil-Triptofano com o uso de citometria de fluxo, imunocitoquímica e quantificação celular, imunofluorescência, peroxidação lipídica, análise das fases do ciclo celular, imunoblotting e PCR em placentas bovinas nos três trimestres gestacionais. A quantificação celular revelou que em bovinos a atividade da IDO aumenta com o avanço do período gestacional e, sua expressão varia de acordo com os fatores, sendo o mesmo padrão observado pela imunofluorescência. O Imunoblotting mostrou a presença de possíveis isoformas desta proteína na espécie bovina que ainda não foram identificadas. A investigação pela lipoperoxidação revelou que os hormônios modularam diferencialmente a produção de radicais peroxidados nos três terços de gestação e, possivelmente atuam como fatores indutores de proliferação. As células placentárias apresentaram padrões diferenciados de proliferação e apoptose ao longo da gestação, principalmente nos tratamentos com Estradiol e Progesterona, sendo também variantes com outros fatores em todos os grupos. Observou-se que a Progesterona atua na maturação das células placentárias independente da concentração utilizada. Em todos os grupos uma grande proporção de células apresentava-se em estado de quiescência (G1). No terceiro trimestre foi detectado um aumento no número de células em G2/M, indicando a parada da capacidade proliferativa ou de progressão no ciclo celular (\"arrest\"). Maior taxa de apoptose foi observada nos animais de segundo trimestre gestacional. Baseados nisso, podemos concluir que a IDO é suscetível ao controle pelos mecanismos testados, o que nos leva a formular hipóteses de implantação de possíveis mecanismos terapêuticos para a reprodução com a participação da IDO. / Indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) is an enzyme that plays an important role in preventing fetal rejection. IDO is related to the suppression of the T-cells activation due to the catabolism of essential amino acid Triptophan. We studied the expression of IDO in bovine placenta cell culture with individual supplementation of factors as Estrogen, Progesterone, Interferon , Triptophan and 1-Methyl-Triptophan. Evaluations were made by flow cytometry, immunocitochemistry and cellular quantification, lipidic peroxidation, cell cycle phases, imunoblotting, PCR and immunofluorescency in the three trimesters of pregnancy. Cellular quantification demonstrated that in bovines the activity of the IDO increases during pregnancy, and its expression is factor-dependent, which was also observed in immunofluorescency. Imunoblotting demonstrated the presence of possible unknown protein isoforms in bovine. Lipoperoxidation evaluation demonstrated that hormones distinguishingly modulated the production of peroxide radicals in the three trimesters of pregnancy and, possibly acting as inductive factors of proliferation. Placental cells demonstrated differentiated patterns of proliferation and apoptosis during the gestation, mainly in the presence of Estrogen and Progesterone, besides variant rates were also observed under other factors. Independent of the concentration, Progesterone influenced placental cells maturation. All groups presented great ratio of cells in quiescence state (G1). In third trimester, G2/M high rates indicated a pause in proliferative capacity or in cell cycle progression (arrest). High apoptosis rates were observed in animals at second pregnancy trimester. Based on the presented, we concluded that IDO is susceptible to be controlled by the applied-factors, what lead us to think about hypothetical therapeuthic mechnism for reproduction with the participation of IDO.
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Efeito de hormônios e citocinas na expressão da Indoleamina 2,3-dioxigenase e na capacidade proliferativa de células de placenta bovina / Effects of hormones and citokynes in the indoleamine 2,3-dioxygenase expression and the proliferative capacity of cells from bovine placentaAna Rita de Lima 28 September 2009 (has links)
A Indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) é uma enzima que apresenta um importante papel na prevenção da rejeição fetal. A IDO demonstra efeitos na supressão da ativação de células T por catabolizar o aminoácido essencial Triptofano. Nós estudamos a expressão da IDO em cultura celulares de placenta com a adição individual de Estradiol, Progesterona, Interferon , Triptofano e 1-Metil-Triptofano com o uso de citometria de fluxo, imunocitoquímica e quantificação celular, imunofluorescência, peroxidação lipídica, análise das fases do ciclo celular, imunoblotting e PCR em placentas bovinas nos três trimestres gestacionais. A quantificação celular revelou que em bovinos a atividade da IDO aumenta com o avanço do período gestacional e, sua expressão varia de acordo com os fatores, sendo o mesmo padrão observado pela imunofluorescência. O Imunoblotting mostrou a presença de possíveis isoformas desta proteína na espécie bovina que ainda não foram identificadas. A investigação pela lipoperoxidação revelou que os hormônios modularam diferencialmente a produção de radicais peroxidados nos três terços de gestação e, possivelmente atuam como fatores indutores de proliferação. As células placentárias apresentaram padrões diferenciados de proliferação e apoptose ao longo da gestação, principalmente nos tratamentos com Estradiol e Progesterona, sendo também variantes com outros fatores em todos os grupos. Observou-se que a Progesterona atua na maturação das células placentárias independente da concentração utilizada. Em todos os grupos uma grande proporção de células apresentava-se em estado de quiescência (G1). No terceiro trimestre foi detectado um aumento no número de células em G2/M, indicando a parada da capacidade proliferativa ou de progressão no ciclo celular (\"arrest\"). Maior taxa de apoptose foi observada nos animais de segundo trimestre gestacional. Baseados nisso, podemos concluir que a IDO é suscetível ao controle pelos mecanismos testados, o que nos leva a formular hipóteses de implantação de possíveis mecanismos terapêuticos para a reprodução com a participação da IDO. / Indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) is an enzyme that plays an important role in preventing fetal rejection. IDO is related to the suppression of the T-cells activation due to the catabolism of essential amino acid Triptophan. We studied the expression of IDO in bovine placenta cell culture with individual supplementation of factors as Estrogen, Progesterone, Interferon , Triptophan and 1-Methyl-Triptophan. Evaluations were made by flow cytometry, immunocitochemistry and cellular quantification, lipidic peroxidation, cell cycle phases, imunoblotting, PCR and immunofluorescency in the three trimesters of pregnancy. Cellular quantification demonstrated that in bovines the activity of the IDO increases during pregnancy, and its expression is factor-dependent, which was also observed in immunofluorescency. Imunoblotting demonstrated the presence of possible unknown protein isoforms in bovine. Lipoperoxidation evaluation demonstrated that hormones distinguishingly modulated the production of peroxide radicals in the three trimesters of pregnancy and, possibly acting as inductive factors of proliferation. Placental cells demonstrated differentiated patterns of proliferation and apoptosis during the gestation, mainly in the presence of Estrogen and Progesterone, besides variant rates were also observed under other factors. Independent of the concentration, Progesterone influenced placental cells maturation. All groups presented great ratio of cells in quiescence state (G1). In third trimester, G2/M high rates indicated a pause in proliferative capacity or in cell cycle progression (arrest). High apoptosis rates were observed in animals at second pregnancy trimester. Based on the presented, we concluded that IDO is susceptible to be controlled by the applied-factors, what lead us to think about hypothetical therapeuthic mechnism for reproduction with the participation of IDO.
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