Orientador: José Osmar Gaspar / Banca: Júlio César Borges / Banca: Jorge Alberto Marques Rezende / Banca: Marinônio Lopez Cornelio / Banca: Roberto da Silva / Resumo: A expressão de proteínas recombinantes em Escherichia coli produz proteínas que se acumulam como agregados insolúveis conhecidos como corpos de inclusão (CI). As proteínas na forma de CI são biologicamente ativas e com estrutura semelhante à proteína nativa quando a expressão é induzida a baixa temperatura. Estas características e a facilidade em purificar os CIs podem representar uma possibilidade de utilização dos CIs como antígenos para a produção de anticorpos policlonais. O gene da proteína capsidial (CP) do Southern bean mosaic virus (SBMV), um Sobemovirus, foi clonado no vetor pET 28a e a proteína expressa em E. coli a 25 º C. Uma análise comparativa entre a CP recombinante presente na forma de corpos de inclusão e a proteína nativa presente nas partículas virais purificadas foi realizada utilizando a técnica de espectroscopia de infravermelho (FT-IR). Os conteúdos de estruturas secundárias identificados diferiram nos percentuais de folha-β enquanto os percentuais hélices-α foram preservados. Uma estrutura tridimensional foi gerada por modelagem molecular por homologia e comparada com os dados obtidos nas análises de FT-IR. Os percentuais obtidos por FT-IR da CP nativa foram condizentes com os dados gerados por modelagem molecular por homologia. Mesmo com algumas diferenças nos conteúdos de folha- β da CP recombinante foi possível verificar um estado conformacional semelhante à proteína nativa. Os corpos de inclusão contendo a proteína recombinante expressa foram utilizados como antígenos para a imunização de coelhos. O antissoro obtido mostrou ser específico e compatível a um antissoro previamente preparado com partículas virais purificadas do SBMV na detecção do vírus em extratos de feijoeiros infectados utilizando imunoensaios por Western blot, PTA-ELISA, Dot Blot e Tissue Printing... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The production of recombinant proteins in Escherichia coli yields proteins that accumulate as insoluble aggregates known as inclusion bodies (IBs). Biologically active with native-like structure is trapped inside IBs when the expression is induced at low temperature. These features, and the facility to purify the IBs, can represent a possibility to use the IBs as an antigen for the production of polyclonal antibodies. The coat protein gene of Southern bean mosaic virus, a Sobemovirus, was cloned in the vector pET 28a and expressed in Escherichia coli at 25 ºC. The inclusion bodies containing the recombinant protein were isolated and purified. A comparative analysis between recombinant protein present in the form of inclusion bodies and native coat protein present in the purified virus particles was performed using Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR). The secondary structure contents identified differences in the percentage of β-sheets while α-helices content was much preserved. The three-dimensional structure was generated using molecular modeling and was compared to the data obtained from FT-IR analysis. The percentages obtained from FT-IR analyses of the native CP were consistent with the structure generated through homology molecular modeling. Nevertheless, some differences were present on the content of β-sheets structure of the recombinant CP indicating that the protein conformational state is found in a native like condition. The IBs containing the expressed protein were used as an antigen to immunize rabbits. The antiserum obtained showed to be specific and comparable to one previously prepared with purified SBMV particles, in the virus detection in leaf extracts of infected bean plants using Western blot, PTA-ELISA, Dot Blot and Tissue Printing assays. So, the use of IBs containing recombinant viral proteins to immunize rabbits is a new, easy and very... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Renate Krause Sakate / Coorientador: Laura M. Boykin / Banca: Regiane Cristina Oliveira de Freitas Bueno / Banca: Julio Massaharu Maraubayashi / Banca: Valdir Atsushi Yuki / Banca: Mônika Fecury Moura / Resumo: A mosca-branca, Bemisia tabaci (Gennadius) é uma praga de distribuição global que afeta centenas de diferentes plantas hospedeiras incluindo grandes culturas, olerícolas e ornamentais. B. tabaci causa danos principalmente através da transmissão de vírus de plantas como os begomovirus, crinivirus, ipomovirus, torradovirus e carlavirus. Atualmente, B. tabaci é considerada um complexo de pelo menos 40 espécies crípticas que apresentam diversidade genética, biológica e diferentes composições de bactérias endossimbiontes facultativas. No Brasil, tanto espécies nativas quanto exóticas de mosca-branca são encontradas e ainda há uma escassez de dados genômicos destas populações e das bactérias endossimbiontes. Na África Oriental, altas populações de moscas-brancas estão disseminando diferentes vírus de plantas que causam epidemias na cultura da mandioca (Manihot esculenta) e com perdas na produtividade. A principal forma de manejo desses vírus na África é através da utilização de variedades tolerantes. Portanto, é essencial a identificação de novos genes de resistência para o desenvolvimento de variedades e um manejo eficiente das doenças. O sequenciamento