Orientador: Carlos Francisco Sampaio Bonafe / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T23:32:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vital_ClaudiaMariaRibeiro_M.pdf: 4992012 bytes, checksum: 4c245590f6b981aee5b05bbac96fe20e (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Investigou-se o efeito de baixa temperatura e diferentes concentrações de uréia combinados a alta pressão hidrostática (até 2,5 kbar) no Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV), um vírus cilíndrico com 40.000 kDa de massa molecular, composto de aproximadamente 2.130 cópias da proteína capsídica (17,5 kDa) envolvendo uma fita de RNA positiva. O vírus foi purificado a partir de folhas de tabaco previamente infectadas com TMV. Os efeitos da pressão foram investigados utilizando gel filtração, microscopia eletrônica (antes e depois de incubação em alta pressão), e métodos espectroscópicos como espalhamento de luz Rayleigh (para avaliar o estado de agregação), fluorescência intrínseca com estudo da intensidade de fluorescência e centro de massa do espectro de emissão (relacionado à ocorrência de desnaturação), e fluorescência extrínseca utilizando-se o Bis-(8-anilinonaftaleno-l-sulfonato) (Bis-ANS) como sonda de ambientes hidrofóbicos. Pressão até 2,5 kbar induziu dissociação a a = 18%, e o subseqüente abaixamento de temperatura até -19 °c promoveu dissociação adicional, levando a a 72%. Nessas condições não ocorreu mudança significativa do centro de massa do espectro de emissão, portanto sem desnaturação significativa. A sonda Bis-ANS interagiu mais intensamente com a proteína capsídica na fase de abaixamento de temperatura, sugerindo estrutura semelhante a "molten globule", e provável interação do Bis-ANS com resíduos positivos da proteína capsídica. Microscopia eletrônica e gel filtração mostraram que os produtos de dissociação são estáveis, ocorrendo reassociação após meses. O gráfico de van't Hoff permitiu calcular a entalpia (DH) e entropia (DS) de associação por subunidade deste sistema, respectivamente +8,23 kca/mol e + 50,26 cal/K mol, mostrando que a associação do TMV é um processo entropicamente dirigido Uréia induziu significativa dissociação do TMV, e a incubação em alta pressão promovel dissociação a graus mais elevados. Resultados de microscopia eletrônica e gel filtração foran concordantes com esses achados. A desnaturação do TMV à pressão atmosférica foi observada apenas a partir de concentrações de uréia de 4,0 M. Alta pressão induziu desnaturação do TMV em presença de uréia 2,5 M, com desvio para o vermelho do centro de massa a valores semelhantes ao: obtidos em presença de uréia 6,0 M. A variação de volume de associação calculada através da dissociação por pressão (DVp) diminuiu de 16,3 a 3,1 ml / mol subunidade dissociante respectivamente na ausência e na presença de uréia 2,5 M. Essa diferença sugere que a uréi: promove exposição de interfaces proteína-proteína no TMV. A variação de volume di desnaturação calculada através do centro de massa, DVdes , em presença de uréia 2,5 M, foi de 103,5 ml/mol subunidade desnaturada / Abstract: In this work it was investigated the effect of low temperature and different urea concentrations combined with high hydrostatic pressure (up to 2.5 kbar) on purified samples of Tobacco Mosaic Virus (TMV). The TMV is a single strand RNA (positive sense) virus, showing a cylindrical morphology. It holds a molecular mass of 40,000 kDa and about 2130 copies of the capsidic protein (17.5 kDa). The effect of high pressure on the virus particles was followed by gel filtration, electron microscopy studies and spectroscopic methods such as Rayleigh light scattering (to evaluate the aggregation state), intrinsic fluorescence with fluorescence intensity and center ofmass emission spectra (related to denaturation occurrence) studies, and extrinsic fluorescence by using of Bis-(8-anilinonaphthalene-l-sulfonate) (BisANS) as hydrofobic environrnent probe. Results indicated that incubation at 2.5 kbar have induced dissociation to a = 18%, and decreasing of temperature to -19°C have promoted additional dissociation to a = 72%. In such condition it did not occur significative change in the center of mass emission spectra, therefore without significative denaturation. The BisANS probe interacted more intensively with the capsidic protein in the decreasing temperature phase, suggesting similar structure to molten-glubule, and probable interaction of Bis-ANS with positive residues of the capsidic protein. Electron microscopy and gel filtration studies showed that the dissociation products are stable, occuring reassociation process after months. The plot of van't Hoff allowed calculating the enthalpy (DH) and entropy (DS) of association per subunit moI of that system, respectively of +8.23 kcal/mol and +50.26 cal/K mol, indicating that the TMV association is an entropic driving processo Urea induced significative dissociation of TMV samples, and the incubation at high pressure promoted dissociation at higher levels. Electron microscopy and gel filtration results were in agreement with that findings. The denaturation of TMV at atmospheric pressure was observed only at 4.0 M and higher urea concentrations. High pressure induced TMV denaturation in the presence of 2.5 M urea, followed by red shift of the mass center up to values similar to those obtained in the presence of 6.0 M urea. The volume change of association calculated by the pressure dissociation (DVp) decreased from 16.3 to 3.1 ml/mol subunit dissociated, respectively in the absence and presence of 2.5 M urea. Such difference suggests that urea induces exposure of the interface protein-protein in the TMV particle. The volume change of denaturation calculated by the center of mass , DVdes in the presence of 2.5 M urea was of 103.5 ml/mol subunit denaturated. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular