Orientadores: Michel Georges Albert Vincentz, Renato Vicentini dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:28:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DelBem_LuizEduardoVieira_D.pdf: 43647659 bytes, checksum: cc24ef3c44baab981cbc66519b37ce4b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O sequenciamento de um número crescente de genomas completos tem transformado a biologia. Mais especificamente, no campo da biologia evolutiva, tem se tornado possível endereçar perguntas centrais sobre o funcionamento ultimato dos mecanismos de transformação genética, com potencial impacto em todos os campos da biologia, assim como na filosofia. Esta tese está dividida em dois aspectos importantes da evolução de genomas: o processo de duplicação e fixação de genes duplicados, que é a base do surgimento de famílias multigênicas, e a evolução de redes de regulação, que determinam as relações de causalidade nos processos celulares. Os dois aspectos se relacionam à evolução da complexidade, tanto no que tange o conteúdo gênico dos seres vivos quanto nas interações mecanistica entre os genes via seus produtos (RNAs e proteínas basicamente). No primeiro aspecto abordamos a evolução de dois mecanismos biológicos que depende da ação integrada entre proteínas de famílias distintas: o mecanismo de síntese e degradação do polissacarídeo de parede celular xiloglucano, e o ciclo das chaperonas calreticulina/calnexina envolvidas no controle de qualidade de proteínas sintetizadas no retículo endoplasmático. Nossos trabalhos mostraram que uma forma primordial de xiloglucano, mais simples, surgiu antes da conquista do meio terrestre pela linhagem das plantas, ao contrário do que se imaginava, e que o ciclo calreticulina/calnexina é produto da subfuncionalização em eucariotos basais de uma chaperona ancestral, além do surgimento de funções específicas na família da calreticulina em plantas terrestres. O interesse em evolução de famílias multigênicas nos levou a desenvolver um método (Phylexpress) para análise de ortologia em larga escala, bem como permitir a integração de dados de expressão na tentativa de entender a dinâmica evolutiva da expressão gênica em famílias multigênicas. Utilizamos nosso método para revisitar o conteúdo gênico dos ESTs públicos de cana-de-açúcar, como prova de conceito, numa análise comparativa com o proteoma predito de sorgo. Nossos resultados mostram uma cobertura em termos de ortólogos para apenas ~58% do proteoma predito de sorgo em contrates com estimativas anteriores, com métodos mais simples, que chegaram a 90% do proteoma hipotético de cana. Para abordar a dinâmica evolutiva de redes de regulação, realizamos medições, em escala genômica, das alterações nos níveis de mRNAs de plântulas de sorgo e arroz em resposta a tratamentos de curta duração (2hrs) com sinais exógenos de ABA (hormônio vegetal) e dos açúcares glicose e sacarose. Utilizamos dados públicos e experimentalmente comparáveis de Arabidopsis thaliana em resposta aos mesmos sinais para realizar comparações que revelassem respostas conservadas ou divergentes entre ortólogos. Além disso, buscamos entender a dinâmica evolutiva das respostas transcricionais num contexto de duplicação gênica em famílias multigênicas, onde há diversos genes potencialmente redundantes do ponto de vista bioquímico/estrutural. Nossa abordagem sugere que redes de regulação gênica em eucariotos complexos evoluem majoritariamente de forma neutra, pois parecem apresentar uma taxa de divergência constante, que independe da rede (disparada por cada um dos diferentes sinais) e das espécies envolvidas. Nossos dados são complementares e potencialmente confirmadores de modelos recentes de evolução não-adaptativa em redes de regulação gênica. Concluímos que a evolução da complexidade em sistemas biológicos está parcialmente ligada à diminuição da eficiência da seleção, causada majoritariamente por números populacionais efetivos restritivos presentes nas linhagens de eucariotos complexos (vertebrados e plantas terrestres) / Abstract: The availability of complete sequences of a growing number of genomes is transforming biology. More specifically, in the field of evolutionary biology, it became possible to address central questions on the ultimate mechanisms underlying genetic changes. It has a broad impact on biology and philosophy as well. This thesis deals with two important aspects of genome evolution: the process of gene duplication and fixation of duplicated genes, which is the basis of the origins of multigenic families, and the evolution of genetic regulatory networks that determines the causality of the cellular processes. Both aspects are related to the evolution of complexity regarding the gene content of living forms and the mechanistic interaction between the gene products (mainly RNAs and proteins). In the first aspect we studied the evolution of two biological mechanisms depending on the integrated function of proteins from distinct families. The mechanism of synthesis and remobilization of xyloglucan, a plant cell wall polysaccharide, and the calreticulin/calnexin cycle of protein folding that takes place in the endoplasmic reticulum. Our work showed that a primordial form of xyloglucan already existed before the land conquest by plants. We propose that the calreticulin/calnexin cycle is the product of subfuncionalization of an ancestral eukaryotic chaperone, and plants evolved specific calreticulin