Made available in DSpace on 2016-03-28T12:39:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bruno_alves_ioc_mest_2014.pdf: 1630885 bytes, checksum: 8913e4844c4acbc32212713a6c96f73c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Pacientes infectados pelo HIV-1 apresentam maior permeabilidade intestinal, a qual permite a passagem para a circulação sangüínea de elevada quantidade de produtos microbianos, fenômeno conhecido por translocação microbiana. Tal fenômeno induz crônica ativação do sistema imune, um dos principais mecanismos indutores da queda do número de linfócitos T CD4+ nos pacientes infectados. Dentre os produtos translocados encontram-se ligantes dos receptores tipo Toll (TLR), os quais reconhecem componentes microbianos e podem, portanto, ser ativados por uma grande variedade de patógenos. A ativação de TLR desencadeia uma complexa cascata de sinalização, induz a síntese de diversas citocinas, e modula a função de células dendríticas, macrófagos e linfócitos, células-alvo da infecção pelo HIV-1. Em estudos realizados em nosso laboratório vimos que a ativação de TLR2 resulta na inibição da replicação do HIV-1 em linfócitos e macrófagos, fenômeno este mediado pela citocina IL-10 e por \03B2-quimiocinas. No entanto, tendo em vista a potente resposta imunitária inata desencadeada pela ativação de TLRs, com a produção de ampla variedade de produtos inflamatórios, era possível que outros fatores, como a citocina IL-27, um potente inibidor da replicação do HIV-1, estivessem envolvidos na inibição da replicação viral gerada pela ativação deste receptor. Neste trabalho, investigamos se a IL-27 estaria envolvida na inibição da replicação induzida pela ativação de TLR2. Para tanto, tratamos macrófagos primarios humanos com agonistas de TLR2 para analisar a expressão e produção de IL-27 por qPCR e ELISA Nossos dados mostram que Pam3CSK4, ligante do dímero TLR2/TLR1, promoveu um aumento de expressão de EBI3 e p28 (subunidades da IL-27), e que Pam2CSK4 aumentou a expressão de EBI3. Os mesmos ligantes aumentaram nos níveis de IL-27p28 solúvel medidos por um kit de ELISA que detecta apenas a subunidade IL-27p28. Entretanto, a IL-27 em sua forma heterodimérica não foi encontrada quando um kit de ELISA capaz de detectar as duas subunidades da IL-27 foi utilizado. A seguir, observamos que a inibição da replicação do HIV-1 por ambos os ligantes de TLR2 foi significantemente revertida por anticorpos policlonais bloqueadores da IL-27. Da mesma forma, o bloqueio da via de MyD88, uma proteína adaptadora com papel na sinalização desencadeada pela maioria dos TLRs, o efeito anti HIV-1 de Pam2CSK4, mas não o de Pam3CSK4. Por que a inibição do HIV-1 mediada por IL-27 é dependente de Interferon tipo 1 (IFN-1), a expressão de IFN-1 e APOBEC3G (um gene estimulado por IFN-1 que inibe o HIV-1) também foi avaliada, e descobrimos que a expressão de nenhum dos dois genes foi modulada pela ativação de TLR2. Finalmente, a ativação de TLR2 induziu aumento na expressão de p35 e p40, subunidades de citocinas da família da IL-12/IL-27. Concluindo, nossos resultados sugerem que a subunidade p28 da IL-27 (IL-27p28) está implicada na redução da replicação do HIV-1 induzida por TLR2 em macrófagos humanos. Nosso estudo também abre caminho para a investigação do papel de outros membros da família de citocinas da IL-12 (como a IL-35) no controle da replicação do HIV-1 / HIV - 1 infected patient s present increased intestinal permeability , which allows the passage of microorganisms or microbial antigens to the blood, phenomenon known as microbial translocation . This phenomenon induces a chronic activation of the immune system of these patients, which is one of the main mechanisms contributing for the decrease of the CD4 + T cell number in HIV - 1 - infected patients . Among