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Análise de mecanismos envolvidos no efeito inibitório sobre a replicação do HIV-1 resultante da ativação de TLR2Alves, Bruno Cister January 2014 (has links)
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Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Pacientes infectados pelo HIV-1 apresentam maior permeabilidade intestinal, a qual permite a passagem para a circulação sangüínea de elevada quantidade de produtos microbianos, fenômeno conhecido por translocação microbiana. Tal fenômeno induz crônica ativação do sistema imune, um dos principais mecanismos indutores da queda do número de linfócitos T CD4+ nos pacientes infectados. Dentre os produtos translocados encontram-se ligantes dos receptores tipo Toll (TLR), os quais reconhecem componentes microbianos e podem, portanto, ser ativados por uma grande variedade de patógenos. A ativação de TLR desencadeia uma complexa cascata de sinalização, induz a síntese de diversas citocinas, e modula a função de células dendríticas, macrófagos e linfócitos, células-alvo da infecção pelo HIV-1. Em estudos realizados em nosso laboratório vimos que a ativação de TLR2 resulta na inibição da replicação do HIV-1 em linfócitos e macrófagos, fenômeno este mediado pela citocina IL-10 e por \03B2-quimiocinas. No entanto, tendo em vista a potente resposta imunitária inata desencadeada pela ativação de TLRs, com a produção de ampla variedade de produtos inflamatórios, era possível que outros fatores, como a citocina IL-27, um potente inibidor da replicação do HIV-1, estivessem envolvidos na inibição da replicação viral gerada pela ativação deste receptor. Neste trabalho, investigamos se a IL-27 estaria envolvida na inibição da replicação induzida pela ativação de TLR2. Para tanto, tratamos macrófagos primarios humanos com agonistas de TLR2 para analisar a expressão e produção de IL-27 por qPCR e ELISA
Nossos dados mostram que Pam3CSK4, ligante do dímero TLR2/TLR1, promoveu um aumento de expressão de EBI3 e p28 (subunidades da IL-27), e que Pam2CSK4 aumentou a expressão de EBI3. Os mesmos ligantes aumentaram nos níveis de IL-27p28 solúvel medidos por um kit de ELISA que detecta apenas a subunidade IL-27p28. Entretanto, a IL-27 em sua forma heterodimérica não foi encontrada quando um kit de ELISA capaz de detectar as duas subunidades da IL-27 foi utilizado. A seguir, observamos que a inibição da replicação do HIV-1 por ambos os ligantes de TLR2 foi significantemente revertida por anticorpos policlonais bloqueadores da IL-27. Da mesma forma, o bloqueio da via de MyD88, uma proteína adaptadora com papel na sinalização desencadeada pela maioria dos TLRs, o efeito anti HIV-1 de Pam2CSK4, mas não o de Pam3CSK4. Por que a inibição do HIV-1 mediada por IL-27 é dependente de Interferon tipo 1 (IFN-1), a expressão de IFN-1 e APOBEC3G (um gene estimulado por IFN-1 que inibe o HIV-1) também foi avaliada, e descobrimos que a expressão de nenhum dos dois genes foi modulada pela ativação de TLR2. Finalmente, a ativação de TLR2 induziu aumento na expressão de p35 e p40, subunidades de citocinas da família da IL-12/IL-27. Concluindo, nossos resultados sugerem que a subunidade p28 da IL-27 (IL-27p28) está implicada na redução da replicação do HIV-1 induzida por TLR2 em macrófagos humanos. Nosso estudo também abre caminho para a investigação do papel de outros membros da família de citocinas da IL-12 (como a IL-35) no controle da replicação do HIV-1 / HIV
-
1 infected patient
s present increased intestinal permeability
, which
allows the
passage
of microorganisms or microbial antigens to the blood,
phenomenon known as
microbial translocation
.
This phenomenon induces
a
chronic activation of the immune system
of
these patients, which is one of the main mechanisms
contributing for
the
decrease
of the
CD4
+
T cell number
in
HIV
-
1
-
infected patients
.
Among
st
the translocated products are
several agonists of
Toll like receptor (TLR), whic
h recognize microbial component
s and may
,
therefore
,
be activated by a large variety of pathogens
.
