As Nek são proteínas cinases humanas evolutivamente conservadas e estruturalmente relacionadas à NIMA, um regulador mitótico descrito em Aspergillus nidulans. A Nek1, uma das onze isoformas das Neks identificadas em mamíferos, parece estar envolvida na etiologia da Doença Policística do Rim (PKD) em humanos, pois sua deleção em animais causa uma síndrome semelhante à PKD. Além disso, existem evidências sobre sua participação no reparo ao DNA em resposta à radiação ionizante e sobre sua interação com proteínas envolvidas em rotas de reparo e na regulação do ciclo celular de mamífero, mas pouco se sabe sobre seu papel na fisiologia das células de mamíferos. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel da Nek1 no reparo de DNA. A sensibilidade dae linhagens celulares aos agentes genotóxicos foram testados pelo ensaio cometa em pH alcalino e também por meio do ensaio de proliferação celular MTT. Para isso, utilizamos a linhagem de rim Hek293t e de glioma humano U87. Essas células foram silenciadas através de um sistema lentiviral estável que usa a proteína fluorescente verde (GFP) como marcador. A seleção das linhagens Nek-negativas foi feita por isolamento de colônias GFP-positivas. As células utilizadas como controle nesse trabalho também expressavam GFP além da Nek1. As células foram testadas com os agentes indutores de danos ao DNA metil-metanosulfonato, peróxido de hidrogênio e cisplatina. Os resultados mostraram o retardo no reparo de células silenciadas tratadas com peróxido de hidrogênio e metil-metanosulfonato. Após o tratamento com cisplatina, o DNA das células silenciadas apresentou um padrão de migração diferente, característico de lesões do tipo ligações cruzadas (crosslink). Esse aspecto permaneceu até 4 horas após a exposição à cisplatina, quando o aspecto de cauda começou a tornar-se mais predominante entre as células observadas. Nosso estudo também mostrou maior sensibilidade da linhagem silenciada em relação à selvagem quando tratadas com esses três agentes por 24, 48 e 72 h de tratamento. Portanto, nossos resultados indicam que a ausência da Nek1 provoca alterações no reparo normal de danos ao DNA e aumento da sensibilidade ao estresse genotóxico, mas aparentemente ela não é essencial para a sinalização do reparo, uma vez que, mesmo com o retardo, as células acabam conseguindo reparar o dano causado. Esses efeitos podem estar ocorrendo devido a uma deficiência nas vias de reparo de quebras no DNA que são realizadas por mecanismos de recombinação. Por outro lado, a Nek1 poderia estar atuando no reparo DNA lesado indiretamente através da regulação do ciclo celular, uma vez que a ocorrência de uma lesão no material genético pode alterar o ciclo celular, causando uma parada. Ainda é cedo para afirmar se a Nek1 está atuando diretamente no controle do ciclo celular ou em rotas de reparo ou até mesmo nas duas. Entender como essa proteína funciona in vivo pode auxiliar no estudo da etiologia da Doença Policística do Rim bem como no entendimento de patologias associadas a lesões no material genético. / NIMA related kinases (Neks) are evolutionarily conserved proteins structurally related to the Aspergillus nidulans mitotic regulator NIMA. The Nek1, one of the eleven isoforms of the Neks identified in mammals, seems to be involved in the etiology of the polycystic kidney disease (PKD) in humans because the deletion of Nek1 in animals causes a disease like PKD. Moreover, there are evidences about its participation in DNA repair in response to ionizing radiation and about its interaction with proteins involved in routes of repair and the mammals cell cycle regulation, but little is known about its role in the human cells physiology. The aim of this study was evaluating a possible role of Nek1 in the DNA repair. The sensitivity of the lines to genotoxic agents were tested by comet assay in alkaline pH and also by cell proliferation MTT assay of. For this, we used human embryonic kidney Hek293t of and human glioma U87 cell lines. These cells were silenced by a system that uses lentiviral vector with a green fluorescent protein (GFP) as a marker. The selection of the Nek negative cells lines was made by isolation of colonies GFP positive. The cells used as a control in this work also expressed GFP. The cells were treated by hydrogen peroxide, methyl-methanesulphonate and cisplatin. The results showed a delay in the silenced cells repair when treated with hydrogen peroxide and methyl-methanesulphonate. After the treatment with cisplatin, the silenced cells DNA presented a different pattern of migration, typical of the type of crosslink damage. This aspect remained up to 4 hours after exposure to cisplatin, when the appearance of tail began to become predominant in the cells observed. Our study also showed greater silenced line sensitivity to the wild when treated with the three agents by 24, 48 and 72h of treatment. Our results indicate that the Nek1 absence causes changes in the normal DNA damage repair and increased sensitivity to genotoxic stress, but apparently it is not essential for repair signaling because, even with delay, cells still repair the DNA damages. These effects may be occurring due to a deficiency in the process of DNA breaks repair that are held by recombination mechanisms. Meanwhile, Nek1 could be acting in DNA damage repair indirectly through the regulation of the cell cycle, since the occurrence of an injury in the genetic material can change the cell cycle, causing a stop. It is too early to say whether the Nek1 is working directly in the control of cell cycle or in routes for the repair or even in both. Understanding how this protein works in vivo can assist in the study of the etiology of PKD and in the understanding of diseases associated with lesions in the genetic material.

As Nek são proteínas cinases humanas evolutivamente conservadas e estruturalmente relacionadas à NIMA, um regulador mitótico descrito em Aspergillus nidulans. A Nek1, uma das onze isoformas das Neks identificadas em mamíferos, parece estar envolvida na etiologia da Doença Policística do Rim (PKD) em humanos, pois sua deleção em animais causa uma síndrome semelhante à PKD. Além disso, existem evidências sobre sua participação no reparo ao DNA em resposta à radiação ionizante e sobre sua interação com proteínas envolvidas em rotas de reparo e na regulação do ciclo celular de mamífero, mas pouco se sabe sobre seu papel na fisiologia das células de mamíferos. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel da Nek1 no reparo de DNA. A sensibilidade dae linhagens celulares aos agentes genotóxicos foram testados pelo ensaio cometa em pH alcalino e também por meio do ensaio de proliferação celular MTT. Para isso, utilizamos a linhagem de rim Hek293t e de glioma humano U87. Essas células foram silenciadas através de um sistema lentiviral estável que usa a proteína fluorescente verde (GFP) como marcador. A seleção das linhagens Nek-negativas foi feita por isolamento de colônias GFP-positivas. As células utilizadas como controle nesse trabalho também expressavam GFP além da Nek1. As células foram testadas com os agentes indutores de danos ao DNA metil-metanosulfonato, peróxido de hidrogênio e cisplatina. Os resultados mostraram o retardo no reparo de células silenciadas tratadas com peróxido de hidrogênio e metil-metanosulfonato. Após o tratamento com cisplatina, o DNA das células silenciadas apresentou um padrão de migração diferente, característico de lesões do tipo ligações cruzadas (crosslink). Esse aspecto permaneceu até 4 horas após a exposição à cisplatina, quando o aspecto de cauda começou a tornar-se mais predominante entre as células observadas. Nosso estudo também mostrou maior sensibilidade da linhagem silenciada em relação à selvagem quando tratadas com esses três agentes por 24, 48 e 72 h de tratamento. Portanto, nossos resultados indicam que a ausência da Nek1 provoca alterações no reparo normal de danos ao DNA e aumento da sensibilidade ao estresse genotóxico, mas aparentemente ela não é essencial para a sinalização do reparo, uma vez que, mesmo com o retardo, as células acabam conseguindo reparar o dano causado. Esses efeitos podem estar ocorrendo devido a uma deficiência nas vias de reparo de quebras no DNA que são realizadas por mecanismos de recombinação. Por outro lado, a Nek1 poderia estar atuando no reparo DNA lesado indiretamente através da regulação do ciclo celular, uma vez que a ocorrência de uma lesão no material genético pode alterar o ciclo celular, causando uma parada. Ainda é cedo para afirmar se a Nek1 está atuando diretamente no controle do ciclo celular ou em rotas de reparo ou até mesmo nas duas. Entender como essa proteína funciona in vivo pode auxiliar no estudo da etiologia da Doença Policística do Rim bem como no entendimento de patologias associadas a lesões no material genético. / NIMA related kinases (Neks) are evolutionarily conserved proteins structurally related to the Aspergillus nidulans mitotic regulator NIMA. The Nek1, one of the eleven isoforms of the Neks identified in mammals, seems to be involved in the etiology of the polycystic kidney disease (PKD) in humans because the deletion of Nek1 in animals causes a disease like PKD. Moreover, there are evidences about its participation in DNA repair in response to ionizing radiation and about its interaction with proteins involved in routes of repair and the mammals cell cycle regulation, but little is known about its role in the human cells physiology. The aim of this study was evaluating a possible role of Nek1 in the DNA repair. The sensitivity of the lines to genotoxic agents were tested by comet assay in alkaline pH and also by cell proliferation MTT assay of. For this, we used human embryonic kidney Hek293t of and human glioma U87 cell lines. These cells were silenced by a system that uses lentiviral vector with a green fluorescent protein (GFP) as a marker. The selection of the Nek negative cells lines was made by isolation of colonies GFP positive. The cells used as a control in this work also expressed GFP. The cells were treated by hydrogen peroxide, methyl-methanesulphonate and cisplatin. The results showed a delay in the silenced cells repair when treated with hydrogen peroxide and methyl-methanesulphonate. After the treatment with cisplatin, the silenced cells DNA presented a different pattern of migration, typical of the type of crosslink damage. This aspect remained up to 4 hours after exposure to cisplatin, when the appearance of tail began to become predominant in the cells observed. Our study also showed greater silenced line sensitivity to the wild when treated with the three agents by 24, 48 and 72h of treatment. Our results indicate that the Nek1 absence causes changes in the normal DNA damage repair and increased sensitivity to genotoxic stress, but apparently it is not essential for repair signaling because, even with delay, cells still repair the DNA damages. These effects may be occurring due to a deficiency in the process of DNA breaks repair that are held by recombination mechanisms. Meanwhile, Nek1 could be acting in DNA damage repair indirectly through the regulation of the cell cycle, since the occurrence of an injury in the genetic material can change the cell cycle, causing a stop. It is too early to say whether the Nek1 is working directly in the control of cell cycle or in routes for the repair or even in both. Understanding how this protein works in vivo can assist in the study of the etiology of PKD and in the understanding of diseases associated with lesions in the genetic material.

As Nek são proteínas cinases humanas evolutivamente conservadas e estruturalmente relacionadas à NIMA, um regulador mitótico descrito em Aspergillus nidulans. A Nek1, uma das onze isoformas das Neks identificadas em mamíferos, parece estar envolvida na etiologia da Doença Policística do Rim (PKD) em humanos, pois sua deleção em animais causa uma síndrome semelhante à PKD. Além disso, existem evidências sobre sua participação no reparo ao DNA em resposta à radiação ionizante e sobre sua interação com proteínas envolvidas em rotas de reparo e na regulação do ciclo celular de mamífero, mas pouco se sabe sobre seu papel na fisiologia das células de mamíferos. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel da Nek1 no reparo de DNA. A sensibilidade dae linhagens celulares aos agentes genotóxicos foram testados pelo ensaio cometa em pH alcalino e também por meio do ensaio de proliferação celular MTT. Para isso, utilizamos a linhagem de rim Hek293t e de glioma humano U87. Essas células foram silenciadas através de um sistema lentiviral estável que usa a proteína fluorescente verde (GFP) como marcador. A seleção das linhagens Nek-negativas foi feita por isolamento de colônias GFP-positivas. As células utilizadas como controle nesse trabalho também expressavam GFP além da Nek1. As células foram testadas com os agentes indutores de danos ao DNA metil-metanosulfonato, peróxido de hidrogênio e cisplatina. Os resultados mostraram o retardo no reparo de células silenciadas tratadas com peróxido de hidrogênio e metil-metanosulfonato. Após o tratamento com cisplatina, o DNA das células silenciadas apresentou um padrão de migração diferente, característico de lesões do tipo ligações cruzadas (crosslink). Esse aspecto permaneceu até 4 horas após a exposição à cisplatina, quando o aspecto de cauda começou a tornar-se mais predominante entre as células observadas. Nosso estudo também mostrou maior sensibilidade da linhagem silenciada em relação à selvagem quando tratadas com esses três agentes por 24, 48 e 72 h de tratamento. Portanto, nossos resultados indicam que a ausência da Nek1 provoca alterações no reparo normal de danos ao DNA e aumento da sensibilidade ao estresse genotóxico, mas aparentemente ela não é essencial para a sinalização do reparo, uma vez que, mesmo com o retardo, as células acabam conseguindo reparar o dano causado. Esses efeitos podem estar ocorrendo devido a uma deficiência nas vias de reparo de quebras no DNA que são realizadas por mecanismos de recombinação. Por outro lado, a Nek1 poderia estar atuando no reparo DNA lesado indiretamente através da regulação do ciclo celular, uma vez que a ocorrência de uma lesão no material genético pode alterar o ciclo celular, causando uma parada. Ainda é cedo para afirmar se a Nek1 está atuando diretamente no controle do ciclo celular ou em rotas de reparo ou até mesmo nas duas. Entender como essa proteína funciona in vivo pode auxiliar no estudo da etiologia da Doença Policística do Rim bem como no entendimento de patologias associadas a lesões no material genético. / NIMA related kinases (Neks) are evolutionarily conserved proteins structurally related to the Aspergillus nidulans mitotic regulator NIMA. The Nek1, one of the eleven isoforms of the Neks identified in mammals, seems to be involved in the etiology of the polycystic kidney disease (PKD) in humans because the deletion of Nek1 in animals causes a disease like PKD. Moreover, there are evidences about its participation in DNA repair in response to ionizing radiation and about its interaction with proteins involved in routes of repair and the mammals cell cycle regulation, but little is known about its role in the human cells physiology. The aim of this study was evaluating a possible role of Nek1 in the DNA repair. The sensitivity of the lines to genotoxic agents were tested by comet assay in alkaline pH and also by cell proliferation MTT assay of. For this, we used human embryonic kidney Hek293t of and human glioma U87 cell lines. These cells were silenced by a system that uses lentiviral vector with a green fluorescent protein (GFP) as a marker. The selection of the Nek negative cells lines was made by isolation of colonies GFP positive. The cells used as a control in this work also expressed GFP. The cells were treated by hydrogen peroxide, methyl-methanesulphonate and cisplatin. The results showed a delay in the silenced cells repair when treated with hydrogen peroxide and methyl-methanesulphonate. After the treatment with cisplatin, the silenced cells DNA presented a different pattern of migration, typical of the type of crosslink damage. This aspect remained up to 4 hours after exposure to cisplatin, when the appearance of tail began to become predominant in the cells observed. Our study also showed greater silenced line sensitivity to the wild when treated with the three agents by 24, 48 and 72h of treatment. Our results indicate that the Nek1 absence causes changes in the normal DNA damage repair and increased sensitivity to genotoxic stress, but apparently it is not essential for repair signaling because, even with delay, cells still repair the DNA damages. These effects may be occurring due to a deficiency in the process of DNA breaks repair that are held by recombination mechanisms. Meanwhile, Nek1 could be acting in DNA damage repair indirectly through the regulation of the cell cycle, since the occurrence of an injury in the genetic material can change the cell cycle, causing a stop. It is too early to say whether the Nek1 is working directly in the control of cell cycle or in routes for the repair or even in both. Understanding how this protein works in vivo can assist in the study of the etiology of PKD and in the understanding of diseases associated with lesions in the genetic material.

