Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-04T08:18:47Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7981213 bytes, checksum: aeec0f7b21a6f76f66efa6e3304727b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-04T08:18:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7981213 bytes, checksum: aeec0f7b21a6f76f66efa6e3304727b3 (MD5) Previous issue date: 2015-07-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A proteína NIK (NSP-interacting kinase), identificada por interagir com a proteína NSP (nuclear shuttle protein) de geminivírus, apresenta características estruturais, bioquímicas e biológicas condizentes com um autêntico receptor cinase envolvido na resposta de defesa à infecção por geminivírus. A ativação deste receptor imune resulta na fosforilação da proteína ribossomal L10 (RPL10) e na subsequente relocação nuclear desta proteína ribossomal. Apesar dos avanços obtidos com a identificação de RPL10, outras conexões moleculares que ligam a ativação de NIK à resposta antiviral ainda são desconhecidas, bem como a natureza deste mecanismo de defesa. Nesta investigação, foi identificado um novo componente efetor downstream da via de sinalização mediada por NIK, um fator de transcrição denominado LIMYB (L10-Interacting Myb domain-containing protein), isolado pela sua capacidade de interagir com RPL10 pelo sistema de duplo híbrido em leveduras. Ensaios de co-imunoprecipitação e de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) mostraram que o complexo RPL10-LIMYB ocorre estavelmente na planta, mais precisamente no núcleo das células vegetais. Estudos de caracterização funcional mostraram que LIMYB atua como um autêntico fator de transcrição, ligando-se ao promotor e inibindo a expressão de genes de proteínas ribossomais. Estes resultados sugerem que o mecanismo de defesa antiviral mediado por NIK baseia-se na supressão da tradução do hospedeiro. Para examinar esta hipótese, inicialmente foi avaliado os níveis de tradução em linhagens de tomate superexpressando um mutante superativo de AtNIK1 (T474D). Os resultados mostraram que as linhagens transgênicas apresentaram menor acúmulo de proteínas recentemente sintetizadas quando comparadas com plantas WT. Posteriormente, as linhagens de tomate superexpressando T474D foram infectadas com duas espécies de begomovírus altamente divergentes, ToYSV (Tomato yellow spot virus) e ToSRV (Tomato severe rugose virus). As linhagens transgênicas apresentaram sintomas atenuados ou foram assintomáticas. Estas observações foram associadas com um atraso na infecção viral, com taxas de infecção menores e com a redução no acúmulo de DNA viral em folhas sistêmicas infectadas. Apesar do fenótipo de tolerância exibido pelas linhagens superexpressando T474D e dos menores índices de síntese proteica, estas linhagens não apresentaram diferenças no desenvolvimento, no desempenho fisiológico e nas características horticulturais quando comparadas com plantas WT ou com linhagens superexpressando AtNIK1. Finalmente, foi determinado se a redução nos níveis de tradução global do hospedeiro causado pela superexpressão de T474D poderia prejudicar a síntese de proteínas virais. Para isto, frações polissomais foram isoladas a partir de linhagens WT e T474D infectadas com ToYSV e a presença de mRNA viral foi examinada nestas frações. Os resultados mostraram uma menor associação do mRNA que codifica a proteína do capsídeo viral nas frações de polissomos de linhagens T474D quando comparadas àquelas de linhagens não transformadas. Coletivamente, estes resultados indicam que begomovírus não são capazes de manter altos níveis de tradução de mRNA virais nas linhagens superexpressando o mutante T474D, indicando que a supressão global da síntese de proteínas, identificada nestes genótipos, pode proteger eficientemente as células contra a infecção por estes vírus. Entretanto, estudos da variação global na expressão gênica de plantas nik1 alelos nulos mostraram que a perda da função de NIK1 promoveu a indução de componentes do hub principal da sinalização a brassinosteróide e de hubs envolvidos na sinalização ao ácido salicílico e na imunidade antibacteriana. Estes resultados sugerem que NIK1 pode funcionar como um regulador negativo em vias de sinalização de desenvolvimento e imunidade, apesar de sua propriedade antiviral. / The NSP-interacting kinase (NIK) protein, identified through interaction with the geminivirus nuclear shuttle protein (NSP), displays structural, biochemical and biological characteristics consistent with an authentic receptor kinase involved in defense response against geminivirus infection. The activation of this immune receptor leads to phosphorilation of the ribosomal protein L10 (RPL10) and in the subsequent nuclear relocation of this ribosomal protein. Apart from the identification of RPL10 as a downtream component of the defense signaling, others molecular connections that link the NIK activation to the antiviral response, as well as the nature of this defense mechanism, remain to be determined. In this investigation, a new downstream effector component of the NIK-mediated signaling pathway, a transcription fator designated LIMYB (L10-Interacting Myb domain-containing protein), was identified by its capacity to interact with RPL10 through yeast two-hybrid system. Co-immunoprecipitation and bimolecular fluorescence complementation assays showed that RPL10-LIMYB complex occurs stably in the plant, specifically in the nucleus of plant cells. Functional characterization studies showed that LIMYB acts as an authentic transcription fator, binding to and inhibiting expression of ribosomal protein promoters. These results suggest that NIK-mediated antiviral defense mechanism is based on host translation suppression. To examine this hypothesis, the translation levels in tomato lines overexpressing the constitutively active mutant of AtNIK1 (T474D) was initially assessed. The results demonstrated that transgenic lines had lower accumulation of newly synthesized proteins when comparated to WT plants. Subsequently, T474D-overexpressing tomato lines were infected with two highly divergent begomovirus species, ToYSV (Tomato yellow spot virus) and ToSRV (Tomato severe rugose virus). The transgenic lines either displayed attenuated symptons or were asymptomatic. These findings were associated with delay in viral infections, lower infection rates and reduction in viral DNA accumulation in systemically infected leaves. Despite the tolerance phenotype and lower rates of protein synthesis displayed by T474D-overexpressing lines, no difference in the development, physiological performance and horticultural traits was observed between T474D-overexpressing and WT or AtNIK1-overexpressing lines. Finally, whether the reduction in overall levels of host translation caused by overexpression of T474D could affect the viral proteins synthesis was examined. For this purpose, polysomal fractions were isolated from WT and T474D lines infected with ToYSV and examined for the presence of viral mRNA. The results showed lower association of mRNA encoding viral capsid protein at the polysomes fractions of T474D lines when comparated to that of untransformed lines. Collectively, these results indicate that begomovirus are not able to maintain high levels of viral mRNA translation into T474D-overexpressing lines, indicating that the global suppression of the protein synthesis identified in these genotypes may efficiently protect cells against infection by these virus. However, studies of global changes in gene expression of nik1 null alleles revealed that loss of NIK1 function promoted induction of components of the main brassinosteroid signaling hub and of hubs involved in salicylic acid signaling and antibacterial immunity. These results suggest that NIK1 may function as a negative regulator in development and immunity signaling pathways, despite its antiviral property.