de transcriptomas é uma ferramenta que possibilita uma análise genômica da mosca-branca, dos vírus transmitidos por ela, das bactérias endossimbiontes e das plantas hospedeiras dessa praga. Portanto, os dados genômicos obtidos dão suporte para o desenvolvimento de novas técnicas que podem se tornar futuras alternativas de controle ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The whitefly, Bemisia tabaci (Gennadius) is a global pest that affects hundreds of different plant hosts including vegetable, fiber and ornamental crops. B. tabaci causes damage mainly by the transmission of plant viruses such as begomoviruses, criniviruses, ipomoviruses, torradoviruses, and carlaviruses. Currently, B. tabaci is known as a complex of at least 40 putative cryptic species that shows genetic and biological diversity and a different composition of bacterial facultative endosymbionts. In Brazil, both exotic and indigenous species of whiteflies are found and there is still a lack of genomic data available among these populations and also their bacterial endosymbionts. In East Africa, high populations of whiteflies are transmitting different plant viruses that are causing epidemics in cassava crops (Manihot esculenta) and leading to great yield losses. Currently, the management of these viral diseases in Africa is carried out mainly by growing cassava tolerant varieties. Therefore, is essential to identify new target genes for the development of new varieties for an efficient management of viral diseases. Transcriptome sequencing is a tool that allows a genomic analysis of the whitefly, whitefly-transmitted viruses, bacterial endosymbionts and plant hosts. Therefore, the genomic data obtained gives support for the development of new technics that might aid for future management alternatives of whiteflies and their associated viruses. In Chapter 1, transcriptome data were obtained from different B. tabaci species found in Brazil which allowed to obtain complete mitochondrial genomes from different whitefly species and draft genomes of the facultative endosymbiont Hamiltonella. The phylogenetic analysis revealed that the genetic differences among exotic and native populations present in the mtCOI gene extends to the mitochondrial genome and to the facultative endosymbiont Hamiltonella. In ... / Doutor

Evaluation of the antiviral effectiveness of ribavirin and acyclic nucleotide phosphonates to radish mosaic virus. Virus inoculation of plants with RaMV and immunological assay of the virus by ELISA. Subsequent application of antiviral agents and monitoring relative content of the virus in plants. Subsequent processing of data in tables and graphs, and then statistical evaluation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-24Bitstream added on 2014-06-13T18:43:21Z : No. of bitstreams: 1 ozatojunior_t_dr_sjrp.pdf: 1586824 bytes, checksum: dea85cc33a334b628fea61b143707b14 (MD5) / A expressão de proteínas recombinantes em Escherichia coli produz proteínas que se acumulam como agregados insolúveis conhecidos como corpos de inclusão (CI). As proteínas na forma de CI são biologicamente ativas e com estrutura semelhante à proteína nativa quando a expressão é induzida a baixa temperatura. Estas características e a facilidade em purificar os CIs podem representar uma possibilidade de utilização dos CIs como antígenos para a produção de anticorpos policlonais. O gene da proteína capsidial (CP) do Southern bean mosaic virus (SBMV), um Sobemovirus, foi clonado no vetor pET 28a e a proteína expressa em E. coli a 25 º C. Uma análise comparativa entre a CP recombinante presente na forma de corpos de inclusão e a proteína nativa presente nas partículas virais purificadas foi realizada utilizando a técnica de espectroscopia de infravermelho (FT-IR). Os conteúdos de estruturas secundárias identificados diferiram nos percentuais de folha-β enquanto os percentuais hélices-α foram preservados. Uma estrutura tridimensional foi gerada por modelagem molecular por homologia e comparada com os dados obtidos nas análises de FT-IR. Os percentuais obtidos por FT-IR da CP nativa foram condizentes com os dados gerados por modelagem molecular por homologia. Mesmo com algumas diferenças nos conteúdos de folha- β da CP recombinante foi possível verificar um estado conformacional semelhante à proteína nativa. Os corpos de inclusão contendo a proteína recombinante expressa foram utilizados como antígenos para a imunização de coelhos. O antissoro obtido mostrou ser específico e compatível a um antissoro previamente preparado com partículas virais purificadas do SBMV na detecção do vírus em extratos de feijoeiros infectados utilizando imunoensaios por Western blot, PTA-ELISA, Dot Blot e Tissue Printing... / The production of recombinant proteins in Escherichia coli yields proteins that accumulate as insoluble aggregates known as inclusion bodies (IBs). Biologically active with native-like structure is trapped inside IBs when the expression is induced at low temperature. These features, and the facility to purify the IBs, can represent a possibility to use the IBs as an antigen for the production of polyclonal antibodies. The coat protein gene of Southern bean mosaic virus, a Sobemovirus, was cloned in the vector pET 28a and expressed in Escherichia coli at 25 ºC. The inclusion bodies containing the recombinant protein