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Programa de Pós-Graduação em Saúde e Nutrição. Escola de Nutrição, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-05-20T21:01:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoPotencialAntioxidanteLicopeno.pdf: 1200572 bytes, checksum: e394f89e5e877613399c2cb53ae6440a (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-05-22T14:57:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoPotencialAntioxidanteLicopeno.pdf: 1200572 bytes, checksum: e394f89e5e877613399c2cb53ae6440a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-22T14:57:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoPotencialAntioxidanteLicopeno.pdf: 1200572 bytes, checksum: e394f89e5e877613399c2cb53ae6440a (MD5) Previous issue date: 2015 / Carcinogênese é um processo multipassos que pode ser induzido e/ou modulado por agentes químicos ou físicos, incluindo aqueles que induzem espécies reativas de oxigênio (EROs). Estas espécies são geradas a partir de uma grande variedade de processos como a respiração mitocondrial e a NADPH oxidase. A produção excessiva de EROs pode oxidar biomoléculas e facilitar processos relacionados com a carcinogênese. Em baixas doses, estas moléculas podem agir como importantes mediadores do crescimento celular, adesão, diferenciação e apoptose. As EROs podem, por exemplo, modular a via da PKC. PKC é uma família de serina-treonina cinases que regulam uma variedade de funções celulares. A ativação aberrante da PKC está relacionada a doenças como o câncer e o diabetes. A PKC pode ser ativada por EROs e a produção de EROs pode requerer a ativação da PKC porque essas cinases tem um papel na ativação da NADPH oxidase. Dessa forma, a ativação da PKC e da NADPH oxidase podem elevar os níveis de EROs, causando danos celulares. Estas reações potencialmente deletérias podem ser controladas por um sistema de antioxidantes enzimáticos (superóxido dismutase - SOD e catalase - CAT) e não enzimáticos (flavonóides e carotenóides). O licopeno é um carotenóide de coloração vermelha que está presente em vários vegetais e frutas. Trata-se de um dos antioxidantes mais potentes e tem demonstrado desempenhar um importante papel na prevenção de vários tipos de câncer, incluindo o hepatocarcinoma. Sendo assim, este estudo objetivou investigar o potencial antioxidante do licopeno e avaliar o efeito deste carotenóide na via da PKC, em células SK-Hep-1, uma linhagem de hepatocarcinoma altamente invasiva. O potencial antioxidante do licopeno foi examinado através da quantificação celular de EROs e das atividades das enzimas SOD e CAT. O efeito do licopeno na via da PKC foi examinado pela quantificação celular de EROs após estimulação com PMA e ionomicina. O papel da NADPH oxidase foi avaliado através da sua inibição com DPI, um inibidor desta enzima. Nossos resultados mostram que o DPI inibiu a produção de EROs, demonstrando a importância da enzima NADPH oxidase na geração de EROs na linhagem celular estudada. O licopeno diminuiu a produção basal de EROs e aumentou a atividade da SOD. Além disso, o licopeno inibiu a produção de EROs induzida por ionomicina e PMA. Estes resultados analisados em conjunto sugerem que um dos mecanismos antioxidantes do licopeno seja através da modulação da proteína cinase C. Entretanto, mais estudos são necessários para confirmar esta hipótese. _____________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Carcinogenesis is a multistep process which can be induced and/ or modulated by chemical and physical agents, including those that induce reactive oxygen species (ROS).These species are generated by a wide variety of processes like mitochondrial respiration and NADPH oxidase. The excessive generation of ROS might oxidize cellular biomolecules and facilitate carcinogenesis-related processes. In lower doses, these molecules can act as important mediators of cell growth, adhesion, differentiation and apoptosis. ROS can, for example, modulate the PKC pathway. PKC is a family of serine/threonine kinases that regulates a variety of cell functions. Aberrant PKC activation is related to diseases such as cancer and diabetes. PKC can be activated by ROS and ROS production can require PKC activation because these kinases have a role in NADPH oxidase activation. On this way, the PKC and NADPH oxidase activation might elevate intracellular levels of ROS causing damage. These potentially deleterious reactions can be controlled by a system of enzymatic (SOD and