functions due to gene duplication. Our interest in the evolution of multigenic families impelled the development of Phylexpress, a method dedicated to large-scale orthology analyses. It can integrate expression data in the context of multigenic families with the goal of understand the evolutionary dynamics of gene expression. We used Phylexpress to revisit the gene content of the publicly available sugarcane ESTs as a proof of concept. Our results showed that the ESTs sampled orthologs for just ~58% of the predict sorghum proteome, in contrast with previous estimations acconting for 90% of the hypotethical sugarcane proteome. In order to approach the evolutionary dynamics of regulatory networks, we measured global changes in gene expression of sorghum and rice plantlets in response to short-term treatments (2hrs) with exogenous ABA (plant hormone) and the sugars glucose and sucrose. We took public data from comparable experiments using Arabidopsis thaliana in order to unravel conserved and divergent responses across orthologs. Furthermore, we analyzed the evolutionary change in transcriptional responses in a context of gene duplications in multigenic families, leading to a set of potentially redundant genes in terms of biochemical/structural properties. Our approach suggests that gene regulatory networks in complex eukaryotes evolve mainly neutrally, in a constant rate that is independent of the analyzed network (triggered by each one of the signals) and the species. Our data is complementary and potentially confirmatory of recent models of nonadaptive evolution in regulatory networks. We concluded that the evolution of the complexity in biological systems is partially connected to the attenuation of the efficiency, mainly due to low effective population sizes present in the lineages that gave rise to complex eukaryotes (vertebrates and land plants) / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

La polyploïdie est un processus important et un moteur de la diversification et de l'évolution des plantes. Peu de polyploïdes naturels ont été décrits chez Juniperus, un genre de conifère représenté par 75 espèces d'arbres ou arbustes à feuilles persistantes, largement réparties dans l'hémisphère nord. Dans ce travail de recherche, l’implication de la polyploïdie dans l'évolution de Juniperus et l’élucidation des mécanismes sous-jacents à ces événements de polyploïdisation sont explorées. La taille du génome (TG) et le niveau de ploïdie ont été évalués chez 111/115 taxons en utilisant la cytométrie en flux et les comptages chromosomiques. Le taux de polyploïdie chez les genévriers s’est avéré être exceptionnellement élevé : 15 taxons sont des tétraploïdes et un seul taxon (J. foetidissima) est hexaploïde. Juniperus foetidissima représente le seul conifère hexaploïde découvert à ce jour à part Sequoia sempervirens. Nous avons également utilisé des approches de modélisation phylogénétique pour déterminer la TG ancestrale dans les trois clades de Juniperus et pour reconstruire le processus évolutif de la polyploïdisation chez ce genre. Au moins 10 événements de polyploïdisation ont eu lieu au cours de l'évolution et de la diversification de Juniperus. Nous avons ensuite exploré l’origine de la polyploïdie chez certaines espèces méditerranéennes. La variation de la TG et le niveau de ploïdie de deux variétés de J. sabina ont été estimés : Les populations échantillonnées de J. sabina var. sabina se sont avérées être diploïdes, tandis que les populations de J. sabina var. balkanensis étaient toutes tétraploïdes. Ces derniers auraient été issus d'une ancienne hybridation entre le tétraploïde J. thurifera et le diploïde J. sabina. Dans les Alpes françaises, où J. sabina var. sabina et J. thurifera sont en sympatrie, des individus présentant des morphologies intermédiaires entre ces deux espèces sont observés. Suite à des estimations des TG, de séquençage des ITS et de régions chloroplastiques, ces individus sont considérés comme des hybrides triploïdes. Enfin, l’utilisation des marqueurs AFLP pour déchiffrer les relations phylogénétiques entre des espèces méditerranéenne a montré que plusieurs pools génétiques contribuent à la diversité de Juniperus. Aussi ces marqueurs ont contribué à la découverte des contributions de ces pools génétiques aux taxons polyploïdes. Alors que les populations libanaises de l'hexaploïde J. foetidissima sont issues d'une lignée ancestrale unique, la population grecque semble résulter d'un mélange inégal de deux lignées anciennes. Ces deux lignées contribuent également au tétraploïde J. thurifera. Cette analyse a également montré que l’espèce méditerranéenne J. excelsa et l’espèce africaine J. procera partagent la même lignée ancestrale. Cependant, des analyses supplémentaires sont nécessaires pour une interprétation plus complète des données. L'importance de l'hybridation interspécifique et de la polyploïdie dans l'évolution des espèces de Juniperus nécessite d’amples recherches visant à comprendre le lien entre ces mécanismes et l'adaptation de ces espèces à un large spectre d'habitats extrêmes. Ces recherches futures devraient aussi contribuer à découvrir comment les espèces de conifères peuvent s’adapter aux changements climatiques. / Polyploidy is considered as an important phenomenon and a key driving force for plant diversification and evolution. Few natural polyploid species have been described in Juniperus, a coniferous genus