st the translocated products are several agonists of Toll like receptor (TLR), whic h recognize microbial component s and may , therefore , be activated by a large variety of pathogens . TL R activation triggers a complex signaling pathway , induces the synthesis of several cytokines , and modulates the function of dendritic cells, macrophages and lymphocytes , cells that are target for HIV - 1 infection . Studies performed in our laboratory show t hat TLR2 activation results in inhibition of HIV - 1 replication in lymphocytes and macrophages , a phenomenon mediated by IL - 10 and β - chemokines . However , because of the potent innate i m mune response triggered by TLR activation , resulting in the production of a wide variety of inflammatory molecules , it is possible that other factors contribute to reduce the HIV - 1 replication in this condition. In this study , we investigate whether the cytokine IL - 27, a potent inhibitor of HIV - 1 replication , could be involv ed in inhibition of HIV - 1 replication upon activation of TLR2 . Thus, h uman primary macrophages were treated with different TLR2 agonists in order to analyze the expression and production of IL - 27 by qPCR and ELISA. We found that Pam3CSK4 increased the expr ession of EBI3 and p28 (IL - 27 subunits ) , and Pam2CSK4 increased the expression of EBI3. The same ligands augmented the production of soluble IL - 27p28, as measured by an ELISA kit that detects only the IL - 27p28 subunit . However, the IL - 27 in its heterodi mer ic structure was not found when an ELISA kit able to detec t both IL - 27 subunits was used . Next, we observed that the inhibition of HIV - 1 replication induced by both TLR2 ligands was significantly reversed by anti - IL - 27 monoclonal antibodies. Likewise, the blockage of MyD88 pathway reduced (over 80%) the anti - HIV - 1 effect of Pam2CSK4 , but not the HIV - 1 inhibitory effect induced by Pam3CSK4. Because the IL - 27 - mediated HIV - 1 inhibition is dependent of Interferon type - 1 (IFN - 1), the expression of IFN - 1 and APOBEC3G (an IFN - 1 stimulated gene that inhibits HIV - 1) was also assessed, and we found that the expression of both genes was not modulated by TLR2 ligation. Finally, the TLR2 activation led to an enhanced expression of p35 and p40, subunits of the IL - 12/I L - 27 family of cytokines. In conclusion, our results suggest that the IL - 27 subunit p28 (I L - 27p28) is implicated in the TLR2 - induced reduction of HIV - 1 replication in primary human macrophages. Our study also warrants the investigation of the role of other members of IL - 12 family of cytokines (such as IL - 35) in the control of HIV - 1 replication.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T19:58:00Z No. of bitstreams: 1 Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T19:58:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os parasitos do gênero Leishmania são protozoários que se replicam em macrófagos após a infecção do hospedeiro vertebrado pelo vetor flebotomíneo. O controle da infecção depende basicamente do desenvolvimento de uma robusta resposta do tipo Th1 específica contra o parasito, e a IL-27 já foi descrita como uma citocina capaz de participar nos estágios inciais do comprometimento para Th1. Nesta tese, investigamos a função direta de IL-27 na interação macrófago/L.amazonensis, e observamos que esta citocina é expressa por macrófagos infectados pela L.amazonensis de maneira depentende de PKR e interferons do tipo I. Curiosamente, pacientes infectados por diversas espécies de Leishmania apresentam níveis menores de IL-27 no soro/plasma quando comparados aos controles. Ainda, a IL-27 promove a replicação de L.amazonensis tanto em macrófagos humanos quanto murinos. Buscando mapear as vias de sinalização envolvidas no aumento parasitário