CAT) and nonenzymatic antioxidants (flavonoids and carotenoids). Lycopene is a red colored carotenoid present in many vegetables and fruits. It‟s one of the most potent antioxidants and has been shown to play an important role in preventing from various types of cancer, including hepatoma. This study aimed to investigate the antioxidant potential of lycopene and evaluate the effect of this carotenoid on PKC pathway, in SK-Hep-1 cells, a highly invasive hepatoma cell line. The antioxidant potential of lycopene was examined by quantification of cellular ROS and of SOD and CAT activities. The effect of lycopene on PKC pathway was examined by quantification of cellular ROS after stimulation with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin. The role of NADPH oxidase was examined by its inhibition with DPI, an NADPH oxidase inhibitor. Our results show that DPI inhibited ROS production, demonstrating the importance of NADPH oxidase in ROS generation in SK-Hep-1cell. Lycopene decreased basal ROS production and increased SOD activity. Furthermore, lycopene inhibit ROS by ionomycin and PMA-induced. Taken together, these results suggest lycopene antioxidant mechanisms are through modulation of protein kinase C. However, more studies are needed to confirm this hypothesis.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T19:58:00Z No. of bitstreams: 1 Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T19:58:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os parasitos do gênero Leishmania são protozoários que se replicam em macrófagos após a infecção do hospedeiro vertebrado pelo vetor flebotomíneo. O controle da infecção depende basicamente do desenvolvimento de uma robusta resposta do tipo Th1 específica contra o parasito, e a IL-27 já foi descrita como uma citocina capaz de participar nos estágios inciais do comprometimento para Th1. Nesta tese, investigamos a função direta de IL-27 na interação macrófago/L.amazonensis, e observamos que esta citocina é expressa por macrófagos infectados pela L.amazonensis de maneira depentende de PKR e interferons do tipo I. Curiosamente, pacientes infectados por diversas espécies de Leishmania apresentam níveis menores de IL-27 no soro/plasma quando comparados aos controles. Ainda, a IL-27 promove a replicação de L.amazonensis tanto em macrófagos humanos quanto murinos. Buscando mapear as vias de sinalização envolvidas no aumento parasitário mediado pela IL-27, demonstramos que a IL-27 é capaz de induzir a ativação/fosforilação de PKR em macrófagos, e que o bloqueio desta enzima e até a deleção gênica, anulam o crescimento intracelular da Leishmania promovido pela IL-27. Ainda, demonstramos que a indução de IL-10 pela IL-27 é fortemente regulada pela PKR. Bloqueamos o receptor de IL-10 na superfície de macrófagos infectados pela Leishmania e observamos que esta citocina é a mediadora do aumento de L.amazonensis promovido pela IL-27. Finalmente, como IL-27 diminui a replicação do HIV-1, nós analisamos o papel desta citocina na co-infecção HIV-1/Leishmania através da exposição de macrófagos albergando estes patógenos à IL-27. Nós encontramos que esta interleucina não parece modular o crescimento parasitário neste modelo. Em conclusão, demonstramos que a IL-27 é um fator indutor do crescimento de L.amazonensis em macrófagos e parece contribuir significativamente na biologia deste parasito. / Leishmania is a protozoan parasite that replicates within macrophages after vertebrate infection by the sandfly vector. The infection control basically depends on the robust development of a specific Th1 response against the parasite, and Interleukin (IL)- 27 has been described as a cytokine able to participate in the early steps of Th1 commitment. Here, we addressed the function of IL-27 on the interplay between macrophages and L. amazonensis, and we observed that this cytokine is expressed by macrohpages infected by L.amazonensis and that expression is dependent on PKR and type I interferons. Curiously, patients harboring a variety of Leishmania species present lower levels of IL-27 in plasma/serum when compared to healthy individuals.Trying to map the signaling pathway involved in the IL-27-mediated Leishmania growth enhancement, we demonstrated that IL-27 is able to induce Protein Kinase R (PKR) activation/phosphorilation in macrophages, and that enzyme blockage, or even gene deletion, abrogates the intracellular Leishmania enhancement driven by IL-27. In addition, we showed that IL-10-induction by IL-27 is strongly regulated by PKR. We blocked IL-10 receptor on the surface of Leishmania-infected macrophages and we described that IL-10 is the critical mediator of IL-27-mediated L. amazonensis augmentation. To finish, IL-27 is known to diminish HIV-1 replication, thus, in order to investigate the role of this cytokine in HIV-1/Leishmania co-infection, we exposed macrophages harboring both pathogens to IL-27 and found that this interleukin does not seem to modulate parasite growth in this model. In conclusion, we found that IL-27 is an inducer of L.amazonensis growth inside macrophages and contributes with this parasite biology.

