En el procés de transformació genètica tan sols un petit percentatge de cèl·lules accepta la integració de DNA forà mentre que la majoria de cèl·lules romanen com a no transgèniques. Habitualment s'introdueix juntament amb el gen d'interès un gen de selecció, que permet el creixement únicament de les cèl·lules transformades. Fins ara els gens de selecció més utilitzats són els que confereixen resistència a antibiòtics o a herbicides. A més dels possibles riscs sanitaris i/o mediambientals que pot comportar l'ús d'aquests gens (fins ara no demostrats) hi ha una normativa europea (EU 2001/18/EC) que en prohibeix l'ús. A nivell científic, la presència d'aquests gens és totalment prescindible un cop s'han seleccionat les cèl·lules transformades. Per tot això, en els darrers anys s'han establert diverses estratègies per eliminar els gens de selecció en plantes transgèniques. Aquest treball s'ha centrat en estudiar diferents vies de co-transformació de dos gens, el d'interès i el de selecció, amb la finalitat d'establir el millor sistema per obtenir per segregació de caràcters en la descendència, plantes transgèniques d'arròs (Oryza sativa L.) lliures de gens de selecció. S'han utilitzat gens marcadors de fàcil identificació com el gen gfp (green fluorescent protein), el gen bar (resistència al herbicida glufosinat d'amoni) i el gen uidA (?-glucuronidasa) per obtenir les taxes de co-transformació en T0 i per avaluar la segregació de caràcters en T1. S'han dissenyat diferents estratègies de co-transformació tan per Agrobacterium tumefaciens com per biolística.Mitjançant la transformació genètica per Agrobacterium tumefaciens s'ha provat a) la inoculació del call d'arròs amb dues poblacions d'Agrobacterium, cadascuna portadora d'un plàsmid amb un gen marcador diferent. Les inoculacions s'han realitzat simultàniament en el temps i deixant dos i cinc dies de decalatge entre una i altra; b) inoculació amb una soca d'Agrobacterium portadora de dos plàsmids, cadascun amb un gen marcador; i c) inoculació amb una soca d'Agrobacterium portadora d'un plàsmid amb dues regions de DNA de transferència, el doble T-DNA. Per biolística s'han realitzat experiments en què en comptes de disparar amb plàsmids sencers s'ha fet amb DNA monocatenari. Les aplicacions dels T-DNA monocatenaris es van realitzar simultàniament en el temps i amb decalatge de dos i cinc dies. Els resultats dels estudis de les estratègies portades a terme per Agrobacterium tumefaciens van ser els següents: inoculant simultàniament amb dos cultius bacterians es va obtenir una taxa de co-transformació baixa però suficient per permetre l'obtenció de plantes descendents que segreguin pels dos caràcters. En canvi, l'estratègia de deixar temps de decalatge entre les inoculacions no va afavorir la inserció del nou caràcter en un locus independent sinó que els resultats suggereixen que el teixit vegetal podria activar mecanismes de defensa que bloquegen una segona inserció de material genètic a curt termini. No va resultar efectiva l'estratègia d'inocular amb una soca bacteriana portadora de dos plàsmids diferents segurament per la gran similitud entre els dos plàsmids utilitzats, implicant el desplaçament d'un dels dos plàsmids i impossibilitant l'obtenció de plantes co-transformades. Tot i que caldria ajustar alguns paràmetres per obtenir els resultats esperats per biolística, s'ha demostrat la funcionalitat d'almenys un dels T-DNA monocatenaris. Finalment l'estratègia que va resultar més eficaç i viable va ser la del doble T-DNA, obtenint una taxa de co-transformació del 69'7% amb plantes que a més havien integrat en la majoria dels casos entre una i dues còpies de cada gen. La tècnica del doble T-DNA ens ha permès obtenir diverses línies homozigòtiques de plantes d'arròs portadores d'un dels gens marcadors lliures de gens de selecció. Aplicant la tècnica del doble T-DNA es va substituir un dels gens marcadors per un gen d'interès, el CryIB, que codifica per una endotoxina de Bacillus turingensis, que confereix resistència a la planta transgènica enfront al barrinador de l'arròs Chilo supressalis,. Amb l'estratègia del doble T-DNA es van obtenir plantes d'arròs amb el gen d'interès CryIB i sense gens de selecció.Un altre aspecte que s'ha abordat a la tesi és l'estudi de flux genètic entre plantes transgèniques d'arròs, plantes no transgèniques i arròs salvatge. En aquest sentit és va dissenyar un experiment en camp per confirmar els resultats obtinguts en assaigs anteriors sobre l'efecte de la distància i dels vents dominants en l'encreuament entre plantes transgèniques i plantes no transgèniques de la mateixa varietat d'arròs, així com avaluar la taxa d'encreuament amb l'arròs salvatge situat entremig del camp o bé a diferents distàncies. Els resultats obtinguts, juntament amb les característiques particulars de les varietats d'arròs suggereixen que la coexistència és possible entre cultius transgènics, tradicionals i ecològics d'arròs. Tanmateix, en el cas de l'arròs salvatge les mesures de coexistència hauran d'incloure, molt probablement, alguna estratègia que permeti minimitzar la presència d'aquesta mala herba als camps d'arròs. / In genetic transformation process only a few percentages of cells accept the integration of foreign DNA while most cells remain non-transformed. Usually a selection gene is introduced together with the gene of interest, allowing the growing of transformed cells only. Until now, the most frequently used selection genes are those that confer antibiotic or herbicide resistance. Apart from the potential health and/or environmental risks (presently still not demonstrated) there is a European regulatory law (EU 2001/18/EC) that forbids the use of antibiotic selection genes. At a scientific level, the presence of these kinds of genes is absolutely not necessary once the transformed cells have been selected. For all these reasons, some strategies have been established in recent years in order to eliminate the selection genes of transgenic plants. The aim of this thesis was to study different ways of co-transformation to obtain transgenic rice (Oryza sativa L.) without selection genes, throughout the segregation in the progeny. Easily identifiable reporter genes such as gfp (green fluorescent protein), bar (ammonium glufosinate resistance) and uidA (?