RESUMO A morte celular programada (PCD) é um processo vital que ocorre em todos os eucariotos. Em plantas, os mecanismos básicos que governam a PCD não estão esclarecidos. Sabe-se que a PCD em plantas é ativada pelo acúmulo de ácido salicílico e influxo de íons cálcio, bem como pela geração de ERO que ocorre nos cloroplastos e nas mitocôndrias. Além disso, as plantas possuem um grupo de proteases denominadas metacaspases, que assemelham-se estruturalmente com as caspases, proteínas que executam PCD em animais. Apesar destes conhecimentos, os mecanismos que governam a ativação da PCD são desconhecidos. Nesse contexto, o presente trabalho procurou investigar alguns fatores possivelmente envolvidos em PCD vegetal. Com esse objetivo, foram isoladas e caracterizadas mitocôndrias de cultura de células em suspensão de Rubus fruticosus. Foram avaliados os efeitos do Ca2+ e do AS sobre as funções mitocondriais, dentre elas a geração de ERO, diminuída pelo AS, porém aumentada por Ca2+. Um mecanismo foi proposto para explicar a diminuição de ERO pelo AS e as respostas observadas para AS e Ca2+ sobre as mitocôndrias são discutidas com base no possível envolvimento na PCD vegetal. A segunda parte do trabalho envolveu a expressão e caracterização de metacaspases (AtMCPs) em Arabidopsis thaliana. As proteases demonstraram autoprocessamento quando superexpressas in planta, assim como ocorre com as caspases em animais. A expressão de AtMCPs nesse modelo não produziu nenhum fenótipo de morte celular, sugerindo que o fenômeno ocorra por meio da integração de duas ou mais metacaspases. Foram estudadas também as propriedades biológicas de AtMCPs recombinantes em E. coli, demonstrando-se diferentes efeitos. Nossos estudos visam contribuir para a melhor compreensão de mecanismos básicos possivelmente envolvidos na PCD em plantas superiores. / ABSTRACT Programmed cell death (PCD) is a fundamental process that occurs in all eukaryotes. In plants, such phenomenon is not well understood. It is known that PCD in plants is activated through salicylic acid (SA) accumulation, Ca2+ ion fluxes, as well as reactive oxygen species (ROS) generation, which occurs mainly in chloroplasts and mitochondria. Besides, plants have a family of proteases, named metacaspases, which are proteases structurally similar to the caspases, members of proteins involved in animal PCD execution. In despite of this knowledge, the mechanism by which plant PCD is activated remains elusive. In this context, the aim of this work was to investigate some factors potentially involved in plant PCD. To this purpose, mitochondria from cell suspension cultures of Rubus fruticosus were isolated and characterized. It was investigated the effects of SA and Ca2+ on mitochondrial functions, as well. We have focused on ROS generation, which are important signals involved in plant PCD. It was shown that Ca2+ increased ROS generation, while SA decreases such production. A mechanism was proposed to explain the SA effects on isolated mitochondria, and the responses obtained from Ca2+ and SA addition on the organelle are discussed, based on the possible involvement of these effects in plant PCD. In the second part of this work, it was investigated the expression of metacaspases (AtMCPs) in the model plant Arabidopsis thaliana. The proteases have demonstrated self-processing when expressed in planta, similar to the animal caspases. Such expression did not cause any cell death phenotype, suggesting that PCD could be activated through the integration of two or more MCPs, if they are involved. It was investigated the effects of recombinant AtMCPs in E. coli, as well, demonstrating different responses. Our work contributes to a better understanding of factors potentially involved in plant PCD.

RESUMO A morte celular programada (PCD) é um processo vital que ocorre em todos os eucariotos. Em plantas, os mecanismos básicos que governam a PCD não estão esclarecidos. Sabe-se que a PCD em plantas é ativada pelo acúmulo de ácido salicílico e influxo de íons cálcio, bem como pela geração de ERO que ocorre nos cloroplastos e nas mitocôndrias. Além disso, as plantas possuem um grupo de proteases denominadas metacaspases, que assemelham-se estruturalmente com as caspases, proteínas que executam PCD em animais. Apesar destes conhecimentos, os mecanismos que governam a ativação da PCD são desconhecidos. Nesse contexto, o presente trabalho procurou investigar alguns fatores possivelmente envolvidos em PCD vegetal. Com esse objetivo, foram isoladas e caracterizadas mitocôndrias de cultura de células em suspensão de Rubus fruticosus. Foram avaliados os efeitos do Ca2+ e do AS sobre as funções mitocondriais, dentre elas a geração de ERO, diminuída pelo AS, porém aumentada por Ca2+. Um mecanismo foi proposto para explicar a diminuição de ERO pelo AS e as respostas observadas para AS e Ca2+ sobre as mitocôndrias são discutidas com base no possível envolvimento na PCD vegetal. A segunda parte do trabalho envolveu a expressão e caracterização de metacaspases (AtMCPs) em Arabidopsis thaliana. As proteases demonstraram autoprocessamento quando superexpressas in planta, assim como ocorre com as caspases em animais. A expressão de AtMCPs nesse modelo não produziu nenhum fenótipo de morte celular, sugerindo que o fenômeno ocorra por meio da integração de duas ou mais metacaspases. Foram estudadas também as propriedades biológicas de AtMCPs recombinantes em E. coli, demonstrando-se diferentes efeitos. Nossos estudos visam contribuir para a melhor compreensão de mecanismos básicos possivelmente envolvidos na PCD em plantas superiores. / ABSTRACT Programmed cell death (PCD) is a fundamental process that occurs in all eukaryotes. In plants, such phenomenon is not well understood. It is known that PCD in plants is activated through salicylic acid (SA) accumulation, Ca2+ ion fluxes, as well as reactive oxygen species (ROS) generation, which occurs mainly in chloroplasts and mitochondria. Besides, plants have a family of proteases, named metacaspases, which are proteases structurally similar to the caspases, members of proteins involved in animal PCD execution. In despite of this knowledge, the mechanism by which plant PCD is activated remains elusive. In this context, the aim of this work was to investigate some factors potentially involved in plant PCD. To this purpose, mitochondria from cell suspension cultures of Rubus fruticosus were isolated and characterized. It was investigated the effects of SA and Ca2+ on mitochondrial functions, as well. We have focused on ROS generation, which are important signals involved in plant PCD. It was shown that Ca2+ increased ROS generation, while SA decreases such production. A mechanism was proposed to explain the SA effects on isolated mitochondria, and the responses obtained from Ca2+ and SA addition on the organelle are discussed, based on the possible involvement of these effects in plant PCD. In the second part of this work, it was investigated the expression of metacaspases (AtMCPs) in the model plant Arabidopsis thaliana. The proteases have demonstrated self-processing when expressed in planta, similar to the animal caspases. Such expression did not cause any cell death phenotype, suggesting that PCD could be activated through the integration of two or more MCPs, if they are involved. It was investigated the effects of recombinant AtMCPs in E. coli, as well, demonstrating different responses. Our work contributes to a better understanding of factors potentially involved in plant PCD.