mediado pela IL-27, demonstramos que a IL-27 é capaz de induzir a ativação/fosforilação de PKR em macrófagos, e que o bloqueio desta enzima e até a deleção gênica, anulam o crescimento intracelular da Leishmania promovido pela IL-27. Ainda, demonstramos que a indução de IL-10 pela IL-27 é fortemente regulada pela PKR. Bloqueamos o receptor de IL-10 na superfície de macrófagos infectados pela Leishmania e observamos que esta citocina é a mediadora do aumento de L.amazonensis promovido pela IL-27. Finalmente, como IL-27 diminui a replicação do HIV-1, nós analisamos o papel desta citocina na co-infecção HIV-1/Leishmania através da exposição de macrófagos albergando estes patógenos à IL-27. Nós encontramos que esta interleucina não parece modular o crescimento parasitário neste modelo. Em conclusão, demonstramos que a IL-27 é um fator indutor do crescimento de L.amazonensis em macrófagos e parece contribuir significativamente na biologia deste parasito. / Leishmania is a protozoan parasite that replicates within macrophages after vertebrate infection by the sandfly vector. The infection control basically depends on the robust development of a specific Th1 response against the parasite, and Interleukin (IL)- 27 has been described as a cytokine able to participate in the early steps of Th1 commitment. Here, we addressed the function of IL-27 on the interplay between macrophages and L. amazonensis, and we observed that this cytokine is expressed by macrohpages infected by L.amazonensis and that expression is dependent on PKR and type I interferons. Curiously, patients harboring a variety of Leishmania species present lower levels of IL-27 in plasma/serum when compared to healthy individuals.Trying to map the signaling pathway involved in the IL-27-mediated Leishmania growth enhancement, we demonstrated that IL-27 is able to induce Protein Kinase R (PKR) activation/phosphorilation in macrophages, and that enzyme blockage, or even gene deletion, abrogates the intracellular Leishmania enhancement driven by IL-27. In addition, we showed that IL-10-induction by IL-27 is strongly regulated by PKR. We blocked IL-10 receptor on the surface of Leishmania-infected macrophages and we described that IL-10 is the critical mediator of IL-27-mediated L. amazonensis augmentation. To finish, IL-27 is known to diminish HIV-1 replication, thus, in order to investigate the role of this cytokine in HIV-1/Leishmania co-infection, we exposed macrophages harboring both pathogens to IL-27 and found that this interleukin does not seem to modulate parasite growth in this model. In conclusion, we found that IL-27 is an inducer of L.amazonensis growth inside macrophages and contributes with this parasite biology.

Produzida por macrófagos e células dendríticas, a IL-27 é uma citocina heterodimérica capaz de induzir células Tr1 produtoras de IL-10 e consequentemente regular linfócitos Th1, Th2 e Th17, dependendo da doença envolvida. Partindo-se do pressuposto de que a infecção causada por Trypanosoma cruzi normalmente induz miocardite refletida pela migração intensa de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco, nós analisamos o papel regulador da IL-27 nesta condição inflamatória. Nós inicialmente verificamos que a IL-27 foi prontamente induzida in vitro em células infectadas com T. cruzi. Para gerar miocardite intensa coordenada por linfócitos Th1, nós polarizamos linfócitos T naïves para o padrão Th1 na ausência de moléculas relacionadas ao perfil Th17 (camundongos IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-). Como esperado, a inflamação cardíaca intensa e o dano tecidual foram observados na ausência das moléculas do padrão Th17, o que contribuiu para a morte prematura dos animais IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-, precisa e notoriamente