TL
R activation triggers a complex
signaling pathway
,
induces the synthesis
of several cytokines
,
and modulates the function
of
dendritic cells, macrophages and lymphocytes
,
cells that are target
for HIV
-
1 infection
.
Studies performed in our laboratory show t
hat
TLR2
activation results in
inhibition of
HIV
-
1
replication in lymphocytes and macrophages
,
a phenomenon mediated
by IL
-
10 and
β
-
chemokines
.
However
,
because of
the potent innate i
m
mune response triggered by TLR
activation
,
resulting in
the production
of
a
wide variety of inflammatory molecules
,
it
is
possible that other factors
contribute to reduce the HIV
-
1 replication
in this condition.
In
this
study
, we investigate whether the cytokine
IL
-
27, a potent inhibitor of HIV
-
1 replication
,
could be
involv
ed in
inhibition of HIV
-
1
replication
upon activation of TLR2
.
Thus, h
uman
primary macrophages were treated with different TLR2 agonists in order to analyze the
expression and production of IL
-
27 by qPCR and ELISA. We found that Pam3CSK4
increased the expr
ession of EBI3 and p28 (IL
-
27 subunits
)
, and Pam2CSK4 increased
the
expression of
EBI3. The same ligands augmented the production of
soluble
IL
-
27p28, as
measured by an ELISA kit
that detects
only the
IL
-
27p28 subunit
.
However, the IL
-
27 in its
heterodi
mer
ic structure was not
found
when an ELISA
kit able to detec
t both IL
-
27 subunits
was used
.
Next,
we observed that the inhibition of HIV
-
1 replication induced by both TLR2
ligands was significantly reversed by anti
-
IL
-
27 monoclonal antibodies. Likewise, the
blockage of MyD88 pathway reduced (over 80%) the anti
-
HIV
-
1 effect of Pam2CSK4
, but
not the HIV
-
1 inhibitory effect induced by Pam3CSK4.
Because the IL
-
27
-
mediated HIV
-
1
inhibition is dependent of Interferon type
-
1 (IFN
-
1), the expression of IFN
-
1 and
APOBEC3G (an IFN
-
1 stimulated gene that inhibits HIV
-
1) was also assessed, and we found
that the expression of both genes was not modulated by TLR2 ligation. Finally, the TLR2
activation led to an enhanced expression of p35 and p40, subunits of the IL
-
12/I
L
-
27 family
of cytokines.
In conclusion, our results suggest that the IL
-
27 subunit p28 (I
L
-
27p28)
is
implicated in the TLR2
-
induced reduction of HIV
-
1 replication in primary human
macrophages. Our study also
warrants the investigation of the role of other
members of IL
-
12
family of cytokines (such as IL
-
35) in the control of HIV
-
1 replication.
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O papel da Interleucina 27 (IL-27) na replicação da Leishmania em Macrófagos / O papel da Interleucina 27 (IL-27) na replicação da Leishmania em MacrófagosRegis, Eduardo Garcia Necco Peixoto January 2012 (has links)
Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T19:58:00Z
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Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T19:58:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os parasitos do gênero Leishmania são protozoários que se replicam em
macrófagos após a infecção do hospedeiro vertebrado pelo vetor flebotomíneo. O
controle da infecção depende basicamente do desenvolvimento de uma robusta
resposta do tipo Th1 específica contra o parasito, e a IL-27 já foi descrita como uma
citocina capaz de participar nos estágios inciais do comprometimento para Th1. Nesta
tese, investigamos a função direta de IL-27 na interação macrófago/L.amazonensis, e
observamos que esta citocina é expressa por macrófagos infectados pela
L.amazonensis de maneira depentende de PKR e interferons do tipo I. Curiosamente,
pacientes infectados por diversas espécies de Leishmania apresentam níveis menores
de IL-27 no soro/plasma quando comparados aos controles. Ainda, a IL-27 promove a
replicação de L.amazonensis tanto em macrófagos humanos quanto murinos.