represented by 75 species of evergreen trees or shrubs widely distributed in the North Hemisphere. The occurrence of polyploidy in the evolution of this genus as well as a more comprehensive view of pathways that were involved in these polyploidization events are explored in this research work. Genome size (GS) and ploidy level assessments were conducted on 111/115 taxa using flow-cytometry and chromosome counts. Juniperus holds an exceptionally high rate of polyploidy, 15 taxa being tetraploids and just one (J. foetidissima) being hexaploid. It represents the only hexaploid conifer discovered to date after Sequoia sempervirens. We also used phylogenetically-informed trait evolution modelling approaches to determine ancestral GS in the three clades of Juniperus and to reconstruct the evolutionary process of polyploidization in Juniperus. At least 10 polyploidization events have occurred during Juniperus evolution and diversification. We then explored the origin of polyploidy in selected Mediterranean species. The GS variation and the ploidy level of two J. sabina varieties were estimated: J. sabina var. sabina sampled populations were shown to be diploid, while J. sabina var. balkanensis populations were all tetraploid. The latter has been postulated to have arisen from an ancient hybridization between the tetraploid J. thurifera and the diploid J. sabina. In the French Alps, where J. sabina var. sabina and J. thurifera occur in sympatry, individuals with intermediate morphologies between these two species are observed. Evidences based on GS assessments, ITS and chloroplastic sequences demonstrated these individuals as triploid hybrids. Finally, the use of AFLP markers to decipher phylogenetic relationships between Mediterranean and Eastern Mediterranean species showed that multiple lineages contributes to Juniperus diversity and shed light on some polyploid taxa origins. While the Lebanese populations of the hexaploid J. foetidissima are issued from a unique ancestral lineage, the Greek population seems to be the result of an unequal admixture of two ancient lineages. These two lineages contribute also to the tetraploid J. thurifera. This analysis showed also that the Mediteranean J. excelsa and the African taxa J. procera shares the same ancestral lineage. However, further analyses are needed for a more complete interpretation of the data. The importance of interspecific hybridization and of polyploidization in the evolution of Juniperus species argues in favor of the development of researches aiming at understanding the link between these mechanisms and the adaptation of those species to a wide range of extreme habitats. Such future researches should contribute to predict how conifer species may adapt to dramatic changes in the Earth’s climate.

Plants produce a rich variety of natural products to face environmental constraints. Enzymes of the cytochrome P450 CYP98 family are key actors in the production of phenolic bioactive compounds. They hydroxylate phenolic esters for lignin biosynthesis in angiosperms, but also produce various other bioactive phenolics. We characterized CYP98s from a moss, a lycopod, a fern, a conifer, a basal angiosperm, a monocot and from two eudicots. We found that substrate preference of the enzymes has changed during evolution of land plants with typical lignin-related activities only appearing in angiosperms, suggesting that ferns, similar to lycopods, produce lignin through an alternative route. A moss CYP98 knock-out mutant revealed coumaroyl-threonate as CYP98 substrate in vivo and showed a severe phenotype. Multiple CYP98s per species exist only in the angiosperms, where we generally found one isoform presumably involved in the biosynthesis of monolignols, and additional isoforms, resulting from independent duplications, with a broad range of functions in vitro / Graduate / 2017-08-31

Sete amostras arqueológicas de milho (Zea mays mays, Lineu), com idades estimadas por C14 que variam entre 620±60 anos e 990±60 anos antes do presente e uma amostra arqueológica de feijão (Phaseolus vulgaris, Lineu) com idade de 301 ± 39 anos, oriundas de cavernas localizadas no Vale do Peruaçu, município de Januária, no norte do estado de Minas Gerais, foram estudas através de técnicas de biologia molecular, com o intuito de compreender melhor a história evolutiva destas espécies nas regiões das Terras Baixas da América do Sul e sua relação com outras amostras destas espécies de diferentes regiões das Américas. Um segmento do gene nuclear Adh2 foi amplificado e sequenciado a partir de extratos das amostras de milho, enquanto, no caso das amostras de feijão, dois foram os alvos genéticos, que amplificaram e sequenciaram duas regiões distintas do gene nuclear Phs. O mesmo procedimento foi realizado com as amostras modernas destas duas espécies. No caso do milho, três padrões/ grupos principais de alelos do gene Adh2 foram encontrados, baseado principalmente em regiões de microsatélites. Os três padrões estão presentes na região de origem do milho, na América Central e também foram observados na América do Sul, mas nesta última região, eles não estão homogeneamente distribuídos. Um primeiro tipo, aparentemente o mais simples, primitivo, está presente praticamente apenas na região da Cordilheira dos Andes. Os outros dois tipos se fazem mais presente na região das terras baixas da América do Sul, sendo que um deles se encontra somente na parte leste do