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva, caracterizada pela perda de neurônios corticais e subcorticais. Padrões patológicos da doença de Alzheimer incluem a presença de lesões neurofibrilares que consistem no acúmulo da proteína ?- amilóide e dos emaranhados neurofibrilares, decorrentes da hiperfosforilação da proteína Tau. Apenas dois grupos principais de fármacos são utilizados para o tratamento da DA, os inibidores colinesterásicos e antagonistas do receptor N-metil-D-aspartato. Entretanto, a fosforilação de proteínas pelas proteínas cinases constituem um dos principais mecanismos pelos quais as células se utilizam para regular seu metabolismo e demais funções e desequilíbrios nestas atividades estão relacionados a uma infinidade de doenças. O número elevado de isoformas de proteínas cinases 1 (CK1) encontradas na DA e sua associação em marcadores de lesões neurodegenerativas indicam sua participação nas etapas finais da degeneração, comum tanto à DA quanto a outras desordens neurodegenerativas. A abordagem da proteína CK1 como alvo terapêutico para a DA é promissora uma vez que os compostos usuais utilizados para diminuir a produção de ?-amilóide também bloqueiam a quebra de outras proteínas, causando graves efeitos colaterais. Cada vez mais as ferramentas de bioinformática vêm sendo utilizadas como auxílio na redução de custos e tempo para as pesquisas. Dentre estas técnicas destaca-se a triagem virtual, que reúne um conjunto de técnicas utilizadas de forma sequencial com o objetivo de selecionar compostos protótipos para os alvos desejados. Neste trabalho, foram utilizadas técnicas de triagem virtual baseada em ligantes e estrutura, a partir de uma base de 500 mil compostos, selecionando 35 compostos com perfil de atividade inibitória para a enzima CK1. Destes, os compostos 24, 25, 36, 39 41 e 42 apresentaram resultados significativos com relação ao potencial de inibição da enzima CK1?. Entre aqueles que já foram submetidos a ensaios de inibição enzimática, 25 apresentou seletividade para CK1?, com 40% de inibição. Para aqueles compostos com melhor potencial de inibição à concentração de 10 ?M será determinado o IC50 e uma extensa análise dos resultados será realizada futuramente. / Alzheimer\'s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by loss of cortical and subcortical neurons. Pathological patterns of Alzheimer\'s disease include the presence of neurofibrillary lesions consisting of the accumulation of amyloid-? protein and the neurofibrillary tangles, resulting of hyperphosphorylated Tau protein. Only two major groups of drugs are used for treatment of AD, cholinesterase inhibitors and antagonists of Nmethyl- D-aspartate receptor. The phosphorylation of proteins by protein kinases constitute one of the major mechanisms which cells use to regulate their metabolism and imbalances in these activities are related to a series of diseases. The high number of isoforms of protein kinase 1 (CK1) found in AD and its association with neurodegenerative markers of indicate their participation in the final stages of degeneration, common to both AD and other neurodegenerative disorders. The approach of CK1 protein as a therapeutic target for AD is promising as the usual compounds used to reduce the production of amyloid-? also block the breakdown of other proteins, causing severe side effects. Increasingly, bioinformatics tools have been used as an aid in reducing costs and time to research. Among these techniques highlights the virtual screening, which includes a set of techniques used sequentially with the aim of select compounds prototypes for the desired target. Ligand and structure-based virtual screening techniches from a 500 thousand database resulted in 35 selected with inhibitory profile for CK1 enzyme were used in this study. The compounds 24, 25, 36, 39 41 and 42 had significan potential for CK1? enzyme inhibition. Among those submitted to enzyme inhibition assays, compound 25 showed selectivity for CK1? , with 40 % inhibition. For those compounds with the best inhibitory concentration at 10 mM and the IC50 will be given an extensive analysis of the results will be held in the future .