pela indução da migração excessiva de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco via CXCL-9 e CXCL-10. Para explorar os mecanismos pelos quais a IL-27 controla a miocardite induzida pelo T. cruzi, nós encontramos um recrutamento substancial de macrófagos produtores de IL-27 para o tecido cardíaco, o qual foi mediado pelas quimiocinas CCL3 e CCL4 na ausência de moléculas do padrão Th17. Para determinar quais os receptores necessários para a produção de IL-27, nós observamos que macrófagos derivados da medula óssea de camundongos deficientes de TLR4-/-, TLR9-/- e NLRP3-/- aboliram completamente a produção desta citocina após a infecção in vitro com T. cruzi, enquanto o receptor TLR2 foi dispensável. Nós também verificamos que macrófagos produtores de IL-27 suprimiram linfócitos Th1 através da indução de células Tr1 produtoras de IL-10 após a infecção com T. cruzi. Em seguida, nós avaliamos se a IL-27 foi correlacionada com a proteção cardíaca durante a doença de Chagas. Nós observamos níveis séricos elevados de IL-27 tanto em pacientes com a forma clínica indeterminada ou cardíaca leve, enquanto pacientes com cardiomiopatia moderada ou grave produziram níveis reduzidos de IL-27. Neste estudo, nós descrevemos um novo mecanismo regulador desempenhado por macrófagos produtores de IL-27 no controle da miocardite induzida por T. cruzi. Macrófagos produtores de IL-27 podem suprimir processos inflamatórios desencadeados por linfócitos Th1, os principais vilões na doença de Chagas. / IL-27 is a heterodimeric cytokine produced by macrophages and dendritic cells known to induce IL-10-producing Tr1 cells and to regulate Th1, Th2, and Th17 lymphocytes, depending on the underlying disease. Because the infection caused by Trypanosoma cruzi normally induces myocarditis mirrored by an outstanding migration of Th1 cells to the heart tissue, we analyzed the regulatory role of IL-27 in this inflammatory condition. We firstly verified that IL-27 was promptly induced by in vitro T. cruzi-infected spleen cells. To generate a robust myocarditis coordinated by Th1 lymphocytes, we polarized lymphocytes to a Th1 pattern by infecting mice in the absence of Th17-related molecules (IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice). As expected, an impressive cardiac inflammation and damage was observed in the absence of Th17-related molecules, leading IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice to the premature death, precisely and notably by inducing an exuberant Th1 migration to the heart tissue via CXCL9 and CXCL10 chemokines. To explore the mechanisms by which IL-27 controls T. cruzi-induced myocarditis, we found a striking recruitment of IL-27-producing macrophages to the heart tissue mediated by increased levels of CCL3 and CCL4 chemokines in the absence of Th17-associated molecules. To gain further insights into the receptors required to IL-27 production, we observed that bone marrow-derived macrophages from TLR4-/-, TLR9-/-, and NLRP3-/- mice completely abolished IL-27 production after in vitro T. cruzi infection, while TLR2 was dispensable. We also verified that IL-27-producing macrophages supressed Th1 lymphocytes by inducing IL-10-producing Tr1 cells after T. cruzi infection. We next assessed whether IL-27 was correlated to cardiac protection during Chagas Disease. We observed augmented serum levels of IL-27 in either patients with indeterminate (asymptomatic) form or mild cardiac form, whereas patients with moderate or severe cardiomyopathy were poor producers of IL-27. Here, we described a novel regulatory mechanism developed by IL-27-producing macrophages in the control of T. cruzi-induced myocarditis. IL-27-producing macrophages can suppress inflammatory processes caused by Th1 lymphocytes, the bona fide culprits of Chagas Disease.