continente, ao longo das bacias hidrográficas dos rios São Francisco e Paraná-Paraguai. Este padrão terras altas/ terras baixas é um fenômeno antigo, como demonstram as amostras arqueológicas e sugere a ocorrência de duas levas principais e independentes de entrada, difusão de raças/ etnovariedade distintas de milho no passado, na América do Sul. Estas levas devem ter ocorrido por volta de 5.000 anos atrás para a primeira delas e por volta de 2.000 anos para a segunda. Uma terceira, mais recente, ainda é possível de ter ocorrido, seguindo mais ou menos o caminho da segunda, mas ficando mais confinada a região leste do Brasil. Estas levas só se explicam pela influência do homem, que foi o agente difusor desta planta, seja através de migrações, onde levou consigo amostras desta planta, seja por troca ou mesmo por conquistas. Os dados sugerem que existiu uma relativa integração humana na parte sul do continente, ligando culturalmente populações humanas desde o Chile até o Paraguai e Brasil, como é mostrado pelo compartilhamento de alelos de milho nestas áreas. Vemos ainda que os tipos de milho da região dos Andes Centrais - Peru, historicamente tiveram pouca influência na formação dos genótipos de milho presentes na região das terras baixas, sendo que as amostras de milho encontradas em Januária apresentam uma relação muito maior e direta com materiais da América Central, do que dos Andes, indicando que, culturalmente, principalmente em termos de alimentação, as populações de Januária receberam uma influência maior de populações humanas das terras mais ao norte e não da região dos Andes Centrais. Este padrão perdura até os dias de hoje, fato este que deve ser o resultado do modelo de colonização européia no Novo Mundo, onde, de modo geral, a região das terras baixas do continente foi colonizada pelos portugueses e as terras altas pelos espanhóis, mantendo este relativo isolamento entre os habitantes das duas regiões, indicando que, aparentemente, as barreiras culturais humanas foram muito mais fortes, importantes e decisivas na origem, seleção e difusão dos gêneros animais e vegetais que o homem utilizava em seu dia a dia, do que as própria barreiras geográficas. Já no caso do feijão, verificamos primeiramente que a amostra arqueológica se trata da espécie Phaseolus vulgaris e que o tipo básico genético da proteína Phaseolina presente na amostra de Januária é do tipo "a" e não do tipo "b". De modo geral a distribuição dos alelos encontrados nas diferentes amostras segue um padrão geográfico, onde todos os alelos oriundos de amostras da região desde o México até o norte da América do Sul (Colômbia/ Equador/ norte do Peru), ficaram em um mesmo grupo, a que chamamos de grupo Norte, enquanto, no outro grupo de alelos, só estavam presentes alelos oriundos de amostras do Sul do Peru e da Argentina, e que chamamos de grupo Sul. Aparentemente os alelos do grupo Norte são os mais antigos, indicando que a origem do feijão deve ter-se dado naquela região. Já as populações de feijão com alelos do grupo sul devem ter se originado a partir de populações do grupo Norte, posteriormente. Os dados sugerem que o feijão deve ter tido apenas um centro de origem e todos os diferentes tipos de feijão hoje existentes evoluíram a partir de uma mesma população ancestral. Isto vai de encontro com algumas teorias que dizem que o feijão pode ter tido mais de um centro de origem, independentes. A amostra de Januária apresentou 6 alelos distintos, sendo que destes, dois são exatamente iguais aos alelos do grupo do Norte, sendo os outros 4 alelos exclusivos. Destes 4 alelos exclusivos, dois são muito próximos à alelos do grupo do Norte e os outros são intermediários. A amostra não apresentou nenhum alelo exatamente igual ao encontrado em indivíduos do grupo Sul Isto sugere que, geneticamente, a amostra de Januária possui um maior grau de relação com alelos presentes em populações do grupo do Norte, mas também apresenta vestígios de um certo grau de contato com alelos mais relacionados a populações mais do centro sul andino. De modo geral, esta amostra de feijão de Januária confirma os dados levantados com as amostras de milho, onde sugerem que as populações de Januária possuíam uma relação ou influência de materiais cultivados muito maior com amostras vindas da região da América Central e norte da América do Sul e muito pouco com amostras da região dos Andes Centrais, como Peru. Observamos ainda que a diversidade genética interespecífica dentro do gene de feijão estudado é maior do que a observada dentro do gene estudado de milho. Por último, este trabalho demonstra que amostras arqueológicas vegetais oriundas de regiões tropicais podem conter material genético ainda preservado e apto para estudos evolutivos e, em paralelo, para vislumbrarmos a história do próprio homem nas Américas. / Seven archaeological samples of maize (Zea mays mays, Lineu), 620±60 to 990±60 years old and one sample of bean (Phaseolus vulgaris, Lineu), 301 ± 39 years old (based on C14 datation), were studied by biomolecular techniques to understand their historical origin. They were found in indigenous subterranean silos, from archaeological sites at Januária (Peruaçu Valley), state of Minas Gerais, Brazil. A segment of the nuclear gene encoding alcohol dehydrogenase 2 (Adh2) was amplified and sequenced from extracts of the maize specimens. In the bean sample, two portions of the nuclear gene encoding the protein Phaseolin were