were isolated and purified. A comparative analysis between recombinant protein present in the form of inclusion bodies and native coat protein present in the purified virus particles was performed using Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR). The secondary structure contents identified differences in the percentage of β-sheets while α-helices content was much preserved. The three-dimensional structure was generated using molecular modeling and was compared to the data obtained from FT-IR analysis. The percentages obtained from FT-IR analyses of the native CP were consistent with the structure generated through homology molecular modeling. Nevertheless, some differences were present on the content of β-sheets structure of the recombinant CP indicating that the protein conformational state is found in a native like condition. The IBs containing the expressed protein were used as an antigen to immunize rabbits. The antiserum obtained showed to be specific and comparable to one previously prepared with purified SBMV particles, in the virus detection in leaf extracts of infected bean plants using Western blot, PTA-ELISA, Dot Blot and Tissue Printing assays. So, the use of IBs containing recombinant viral proteins to immunize rabbits is a new, easy and very... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-03Bitstream added on 2015-04-09T12:47:20Z : No. of bitstreams: 1 000809805.pdf: 1812121 bytes, checksum: 46978417cc590a6b8d7c98caac024da7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Cole latent virus (CoLV) é um fitovírus cuja principal hospedeira é a couve comum. Pertence ao gênero Carlavirus, que é constituído por vírus que infectam diversos grupos de plantas, incluindo aquelas de grande importância econômica no mundo, como a batata, a soja, o amendoim e o milho. O Pepper ringspot virus (PepRSV) foi descrito no Brasil no início dos anos 60, sendo caracterizado como integrante do gênero Tobravirus, podendo causar danos a culturas como tomate e pimentão. Até o momento, o ciclo de vida desses vírus não é completamente conhecido. Sabe-se que algumas proteínas virais são essenciais na infecção. Dentre estas, a proteína capsidial (CP), a do movimento (MP) e a helicase (HEL) que ainda não possuem estruturas definidas. Desta forma, o trabalho teve como objetivo analisar a estrutura da proteína capsidial do Cole latent virus (CP-CoLV); da proteína do movimento do Pepper ringspot vírus (MP-PepRSV) e de um fragmento da helicase do Pepper ringspot virus (HEL-PepRSV). Vetores de expressão, contendo as sequências de interesse, foram transformados. Nos testes de indução de expressão a 37°C observou-se a formação de corpos de inclusão para as três proteínas em questão. Após lavagem dos corpos de inclusão, as proteínas purificadas foram reenoveladas e concentradas. Após reenovelamento, a CP-CoLV e a MP-PepRSV foram analisadas por dicroísmo circular para verificar o seu conteúdo de estrutura secundária. Essa análise confirmou a eficiência do processo de reenovelamento. A CP-CoLV também foi analisada por espalhamento dinâmico de luz, para estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Os dados do espalhamento dinâmico de luz mostraram que a proteína encontra-se estável e monodispersa. Dessa forma, dentre as proteínas estudadas, a CPCoLV apresentou melhores condições para os testes de cristalização. Através da expressão a 18°C, ... / The Cole latent virus is a plant virus which infects mainly the common cole. It is a member of Carlavirus genus, which contains viruses that infect several plant groups, including those of great economic importance worldwide, as potato, soy, peanut and corn. The Pepper ringspot virus was first described during the 60’s in Brazil. It is characterized as member of Tobravirus genus and it can damage to cultures as tomato and pepper. Until now, the viral life cycle is not completely elucidated. It is known that some viral proteins are essential for infection, including the capsid protein (CP), movement protein (MP) and helicase (HEL). Those proteins do not have the structure determined, yet. Therefore, this work aimed the structural study of the capsid protein of Cole latent virus (CP-CoLV); movement protein of Pepper ringspot virus (MPPepRSV) and a helicase fragment of Pepper ringspot virus (HEL-PepRSV). Expression vectors containing sequences of interest were transformed Tests for protein expression at 37°C resulted in formation of inclusion bodies for the three tested proteins. The proteins present in inclusion bodies were solubilized and purified under denaturing conditions. The purified proteins were refolding by dialysis and concentrated. After refolding CoLV-CP and MP-PepRSV were analyzed by circular dichroism to check its secondary structure content. This analysis confirmed the refolding efficiency. The CP-CoLV was also analyzed by Dynamic Light Scattering to estimate the size distribution of particle populations which are present in the solution. The data of the dynamic light scattering showed that the protein is stable and monodisperse. Thus, among the proteins studied, the CP-CoLV showed better conditions for crystallization trials. When expressed at 18°C, it was possible to obtain the CP -CoLV in its native state. The protein was purified under non-denaturing and analyzed by infra-red spectroscopy. Using homology molecular ...