Buscando mapear as vias de sinalização envolvidas no aumento parasitário mediado
pela IL-27, demonstramos que a IL-27 é capaz de induzir a ativação/fosforilação de
PKR em macrófagos, e que o bloqueio desta enzima e até a deleção gênica, anulam o
crescimento intracelular da Leishmania promovido pela IL-27. Ainda, demonstramos
que a indução de IL-10 pela IL-27 é fortemente regulada pela PKR. Bloqueamos o
receptor de IL-10 na superfície de macrófagos infectados pela Leishmania e
observamos que esta citocina é a mediadora do aumento de L.amazonensis promovido
pela IL-27. Finalmente, como IL-27 diminui a replicação do HIV-1, nós analisamos o
papel desta citocina na co-infecção HIV-1/Leishmania através da exposição de
macrófagos albergando estes patógenos à IL-27. Nós encontramos que esta
interleucina não parece modular o crescimento parasitário neste modelo. Em conclusão,
demonstramos que a IL-27 é um fator indutor do crescimento de L.amazonensis em
macrófagos e parece contribuir significativamente na biologia deste parasito. / Leishmania is a protozoan parasite that replicates within macrophages after
vertebrate infection by the sandfly vector. The infection control basically depends on the
robust development of a specific Th1 response against the parasite, and Interleukin (IL)-
27 has been described as a cytokine able to participate in the early steps of Th1
commitment. Here, we addressed the function of IL-27 on the interplay between
macrophages and L. amazonensis, and we observed that this cytokine is expressed by
macrohpages infected by L.amazonensis and that expression is dependent on PKR and
type I interferons. Curiously, patients harboring a variety of Leishmania species present
lower levels of IL-27 in plasma/serum when compared to healthy individuals.Trying to
map the signaling pathway involved in the IL-27-mediated Leishmania growth
enhancement, we demonstrated that IL-27 is able to induce Protein Kinase R (PKR)
activation/phosphorilation in macrophages, and that enzyme blockage, or even gene
deletion, abrogates the intracellular Leishmania enhancement driven by IL-27. In
addition, we showed that IL-10-induction by IL-27 is strongly regulated by PKR. We
blocked IL-10 receptor on the surface of Leishmania-infected macrophages and we
described that IL-10 is the critical mediator of IL-27-mediated L. amazonensis
augmentation. To finish, IL-27 is known to diminish HIV-1 replication, thus, in order to
investigate the role of this cytokine in HIV-1/Leishmania co-infection, we exposed
macrophages harboring both pathogens to IL-27 and found that this interleukin does not
seem to modulate parasite growth in this model. In conclusion, we found that IL-27 is an
inducer of L.amazonensis growth inside macrophages and contributes with this parasite
biology.
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Participação do eixo Th17/IL-27 no controle da infecção experimental com Trypanosoma cruzi / Role of the Th17/IL-27 axis in the control of experimental Trypanosoma cruzi infectionMedina, Tiago da Silva 06 February 2014 (has links)
Produzida por macrófagos e células dendríticas, a IL-27 é uma citocina heterodimérica capaz de induzir células Tr1 produtoras de IL-10 e consequentemente regular linfócitos Th1, Th2 e Th17, dependendo da doença envolvida. Partindo-se do pressuposto de que a infecção causada por Trypanosoma cruzi normalmente induz miocardite refletida pela migração intensa de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco, nós analisamos o papel regulador da IL-27 nesta condição inflamatória. Nós inicialmente verificamos que a IL-27 foi prontamente induzida in vitro em células infectadas com T. cruzi. Para gerar miocardite intensa coordenada por linfócitos Th1, nós polarizamos linfócitos T naïves para o padrão Th1 na ausência de moléculas relacionadas ao perfil Th17 (camundongos IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-). Como esperado, a inflamação cardíaca intensa e o dano tecidual foram observados