used. In maize, 3 main alele groups were observed for the Adh 2 previously know in the maize origin center in the Central America. In the South America, these groups have also been founded but presenting a characteristic geographical distribution. One of the aleles, considered the most primitive, occurs in the Andean highlands. The other two are present mainly in lowlands, one of them restrict to São Francisco and Paraná-Paraguai rivers basin, along the Atlantic coast. These dates suggest that, historically, different maize varieties were introduced in South America, perhaps in two different periods and spread to distinct regions by migrating or trading human populations. The first introduction is estimated to have occurred about 5,000 years ago, and the second and possibly a third, about 3,000 years later. These introductions must be responsible for the high-/lowland distribution pattern, which maintains up to today. The European colonisation of the South America in the 15-16th century kept this pattern. Portugal conquered the lowlands and Spain the highlands and they maintained a cultural and trade barrier for long time. However in the Southern part of South America there must have been some exchange, since aleles from lowlands were found in archaeological sites in highlands of Chile, and conversely, highland aleles were present in one modern indigenous sample from Paraguay. It should be mentioned that archaeological and modern aleles found in Peru are remarkably different from those of Brazil. This would mean that Brazilian indigenous populations must have been more influenced by Central America culture, rather than from that of Andean highlands. In the case of Januária bean sample, identified as Phaseolus vulgaris, presents the basic genetic type of the Phaseolin of type a. The alleles from modern samples from Mexico to Argentina, indicate a geographical distribution pattern. The alleles originated from Mexico to the Northern region of South America (Colombia, Ecuador and North of Peru) fall in the same group, what we called Northern alleles group, while those from Southern Peru to Argentina fall in another group, that we called Southern alleles group. Apparently Northern group of alleles are older, pointing the corresponding region as the centre of the origin for Phaseolus vulgaris. Southern group of alleles must have been derived from those from the North. This confronts some theories suggesting that bean might have had more than one centre of origin, independently. The Januária sample had six different alleles, two identical to the Northern group. Of the remaining four, two are very close to the Northern group, while the other two may be considered intermediary. No allele similar to the Southern group was found. The conclusion is that the bean sample from Januária is genetically closer to the Northern populations but has vestiges of contacts with populations from Centre and Southern Andes. All put together, maize and beans populations from Januária seem to had a lager relation or influence of materials originating with those from Central Andes, as Peru. Also, a higher genetic diversity was observed within bean genes than maize. Finally, this research demonstrated that plant archaeological samples from the Tropics may contain well preserved genetic material suitable for evolutionary studies and provide data to understand the life history of the Humanity in the Americas.

MADS-box genes are important regulators of reproductive development in seed plants, including both flowering plants and conifers. In this thesis the evolution of the AGAMOUS subfamily of MADS-box genes, and what the ancestral function of this group of genes might have been in the early seed plants about 300 million years ago, was addressed by the discovery of two novel conifer genes, both basal to all previously known AGAMOUS subfamily genes. DAL20, the most basal of these genes, was exclusively expressed in roots, unlike all previously known AGAMOUS subfamily genes. I also studied the evolutionary mechanisms leading to functional diversification of duplicated genes in two different subfamilies of MADS-box genes; the AGAMOUS and AGL6 subfamilies. Focus was on studying changes in gene expression pattern, representing changes in the transcriptional regulation between the genes, and on comparing the functional properties of the gene products, representing changes in the protein-coding sequence between the genes. Duplicated genes in the AGL6 subfamily were found to have evolved by both mechanisms. In the AGAMOUS subfamily I found duplicated spruce genes; DAL2 and DAL20, that appear to have functionally diversified mainly by changes in the transcriptional regulation. Conifer AGAMOUS subfamily genes were also used in a comparative developmental-genetics approach to evaluate hypotheses, based on the morphology of fossil and extant conifer seed cones, on the identity of the female reproductive organ, the ovuliferous scale, and the evolution of seed cone morphology in the conifer families Pinaceae, Taxodiaceae and Cupressaceae. Seed cones in these families have been hypothesized to have homologous ovule-bearing organs, but I found substantial differences in the expression patterns of orthologous AGAMOUS subfamily genes in seed cones of these families that are not compatible with this hypothesis, indicating that the evolutionary history of conifer seed cones is more diverse than previously thought.