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 478603 bytes, checksum: 2f73d62b9c5b69dd70468c095488ebaf (MD5) Previous issue date: 2014-07-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / NIK (NSP-Interacting Kinase) is a receptor-like kinase involved in defense against geminiviruses, which was first identified as a virulence target of the begomovirus transport protein NSP (Nuclear Shuttle Protein). We have previously identified that NIK activation mediates an indirect phosphorylation of the ribosomal protein L10 causing the translocation of the cytosolic protein to the nucleus, where it interacts with LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein) to regulate genes involved in the translation machinery resulting in a global translation suppression. Constitutive activation of NIK, through ectopic expression of the mutant T474D in Arabidopsis, has been previously shown to induce the plant immune system. In this investigation, we examined further whether activation of the signaling module NIK-RPL10-LIMYB would transduce a typical defense signal that promotes the induction of the plant immune system. However, the current results suggest that the NIK-mediated antiviral signaling does not induces the basal immune system. Firstly, the global variation of gene expression by ectopic expression of the constitutively activated mutant receptor T474D or LIMYB does not cause a gene enrichment in the up-regulated list of typical defense categories, such as response to pathogens, response to virus and virus-induced gene silencing. Secondly and very importantly, quantitative RT-PCR of a representative sample of defense genes confirmed that they are not up-regulated by expression of T474D or LIMYB. In contrary, expression of LIMYB in the transgenic lines caused a down-regulation of the defense genes examined. We have also examined new host targets that interact with NSP. Initially, we used a 12000 Arabidopsis protein expression-based microarray to isolate a t-SNARE-like protein with the capacity to bind NSP in vitro. This interaction NSP-At4g30240 protein was further confirmed by two- hybrid assay in yeast and by bimolecular fluorescence complementation assay in planta. Our results indicate that At4g30240 interacts with NSP in vivo to mediate or facilitate the viral protein transport among cell compartments. / NIK (NSP-Interacting Kinase) é um receptor cinase envolvido na resposta de defesa contra geminivírus, e foi primeiramente identificado como alvo de virulência da proteína de transporte NSP (Nuclear Shuttle Protein) de begomovírus. Previamente, foi identificado que a ativação de NIK medeia a fosforilação indireta da proteína ribossomal L10, promovendo a translocação da proteína citosólica para o núcleo, onde interage com a proteína LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein), para regular genes envolvidos na maquinaria de tradução da célula, resultando em supressão da tradução global. Foi também demonstrado que a ativação constitutiva de NIK1, através da expressão ectópica do mutante T474D, induz o sistema imune de plantas em Arabidopsis. Nesta investigação, foi analisado em maiores detalhes se a ativação do módulo de sinalização NIK-RPL10-LIMYB também transmitiria um sinal típico de defesa, resultando na indução do sistema imune de plantas. Entretanto, os resultados encontrados sugerem que a via de sinalização antiviral mediada por NIK não transmite o sinal de defesa típico que culmina na ativação de genes relacionados ao sistema imune de plantas. Em primeiro lugar, por meio de estudos de variação global de expressão gênica, induzida por expressão ecotópica do mutante constitutivo T474D ou LIMYB, foi constatado que não houve enriquecimento gênico significativo na lista dos genes regulados positivamente nas categorias de defesa, como resposta de defesa a patógenos, resposta de defesa a vírus e silenciamento gênico induzido por vírus. Além disso, RT- PCR quantitativo de uma amostra representativa dos genes de defesa confirmou que estes genes de defesa não foram regulados positivamente pela expressão de T474D ou LIMYB. Ao contrário, a expressão de LIMYB nas linhagens transgênicas promoveu a regulação negativa dos referidos genes de defesa. Nesta investigação, também se avaliou novos alvos do hospederio que interagem com NSP. Inicialmente, foi isolada, por meio de microarranjos de expressão de 12.000 proteínas de Arabidopsis, uma proteína com características de uma t-SNARE, codificada pelo locus At4g30240 com a capacidade de interagir com NSP in vitro. Esta interação NSP- proteína At4g30240 foi confirmada em ensaios de duplo hibrido em leveduras e por ensaios de complementação de fluorescência bimolecular in planta. Os resultados indicam que At4g30240 interage com NSP in vivo, e pode mediar ou mesmo facilitar o transporte dessa proteína viral entre compartimentos celulares.