Apesar dos grandes avanços na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, a produção de blastocistos se mantém ainda aquém do observado in vivo, indicando que melhorais ainda são necessárias no processo de PIV. A competência para o desenvolvimento de oócitos tem sido relacionada, entre outros fatores, à interrupção do período de capacitação. Foi sugerido que o bloqueio meiótico poderia permitir ao oócito um tempo adicional para adquirir a competência. Embora ainda não se tenha melhorado o desenvolvimento embrionário com esse procedimento, o bloqueio meiótico com inibidores de cinases dependentes de ciclinas (CDK), como a butirolactona I (BLI), pode ser uma ferramenta útil na compreensão do desenvolvimento do oócito. O presente trabalho teve por objetivo averiguar o efeito da inibição de CDK com BLI, para bloquear temporariamente a retomada da meiose, sobre fatores que controlam o ciclo celular meiótico de oócitos bovinos. Oócitos bovinos obtidos de abatedouros foram bloqueados em vesícula germinativa (VG) in vitro com 10 µM de BLI por 24 h (BVG - bloqueado imaturo). Parte desses oócitos foi depois maturada in vitro por mais 24 h (BMII - bloqueado maturado). Como controles foram utilizados oócitos recém-aspirados dos folículos (VG - controle imaturo) ou maturados in vitro sem bloqueio meiótico prévio (MII - controle maturado). Os diferentes grupos de oócitos foram avaliados quanto a: 1) expressão de RNAm dos componentes do MPF (p34cdc2 e ciclina B1) e da MAPK; 2) expressão das proteínas do MPF (p34cdc2 e ciclina B1) e MAPK (p44 e p42); 3) atividade das proteínas MPF e MAPK durante a maturação in vitro de oócito submetidos ou não ao bloqueio da meiose pré-maturação e 4) a localização subcelular das proteínas p34cdc2, ciclina B1 e MAPK nos oócitos. Foi observado que: 1) a abundância relativa do RNAm de p34cdc2 e MAPK reduziu-se com a maturação, enquanto a ciclina B1 menteve-se estável; o bloqueio meiótico manteve o mesmo padrão de acordo com o estádio de maturação; 2) as proteínas de p34cdc2 e MAPK mantiveram-se estáveis durante a maturação, enquanto a ciclina B1 não foi detectada em oócitos imaturos e o foi nos maturados; o bloqueio meiótico também manteve a expressão das proteínas de acordo com o estádio de maturação; 3) as atividades de MPF e MAPK foram pouco afetadas pelo bloqueio meiótico; 4) as proteínas foram todas detectadas no citoplasma dos oócitos imaturos (bloqueados ou não) e maturados (bloqueados ou não), sendo apenas a p34cdc2 também localizada no núcleo de oócitos imaturos (bloqueados ou não). Diante dos resultados conclui-se que o bloqueio da meiose mantém o mesmo padrão de expressão, atividade e localização subcelular do MPF e da MAPK em oócitos imaturos e maturados, sugerindo que a tradução das mensagens, a ativação das cinases e a distribuição das proteínas foram controladas de acordo com o estádio da meiose, não sendo afetadas pelo bloqueio. / Although there have been great improvements in in vitro production (IVP) of bovine embryos, blastocyst production is still beyond that observed in vivo, indicating that more improvements are necessary in the IVP system. Developmental competence of oocytes has been related to, among other factors, the interruption in oocyte capacitation. Is has been suggested that meiosis block would allow the oocyte additional time to acquire competence. Although this procedure has not been successful in increasing embryo development, meiosis block with cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors, such as butyrolactone I (BLI) can be a useful tool to study oocyte development. The present study aimed to assess the effects CDK inhibition with BLI, to temporarily block meiosis resumption, on factors involved in meiosis cell cycle control in bovine oocytes. Oocytes, obtained form slaughterhouse ovaries, were maintained in germinal vesicle (GV) arrest in vitro with 10 µM BLI for 24 h (BVG - blocked immature). A part of these oocytes was matured in vitro for another 24 h (BMII - blocked and matured). As controls, oocytes were also assessed soon after follicle aspiration (GV -immature control) or matured in vitro for 24 h without prior meiosis block (MII - matured control). The different groups of oocytes were assessed for: 1) mRNA expression for the MPF components (p34cdc2 and cyclin B1) and MAPK; 2) expression of MPF (p34cdc2 and cyclin B1) and MAPK (p44 and p42) proteins; 3) MPF and MAPK activities during maturation of oocytes submitted or not to prematuration meiosis block and 4) p34cdc2, cyclin B1 and MAPK subcellular localization within oocytes. During the study it was observed that: 1) relative abundance of p34cdc2 and MAPK mRNA was reduced after maturation, while cyclin B1 mRNA remained stable; meiosis block maintained the same pattern according to maturation stage; 2) p34cdc2 and MAPK proteins remained stable after maturation while cyclin B1 protein was undetected in immature oocytes and detected in the matured ones; meiosis block also maintained the same protein expression according to maturation stage; 3) MPF and MAPK activities were little affected by meiosis block and 4) all proteins were detected in the cytoplasm of immature (blocked or not) and matured (blocked or not) oocytes, and only showed a specific nuclear localizations in immature oocytes (blocked or not). According to the results it may be concluded that meiosis block maintained the same pattern of MPF and MAPK expression, activity and subcellular localization in immature and matured oocytes, suggesting that mRNA translation, kinase activation and protein distribution were controlled according to the maturation stage and were not affected by meiosis block.