Extreme haustorial parasites have long captured the interest of naturalists and scientists with their greatly reduced and highly specialized morphology. Along with the reduction or loss of photosynthesis, the plastid genome often decays as photosynthetic genes are released from selective constraint. This makes it challenging to use traditional plastid genes for parasitic plant phylogenetics, and has driven the search for alternative phylogenetic and molecular evolutionary markers. Thus, evolutionary studies, such as molecular clock-based age estimates, are not yet available for all parasitic lineages. In the present study, we extracted 14 nuclear single copy genes (nSCG) from Illumina transcriptome data from one of the “strangest plants in the world”, Hydnora visseri (Hydnoraceae). A ~15,000 character molecular dataset, based on all three genomic compartments, shows the utility of nSCG for reconstructing phylogenetic relationships in parasitic lineages. A relaxed molecular clock approach with the same multi-locus dataset, revealed an ancient age of ~91 MYA for Hydnoraceae. We then estimated the stem ages of all independently originated parasitic angiosperm lineages using a published dataset, which also revealed a Cretaceous origin for Balanophoraceae, Cynomoriaceae and Apodanthaceae. With the exception of Santalales, older parasite lineages tend to be more specialized with respect to trophic level and have lower species diversity. We thus propose the “temporal specialization hypothesis” (TSH) implementing multiple independent specialization processes over time during parasitic angiosperm evolution.

The island of Sri Lanka’s exceptional biodiversity and enigmatic biogeography begs investigation, as the island is key in understanding the evolution of the Asian tropical flora. Since the Jurassic, Sri Lanka has been subjected to remarkable tectonic changes, thus its flora could have been influenced by that of a number of nearby landmasses, as well giving Sri Lanka the potential to have played a wider role in the assemblage of floras elsewhere. Firstly, as Sri Lanka originated as a fragment of the supercontinent Gondwana, part of its flora may contain Gondwanan relict lineages. There is also the potential for immigration from Laurasia after the Deccan Plate collided with it 45-50 Mya. Further, Sri Lanka may harbour floristic elements from nearby land masses such as Africa and Southeast Asia as a result of long distance dispersals, and in situ speciation has the potential to have played an important role in enhancing the endemic Sri Lankan flora. I tested the relative contributions of the above hypotheses for the possible origins of the Sri Lankan flora using three representative families, Begoniaceae, Sapotaceae and Zingiberaceae. These families represent both herbaceous and woody elements, and have high diversity across the tropics. Dated molecular phylogenies were constructed for each family. I used recent analytical developments in geographic range evolution modelling and ancestral area reconstruction, incorporating a parameter J to test for founder event speciation. A fine scale area coding was used in order to obtain a better picture of the biogeography of continental Asia. Amongst all the models compared, a dispersal-extinction cladogenesis model incorporating founder event speciation proved to be the best fit for the data for all three families. The dates of origin for Sri Lankan lineages considerably post-date the Gondwanan break up, instead suggesting a geologically more recent entry followed by diversification of endemics within the island. The majority of Sri Lankan lineages have an origin in the Sunda Shelf (53%). Persistence of warm temperate and perhumid climate conditions in southwestern Sri Lanka resembling those of Peninsular Malaysia and Sumatra could have facilitated suitable habitats for these massive dispersals from the Sunda Shelf region. Some trans-oceanic long distance dispersals from Africa (11%) are also evidenced, again these are too young to accept a hypothesis of dispersal during the Deccan Plate’s migration close to the African coast during the late Cretaceous, but occurred later during the Miocene. Further, some lineages of Laurasian origin (20%) are evidenced in the Zingiberaceae with ancestral areas of China and Indochina, which is congruent with a post collision invasion. Among the families tested, dispersals have occurred stochastically, one during the Eocene, six during the Oligocene, seven during the Miocene, two during the Pliocene and one during the Pleistocene. The highest number of dispersals occurred during the Miocene when a warm climate was prevailing during the Miocene thermal maximum. My results confirm that in situ speciation is an important contributor to the Sri Lankan flora. More rapid radiation of endemics has occurred during Pliocene-Pleistocene; two endemics in Begoniaceae, ten endemics in Sapotaceae and ten endemics in Zingiberaceae have evolved in situ during this period. Sri Lanka will have been subjected to expansion and contraction of climatic and vegetation zones within the island during glacial and interglacial periods, potentially resulting in allopatric speciation. As a conclusion, long distance dispersals have played a prominent role in the evolution of the Sri Lankan flora. The young ages challenge the vicariant paradigm for the origin and current disjunct distributions of the world’s tropical lineages and provide strong evidence for a youthful tropics at the species level. The thesis contains six chapters; first two are introductory chapters, then there are three analytical chapters, one for each family, and finally a summary chapter is provided. Each analytical chapter is written as a stand-alone scientific publication, thus there is some repetition of relevant content in each.