na ausência das moléculas do padrão Th17, o que contribuiu para a morte prematura dos animais IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-, precisa e notoriamente pela indução da migração excessiva de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco via CXCL-9 e CXCL-10. Para explorar os mecanismos pelos quais a IL-27 controla a miocardite induzida pelo T. cruzi, nós encontramos um recrutamento substancial de macrófagos produtores de IL-27 para o tecido cardíaco, o qual foi mediado pelas quimiocinas CCL3 e CCL4 na ausência de moléculas do padrão Th17. Para determinar quais os receptores necessários para a produção de IL-27, nós observamos que macrófagos derivados da medula óssea de camundongos deficientes de TLR4-/-, TLR9-/- e NLRP3-/- aboliram completamente a produção desta citocina após a infecção in vitro com T. cruzi, enquanto o receptor TLR2 foi dispensável. Nós também verificamos que macrófagos produtores de IL-27 suprimiram linfócitos Th1 através da indução de células Tr1 produtoras de IL-10 após a infecção com T. cruzi. Em seguida, nós avaliamos se a IL-27 foi correlacionada com a proteção cardíaca durante a doença de Chagas. Nós observamos níveis séricos elevados de IL-27 tanto em pacientes com a forma clínica indeterminada ou cardíaca leve, enquanto pacientes com cardiomiopatia moderada ou grave produziram níveis reduzidos de IL-27. Neste estudo, nós descrevemos um novo mecanismo regulador desempenhado por macrófagos produtores de IL-27 no controle da miocardite induzida por T. cruzi. Macrófagos produtores de IL-27 podem suprimir processos inflamatórios desencadeados por linfócitos Th1, os principais vilões na doença de Chagas. / IL-27 is a heterodimeric cytokine produced by macrophages and dendritic cells known to induce IL-10-producing Tr1 cells and to regulate Th1, Th2, and Th17 lymphocytes, depending on the underlying disease. Because the infection caused by Trypanosoma cruzi normally induces myocarditis mirrored by an outstanding migration of Th1 cells to the heart tissue, we analyzed the regulatory role of IL-27 in this inflammatory condition. We firstly verified that IL-27 was promptly induced by in vitro T. cruzi-infected spleen cells. To generate a robust myocarditis coordinated by Th1 lymphocytes, we polarized lymphocytes to a Th1 pattern by infecting mice in the absence of Th17-related molecules (IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice). As expected, an impressive cardiac inflammation and damage was observed in the absence of Th17-related molecules, leading IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice to the premature death, precisely and notably by inducing an exuberant Th1 migration to the heart tissue via CXCL9 and CXCL10 chemokines. To explore the mechanisms by which IL-27 controls T. cruzi-induced myocarditis, we found a striking recruitment of IL-27-producing macrophages to the heart tissue mediated by increased levels of CCL3 and CCL4 chemokines in the absence of Th17-associated molecules. To gain further insights into the receptors required to IL-27 production, we observed that bone marrow-derived macrophages from TLR4-/-, TLR9-/-, and NLRP3-/- mice completely abolished IL-27 production after in vitro T. cruzi infection, while TLR2 was dispensable. We also verified that IL-27-producing macrophages supressed Th1 lymphocytes by inducing IL-10-producing Tr1 cells after T. cruzi infection. We next assessed whether IL-27 was correlated to cardiac protection during Chagas Disease. We observed augmented serum levels of IL-27 in either patients with indeterminate (asymptomatic) form or mild cardiac form, whereas patients with moderate or severe cardiomyopathy were poor producers of IL-27. Here, we described a novel regulatory mechanism developed by IL-27-producing macrophages in the control of T. cruzi-induced myocarditis. IL-27-producing macrophages can suppress inflammatory processes caused by Th1 lymphocytes, the bona fide culprits of Chagas Disease.