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva, caracterizada pela perda de neurônios corticais e subcorticais. Padrões patológicos da doença de Alzheimer incluem a presença de lesões neurofibrilares que consistem no acúmulo da proteína ?- amilóide e dos emaranhados neurofibrilares, decorrentes da hiperfosforilação da proteína Tau. Apenas dois grupos principais de fármacos são utilizados para o tratamento da DA, os inibidores colinesterásicos e antagonistas do receptor N-metil-D-aspartato. Entretanto, a fosforilação de proteínas pelas proteínas cinases constituem um dos principais mecanismos pelos quais as células se utilizam para regular seu metabolismo e demais funções e desequilíbrios nestas atividades estão relacionados a uma infinidade de doenças. O número elevado de isoformas de proteínas cinases 1 (CK1) encontradas na DA e sua associação em marcadores de lesões neurodegenerativas indicam sua participação nas etapas finais da degeneração, comum tanto à DA quanto a outras desordens neurodegenerativas. A abordagem da proteína CK1 como alvo terapêutico para a DA é promissora uma vez que os compostos usuais utilizados para diminuir a produção de ?-amilóide também bloqueiam a quebra de outras proteínas, causando graves efeitos colaterais. Cada vez mais as ferramentas de bioinformática vêm sendo utilizadas como auxílio na redução de custos e tempo para as pesquisas. Dentre estas técnicas destaca-se a triagem virtual, que reúne um conjunto de técnicas utilizadas de forma sequencial com o objetivo de selecionar compostos protótipos para os alvos desejados. Neste trabalho, foram utilizadas técnicas de triagem virtual baseada em ligantes e estrutura, a partir de uma base de 500 mil compostos, selecionando 35 compostos com perfil de atividade inibitória para a enzima CK1. Destes, os compostos 24, 25, 36, 39 41 e 42 apresentaram resultados significativos com relação ao potencial de inibição da enzima CK1?. Entre aqueles que já foram submetidos a ensaios de inibição enzimática, 25 apresentou seletividade para CK1?, com 40% de inibição. Para aqueles compostos com melhor potencial de inibição à concentração de 10 ?M será determinado o IC50 e uma extensa análise dos resultados será realizada futuramente. / Alzheimer\'s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by loss of cortical and subcortical neurons. Pathological patterns of Alzheimer\'s disease include the presence of neurofibrillary lesions consisting of the accumulation of amyloid-? protein and the neurofibrillary tangles, resulting of hyperphosphorylated Tau protein. Only two major groups of drugs are used for treatment of AD, cholinesterase inhibitors and antagonists of Nmethyl- D-aspartate receptor. The phosphorylation of proteins by protein kinases constitute one of the major mechanisms which cells use to regulate their metabolism and imbalances in these activities are related to a series of diseases. The high number of isoforms of protein kinase 1 (CK1) found in AD and its association with neurodegenerative markers of indicate their participation in the final stages of degeneration, common to both AD and other neurodegenerative disorders. The approach of CK1 protein as a therapeutic target for AD is promising as the usual compounds used to reduce the production of amyloid-? also block the breakdown of other proteins, causing severe side effects. Increasingly, bioinformatics tools have been used as an aid in reducing costs and time to research. Among these techniques highlights the virtual screening, which includes a set of techniques used sequentially with the aim of select compounds prototypes for the desired target. Ligand and structure-based virtual screening techniches from a 500 thousand database resulted in 35 selected with inhibitory profile for CK1 enzyme were used in this study. The compounds 24, 25, 36, 39 41 and 42 had significan potential for CK1? enzyme inhibition. Among those submitted to enzyme inhibition assays, compound 25 showed selectivity for CK1? , with 40 % inhibition. For those compounds with the best inhibitory concentration at 10 mM and the IC50 will be given an extensive analysis of the results will be held in the future .

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