Sete amostras arqueológicas de milho (Zea mays mays, Lineu), com idades estimadas por C14 que variam entre 620±60 anos e 990±60 anos antes do presente e uma amostra arqueológica de feijão (Phaseolus vulgaris, Lineu) com idade de 301 ± 39 anos, oriundas de cavernas localizadas no Vale do Peruaçu, município de Januária, no norte do estado de Minas Gerais, foram estudas através de técnicas de biologia molecular, com o intuito de compreender melhor a história evolutiva destas espécies nas regiões das Terras Baixas da América do Sul e sua relação com outras amostras destas espécies de diferentes regiões das Américas. Um segmento do gene nuclear Adh2 foi amplificado e sequenciado a partir de extratos das amostras de milho, enquanto, no caso das amostras de feijão, dois foram os alvos genéticos, que amplificaram e sequenciaram duas regiões distintas do gene nuclear Phs. O mesmo procedimento foi realizado com as amostras modernas destas duas espécies. No caso do milho, três padrões/ grupos principais de alelos do gene Adh2 foram encontrados, baseado principalmente em regiões de microsatélites. Os três padrões estão presentes na região de origem do milho, na América Central e também foram observados na América do Sul, mas nesta última região, eles não estão homogeneamente distribuídos. Um primeiro tipo, aparentemente o mais simples, primitivo, está presente praticamente apenas na região da Cordilheira dos Andes. Os outros dois tipos se fazem mais presente na região das terras baixas da América do Sul, sendo que um deles se encontra somente na parte leste do continente, ao longo das bacias hidrográficas dos rios São Francisco e Paraná-Paraguai. Este padrão terras altas/ terras baixas é um fenômeno antigo, como demonstram as amostras arqueológicas e sugere a ocorrência de duas levas principais e independentes de entrada, difusão de raças/ etnovariedade distintas de milho no passado, na América do Sul. Estas levas devem ter ocorrido por volta de 5.000 anos atrás para a primeira delas e por volta de 2.000 anos para a segunda. Uma terceira, mais recente, ainda é possível de ter ocorrido, seguindo mais ou menos o caminho da segunda, mas ficando mais confinada a região leste do Brasil. Estas levas só se explicam pela influência do homem, que foi o agente difusor desta planta, seja através de migrações, onde levou consigo amostras desta planta, seja por troca ou mesmo por conquistas. Os dados sugerem que existiu uma relativa integração humana na parte sul do continente, ligando culturalmente populações humanas desde o Chile até o Paraguai e Brasil, como é mostrado pelo compartilhamento de alelos de milho nestas áreas. Vemos ainda que os tipos de milho da região dos Andes Centrais – Peru, historicamente tiveram pouca influência na formação dos genótipos de milho presentes na região das terras baixas, sendo que as amostras de milho encontradas em Januária apresentam uma relação muito maior e direta com materiais da América Central, do que dos Andes, indicando que, culturalmente, principalmente em termos de alimentação, as populações de Januária receberam uma influência maior de populações humanas das terras mais ao norte e não da região dos Andes Centrais. Este padrão perdura até os dias de hoje, fato este que deve ser o resultado do modelo de colonização européia no Novo Mundo, onde, de modo geral, a região das terras baixas do continente foi colonizada pelos portugueses e as terras altas pelos espanhóis, mantendo este relativo isolamento entre os habitantes das duas regiões, indicando que, aparentemente, as barreiras culturais humanas foram muito mais fortes, importantes e decisivas na origem, seleção e difusão dos gêneros animais e vegetais que o homem utilizava em seu dia a dia, do que as própria barreiras geográficas. Já no caso do feijão, verificamos primeiramente que a amostra arqueológica se trata da espécie Phaseolus vulgaris e que o tipo básico genético da proteína Phaseolina presente na amostra de Januária é do tipo "a" e não do tipo "b". De modo geral a distribuição dos alelos encontrados nas diferentes amostras segue um padrão geográfico, onde todos os alelos oriundos de amostras da região desde o México até o norte da América do Sul (Colômbia/ Equador/ norte do Peru), ficaram em um mesmo grupo, a que chamamos de grupo Norte, enquanto, no outro grupo de alelos, só estavam presentes alelos oriundos de amostras do Sul do Peru e da Argentina, e que chamamos de grupo Sul. Aparentemente os alelos do grupo Norte são os mais antigos, indicando que a origem do feijão deve ter-se dado naquela região. Já as populações de feijão com alelos do grupo sul devem ter se originado a partir de populações do grupo Norte, posteriormente. Os dados sugerem que o feijão deve ter tido apenas um centro de origem e todos os diferentes tipos de feijão hoje existentes evoluíram a partir de uma mesma população ancestral. Isto vai de encontro com algumas teorias que dizem que o feijão pode ter tido mais de um centro de origem, independentes. A amostra de Januária apresentou 6 alelos distintos, sendo que destes, dois são exatamente iguais aos alelos do grupo do Norte, sendo os outros 4 alelos exclusivos. Destes 4 alelos exclusivos, dois são muito próximos à alelos do grupo do Norte e os outros são intermediários. A amostra não apresentou nenhum alelo exatamente igual ao encontrado em indivíduos do grupo Sul Isto sugere que, geneticamente, a amostra de Januária possui um maior grau de relação com alelos presentes em populações do grupo do Norte, mas também apresenta vestígios de um certo grau de contato com alelos mais relacionados a populações mais do centro sul andino. De modo geral, esta amostra de feijão de Januária confirma os dados levantados com as amostras de milho, onde sugerem que as populações de Januária possuíam uma relação ou influência de materiais cultivados muito maior com amostras vindas da região da América Central e norte da América do Sul e muito pouco com amostras da região dos Andes Centrais, como Peru. Observamos ainda que a diversidade genética interespecífica dentro do gene de