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Participação do eixo Th17/IL-27 no controle da infecção experimental com Trypanosoma cruzi / Role of the Th17/IL-27 axis in the control of experimental Trypanosoma cruzi infectionTiago da Silva Medina 06 February 2014 (has links)
Produzida por macrófagos e células dendríticas, a IL-27 é uma citocina heterodimérica capaz de induzir células Tr1 produtoras de IL-10 e consequentemente regular linfócitos Th1, Th2 e Th17, dependendo da doença envolvida. Partindo-se do pressuposto de que a infecção causada por Trypanosoma cruzi normalmente induz miocardite refletida pela migração intensa de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco, nós analisamos o papel regulador da IL-27 nesta condição inflamatória. Nós inicialmente verificamos que a IL-27 foi prontamente induzida in vitro em células infectadas com T. cruzi. Para gerar miocardite intensa coordenada por linfócitos Th1, nós polarizamos linfócitos T naïves para o padrão Th1 na ausência de moléculas relacionadas ao perfil Th17 (camundongos IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-). Como esperado, a inflamação cardíaca intensa e o dano tecidual foram observados na ausência das moléculas do padrão Th17, o que contribuiu para a morte prematura dos animais IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-, precisa e notoriamente pela indução da migração excessiva de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco via CXCL-9 e CXCL-10. Para explorar os mecanismos pelos quais a IL-27 controla a miocardite induzida pelo T. cruzi, nós encontramos um recrutamento substancial de macrófagos produtores de IL-27 para o tecido cardíaco, o qual foi mediado pelas quimiocinas CCL3 e CCL4 na ausência de moléculas do padrão Th17. Para determinar quais os receptores necessários para a produção de IL-27, nós observamos que macrófagos derivados da medula óssea de camundongos deficientes de TLR4-/-, TLR9-/- e NLRP3-/- aboliram completamente a produção desta citocina após a infecção in vitro com T. cruzi, enquanto o receptor TLR2 foi dispensável. Nós também verificamos que macrófagos produtores de IL-27 suprimiram linfócitos Th1 através da indução de células Tr1 produtoras de IL-10 após a infecção com T. cruzi. Em seguida, nós avaliamos se a IL-27 foi correlacionada com a proteção cardíaca durante a doença de Chagas. Nós observamos níveis séricos elevados de IL-27 tanto em pacientes com a forma clínica indeterminada ou cardíaca leve, enquanto pacientes com cardiomiopatia moderada ou grave produziram níveis reduzidos de IL-27. Neste estudo, nós descrevemos um novo mecanismo regulador desempenhado por macrófagos produtores de IL-27 no controle da miocardite induzida por T. cruzi. Macrófagos produtores de IL-27 podem suprimir processos inflamatórios desencadeados por linfócitos Th1, os principais vilões na doença de Chagas. / IL-27 is a heterodimeric cytokine produced by macrophages and dendritic cells known to induce IL-10-producing Tr1 cells and to regulate Th1, Th2, and Th17 lymphocytes, depending on the underlying disease. Because the infection caused by Trypanosoma cruzi normally induces myocarditis mirrored by an outstanding migration of Th1 cells to the heart tissue, we analyzed the regulatory role of IL-27 in this inflammatory condition. We firstly verified that IL-27 was promptly induced by in vitro T. cruzi-infected spleen cells. To generate a robust myocarditis coordinated by Th1 lymphocytes, we polarized lymphocytes to a Th1 pattern by infecting mice in the absence of Th17-related molecules (IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice). As expected, an impressive cardiac inflammation and damage was observed in the absence of Th17-related molecules, leading IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice to the premature death, precisely and notably by inducing an exuberant Th1 migration to the heart tissue via CXCL9 and CXCL10 chemokines. To explore the mechanisms by which IL-27 controls T. cruzi-induced myocarditis, we found a striking recruitment of IL-27-producing macrophages to the heart tissue mediated by increased levels of CCL3 and CCL4 chemokines in the absence of Th17-associated molecules. To gain further insights into the receptors required to IL-27 production, we observed that bone marrow-derived macrophages from TLR4-/-, TLR9-/-, and NLRP3-/- mice completely abolished IL-27 production after in vitro T. cruzi infection, while TLR2 was dispensable. We also verified that IL-27-producing macrophages supressed Th1 lymphocytes by inducing IL-10-producing Tr1 cells after T. cruzi infection. We next assessed whether IL-27 was correlated to cardiac protection during Chagas Disease. We observed augmented serum levels of IL-27 in either patients with indeterminate (asymptomatic) form or mild cardiac form, whereas patients with moderate or severe cardiomyopathy were poor producers of IL-27. Here, we described a novel regulatory mechanism developed by IL-27-producing macrophages in the control of T. cruzi-induced myocarditis. IL-27-producing macrophages can suppress inflammatory processes caused by Th1 lymphocytes, the bona fide culprits of Chagas Disease.
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