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Andréia Estela Moreira de Souza / Banca: Priscila Belintani / Banca: Anwar Ullah / Banca: José Ramon Beltran Abrego / Resumo: O Cole latent virus (CoLV) é um fitovírus cuja principal hospedeira é a couve comum. Pertence ao gênero Carlavirus, que é constituído por vírus que infectam diversos grupos de plantas, incluindo aquelas de grande importância econômica no mundo, como a batata, a soja, o amendoim e o milho. O Pepper ringspot virus (PepRSV) foi descrito no Brasil no início dos anos 60, sendo caracterizado como integrante do gênero Tobravirus, podendo causar danos a culturas como tomate e pimentão. Até o momento, o ciclo de vida desses vírus não é completamente conhecido. Sabe-se que algumas proteínas virais são essenciais na infecção. Dentre estas, a proteína capsidial (CP), a do movimento (MP) e a helicase (HEL) que ainda não possuem estruturas definidas. Desta forma, o trabalho teve como objetivo analisar a estrutura da proteína capsidial do Cole latent virus (CP-CoLV); da proteína do movimento do Pepper ringspot vírus (MP-PepRSV) e de um fragmento da helicase do Pepper ringspot virus (HEL-PepRSV). Vetores de expressão, contendo as sequências de interesse, foram transformados. Nos testes de indução de expressão a 37°C observou-se a formação de corpos de inclusão para as três proteínas em questão. Após lavagem dos corpos de inclusão, as proteínas purificadas foram reenoveladas e concentradas. Após reenovelamento, a CP-CoLV e a MP-PepRSV foram analisadas por dicroísmo circular para verificar o seu conteúdo de estrutura secundária. Essa análise confirmou a eficiência do processo de reenovelamento. A CP-CoLV também foi analisada por espalhamento dinâmico de luz, para estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Os dados do espalhamento dinâmico de luz mostraram que a proteína encontra-se estável e monodispersa. Dessa forma, dentre as proteínas estudadas, a CPCoLV apresentou melhores condições para os testes de cristalização. Através da expressão a 18°C, ... / Abstract: The Cole latent virus is a plant virus which infects mainly the common cole. It is a member of Carlavirus genus, which contains viruses that infect several plant groups, including those of great economic importance worldwide, as potato, soy, peanut and corn. The Pepper ringspot virus was first described during the 60's in Brazil. It is characterized as member of Tobravirus genus and it can damage to cultures as tomato and pepper. Until now, the viral life cycle is not completely elucidated. It is known that some viral proteins are essential for infection, including the capsid protein (CP), movement protein (MP) and helicase (HEL). Those proteins do not have the structure determined, yet. Therefore, this work aimed the structural study of the capsid protein of Cole latent virus (CP-CoLV); movement protein of Pepper ringspot virus (MPPepRSV) and a helicase fragment of Pepper ringspot virus (HEL-PepRSV). Expression vectors containing sequences of interest were transformed Tests for protein expression at 37°C resulted in formation of inclusion bodies for the three tested proteins. The proteins present in inclusion bodies were solubilized and purified under denaturing conditions. The purified proteins were refolding by dialysis and concentrated. After refolding CoLV-CP and MP-PepRSV were analyzed by circular dichroism to check its secondary structure content. This analysis confirmed the refolding efficiency. The CP-CoLV was also analyzed by Dynamic Light Scattering to estimate the size distribution of particle populations which are present in the solution. The data of the dynamic light scattering showed that the protein is stable and monodisperse. Thus, among the proteins studied, the CP-CoLV showed better conditions for crystallization trials. When expressed at 18°C, it was possible to obtain the CP -CoLV in its native state. The protein was purified under non-denaturing and analyzed by infra-red spectroscopy. Using homology molecular ... / Doutor

Please read the abstract in the section 00front of this document / Dissertation (Magister Istitutiones Agrariae)--University of Pretoria, 2006. / Plant Production and Soil Science / unrestricted

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Bibliography: pages 175-184. / The occurrence of maize dwarf mosaic virus (MDMV) in field grown maize was investigated. For this purpose, maize showing mosiac symptoms was collected from different maize growing areas in South Africa by Prof. M.B. von Wechmar. These samples from Transvaal, Orange Free State and Natal were then investigated for the presence of MDMV and possible strains of this virus. Three virus isolates were purified and partially characterised. These isolates were serologically compared together with a fourth isolate SCMV 4975, obtained from the U.S., to establish strain relationships.