feijão estudado é maior do que a observada dentro do gene estudado de milho. Por último, este trabalho demonstra que amostras arqueológicas vegetais oriundas de regiões tropicais podem conter material genético ainda preservado e apto para estudos evolutivos e, em paralelo, para vislumbrarmos a história do próprio homem nas Américas. / Seven archaeological samples of maize (Zea mays mays, Lineu), 620±60 to 990±60 years old and one sample of bean (Phaseolus vulgaris, Lineu), 301 ± 39 years old (based on C14 datation), were studied by biomolecular techniques to understand their historical origin. They were found in indigenous subterranean silos, from archaeological sites at Januária (Peruaçu Valley), state of Minas Gerais, Brazil. A segment of the nuclear gene encoding alcohol dehydrogenase 2 (Adh2) was amplified and sequenced from extracts of the maize specimens. In the bean sample, two portions of the nuclear gene encoding the protein Phaseolin were used. In maize, 3 main alele groups were observed for the Adh 2 previously know in the maize origin center in the Central America. In the South America, these groups have also been founded but presenting a characteristic geographical distribution. One of the aleles, considered the most primitive, occurs in the Andean highlands. The other two are present mainly in lowlands, one of them restrict to São Francisco and Paraná-Paraguai rivers basin, along the Atlantic coast. These dates suggest that, historically, different maize varieties were introduced in South America, perhaps in two different periods and spread to distinct regions by migrating or trading human populations. The first introduction is estimated to have occurred about 5,000 years ago, and the second and possibly a third, about 3,000 years later. These introductions must be responsible for the high-/lowland distribution pattern, which maintains up to today. The European colonisation of the South America in the 15-16th century kept this pattern. Portugal conquered the lowlands and Spain the highlands and they maintained a cultural and trade barrier for long time. However in the Southern part of South America there must have been some exchange, since aleles from lowlands were found in archaeological sites in highlands of Chile, and conversely, highland aleles were present in one modern indigenous sample from Paraguay. It should be mentioned that archaeological and modern aleles found in Peru are remarkably different from those of Brazil. This would mean that Brazilian indigenous populations must have been more influenced by Central America culture, rather than from that of Andean highlands. In the case of Januária bean sample, identified as Phaseolus vulgaris, presents the basic genetic type of the Phaseolin of type a. The alleles from modern samples from Mexico to Argentina, indicate a geographical distribution pattern. The alleles originated from Mexico to the Northern region of South America (Colombia, Ecuador and North of Peru) fall in the same group, what we called Northern alleles group, while those from Southern Peru to Argentina fall in another group, that we called Southern alleles group. Apparently Northern group of alleles are older, pointing the corresponding region as the centre of the origin for Phaseolus vulgaris. Southern group of alleles must have been derived from those from the North. This confronts some theories suggesting that bean might have had more than one centre of origin, independently. The Januária sample had six different alleles, two identical to the Northern group. Of the remaining four, two are very close to the Northern group, while the other two may be considered intermediary. No allele similar to the Southern group was found. The conclusion is that the bean sample from Januária is genetically closer to the Northern populations but has vestiges of contacts with populations from Centre and Southern Andes. All put together, maize and beans populations from Januária seem to had a lager relation or influence of materials originating with those from Central Andes, as Peru. Also, a higher genetic diversity was observed within bean genes than maize. Finally, this research demonstrated that plant archaeological samples from the Tropics may contain well preserved genetic material suitable for evolutionary studies and provide data to understand the life history of the Humanity in the Americas.

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Extreme haustorial parasites have long captured the interest of naturalists and scientists with their greatly reduced and highly specialized morphology. Along with the reduction or loss of photosynthesis, the plastid genome often decays as photosynthetic genes are released from selective constraint. This makes it challenging to use traditional plastid genes for parasitic plant phylogenetics, and has driven the search for alternative phylogenetic and molecular evolutionary markers. Thus, evolutionary studies, such as molecular clock-based age estimates, are not yet available for all parasitic lineages. In the present study, we extracted 14 nuclear single copy genes (nSCG) from Illumina transcriptome data from one of the “strangest plants in the world”, Hydnora visseri (Hydnoraceae). A ~15,000 character molecular dataset, based on all three genomic compartments, shows the utility of nSCG for reconstructing phylogenetic relationships in parasitic lineages. A relaxed molecular clock approach with the same multi-locus dataset, revealed an ancient age of ~91 MYA for Hydnoraceae. We then estimated the stem ages of all independently originated parasitic angiosperm lineages using a published dataset, which also revealed a Cretaceous origin for Balanophoraceae, Cynomoriaceae and Apodanthaceae. With the exception of Santalales, older parasite lineages tend to be more specialized with respect to trophic level and have lower species diversity. We thus propose the “temporal specialization hypothesis” (TSH) implementing multiple independent specialization processes over time during parasitic angiosperm evolution.