Produzida por macrófagos e células dendríticas, a IL-27 é uma citocina heterodimérica capaz de induzir células Tr1 produtoras de IL-10 e consequentemente regular linfócitos Th1, Th2 e Th17, dependendo da doença envolvida. Partindo-se do pressuposto de que a infecção causada por Trypanosoma cruzi normalmente induz miocardite refletida pela migração intensa de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco, nós analisamos o papel regulador da IL-27 nesta condição inflamatória. Nós inicialmente verificamos que a IL-27 foi prontamente induzida in vitro em células infectadas com T. cruzi. Para gerar miocardite intensa coordenada por linfócitos Th1, nós polarizamos linfócitos T naïves para o padrão Th1 na ausência de moléculas relacionadas ao perfil Th17 (camundongos IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-). Como esperado, a inflamação cardíaca intensa e o dano tecidual foram observados na ausência das moléculas do padrão Th17, o que contribuiu para a morte prematura dos animais IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-, precisa e notoriamente pela indução da migração excessiva de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco via CXCL-9 e CXCL-10. Para explorar os mecanismos pelos quais a IL-27 controla a miocardite induzida pelo T. cruzi, nós encontramos um recrutamento substancial de macrófagos produtores de IL-27 para o tecido cardíaco, o qual foi mediado pelas quimiocinas CCL3 e CCL4 na ausência de moléculas do padrão Th17. Para determinar quais os receptores necessários para a produção de IL-27, nós observamos que macrófagos derivados da medula óssea de camundongos deficientes de TLR4-/-, TLR9-/- e NLRP3-/- aboliram completamente a produção desta citocina após a infecção in vitro com T. cruzi, enquanto o receptor TLR2 foi dispensável. Nós também verificamos que macrófagos produtores de IL-27 suprimiram linfócitos Th1 através da indução de células Tr1 produtoras de IL-10 após a infecção com T. cruzi. Em seguida, nós avaliamos se a IL-27 foi correlacionada com a proteção cardíaca durante a doença de Chagas. Nós observamos níveis séricos elevados de IL-27 tanto em pacientes com a forma clínica indeterminada ou cardíaca leve, enquanto pacientes com cardiomiopatia moderada ou grave produziram níveis reduzidos de IL-27. Neste estudo, nós descrevemos um novo mecanismo regulador desempenhado por macrófagos produtores de IL-27 no controle da miocardite induzida por T. cruzi. Macrófagos produtores de IL-27 podem suprimir processos inflamatórios desencadeados por linfócitos Th1, os principais vilões na doença de Chagas. / IL-27 is a heterodimeric cytokine produced by macrophages and dendritic cells known to induce IL-10-producing Tr1 cells and to regulate Th1, Th2, and Th17 lymphocytes, depending on the underlying disease. Because the infection caused by Trypanosoma cruzi normally induces myocarditis mirrored by an outstanding migration of Th1 cells to the heart tissue, we analyzed the regulatory role of IL-27 in this inflammatory condition. We firstly verified that IL-27 was promptly induced by in vitro T. cruzi-infected spleen cells. To generate a robust myocarditis coordinated by Th1 lymphocytes, we polarized lymphocytes to a Th1 pattern by infecting mice in the absence of Th17-related molecules (IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice). As expected, an impressive cardiac inflammation and damage was observed in the absence of Th17-related molecules, leading IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice to the premature death, precisely and notably by inducing an exuberant Th1 migration to the heart tissue via CXCL9 and CXCL10 chemokines. To explore the mechanisms by which IL-27 controls T. cruzi-induced myocarditis, we found a striking recruitment of IL-27-producing macrophages to the heart tissue mediated by increased levels of CCL3 and CCL4 chemokines in the absence of Th17-associated molecules. To gain further insights into the receptors required to IL-27 production, we observed that bone marrow-derived macrophages from TLR4-/-, TLR9-/-, and NLRP3-/- mice completely abolished IL-27 production after in vitro T. cruzi infection, while TLR2 was dispensable. We also verified that IL-27-producing macrophages supressed Th1 lymphocytes by inducing IL-10-producing Tr1 cells after T. cruzi infection. We next assessed whether IL-27 was correlated to cardiac protection during Chagas Disease. We observed augmented serum levels of IL-27 in either patients with indeterminate (asymptomatic) form or mild cardiac form, whereas patients with moderate or severe cardiomyopathy were poor producers of IL-27. Here, we described a novel regulatory mechanism developed by IL-27-producing macrophages in the control of T. cruzi-induced myocarditis. IL-27-producing macrophages can suppress inflammatory processes caused by Th1 lymphocytes, the bona fide culprits of Chagas Disease.