-glucuronidase) have been used to obtain co-transformation ratios in the T0 and to evaluate characters segregating in the T1 generation. Different strategies of co-transformation by Agrobacterium tumefaciens as well as have been designed. By using Agrobacterium tumefaciens genetic transformation system we have tested a) inoculation of rice embriogènic callus with two populations of Agrobacterium, each one carrying a vector with a different reporter gene. The inoculations have taken place simultaneously and with a time range of two and five days between them; b) inoculation with one population of Agrobacterium tumefaciens carrying both types of vectors, each one with it's own reporter gene; and c) inoculation of an Agrobacterium population carrying a vector with two T-DNA regions, each one with a different reporter gene. By biolistics we have experimented shooting with single stranded fragments of DNA instead of whole plasmids. The applications of the single-stranded T-DNA have taken place simultaneously and in range of time of different days. The results obtained with the different Agrobacterium tumefaciens strategies were the following: by inoculating simultaneously with two bacterial cultures we had a low co-transformation ratio but this was enough to obtain plants in the progeny segregating for both characters. However, the range time strategy between different inoculations did not favor the insertion of the second T-DNA far from the first one. These results suggest that vegetal tissue could activate some defense mechanism that blocks a second introduction of genetic material in a short time. The strategy based in inoculating with an Agrobacterium population carrying two types of plasmids was not effective, probably due to the important similarity of the used plasmids that could lead to the high replication of one of them in comparison with the other one, making impossible to have co-transformed plants. Although it would be necessary to adjust some parameters to obtain the expected results by bioballistics, we have demonstrated the functionality of at least one of the single-stranded T-DNA shouted. Finally, the most effective strategy was the double T-DNA system that gave rise to a co-transformation ratio of 69.7% with plants that had integrated in the most part of them one to two copies of each gene. The double T-DNA system allowed us obtaining some homozygous rice plants carrying one of the reporter genes without selection gene. Applying the double T-DNA technique, one of the cassettes was substituted by a cassette carrying the CryIB gene that codifies for an endotoxin from Bacillus thuringensis, conferring resistance to the stem borer Chilo suppressalis. With this strategy we have obtained rice plants with the gene of interest CryIB and free from selection genes. Another aspect studied in this thesis was the gene flow between transgenic rice plants and conventional rice and the red rice weed. An experimental field has been designed to confirm the results obtained in previous experiments on the effect of distances and prevalent winds in cross-pollination between transgenic and non transgenic rice plants. Moreover, out-crossing between transgenic rice and the red rice weed placed into transgenic field or at different distances was studied. The obtained results, with the particular traits of rice cultivars, suggest that coexistence is possible between transgenic, traditional and organic rice cultivars. However, in the case of the red rice weed, the measures of coexistence would probably have to include some strategy that permit minimize the presence of that weed in rice fields.

Estressos abiòtics com la sequera i la salinitat són els factors ambientals més importants que limiten la productivitat dels cultius. Estratègies per millorar el creixement dels cultius sota condicions d'estrès abiòtic inclouen la millora convencional, la selecció assistida per marcadors, l'enginyeria genètica i l'aplicació de bioreguladors naturals o sintètics. Els bioreguladors naturals són hormones vegetals com l'àcid abscísic (ABA), citoquinines, giberelines i l’àcid jasmònic, mentre que els bioreguladors sintètics són productes químics que milloren el creixement de les plantes en condicions de camp. Els fitoprotectors són bioreguladors sintètics que selectivament protegeixen les plantes del cultiu, però no les males herbes dels herbicides induint de forma coordinada les vies de detoxificació d'herbicides. A més del seu paper directe en la detoxificació, alguns fitoprotectors també poden millorar el creixement de plantes en particular sota condicions d'estrès abiòtic. He avaluat un nombre de potencials bioreguladors sintètics sols o en combinació amb ABA per seleccionar les combinacions que milloren el creixement i la productivitat de l'arròs en condicions de sequera (o estrès hídric) moderada, però a llarg termini i d’estrès per salinitat, optimitzat en una cambra de creixement. L’agent fitoprotector ciprosulfamida sol o en combinació amb ABA s'ha trobat que promou el creixement de l'arròs sota condicions d’estrès salí, donant lloc a una floració avançada i a l'aparició de tiges noves. Aquestes respostes van estar absents o van ser molt més limitades en les plantes no tractades sotmeses a estrès. Experiments per desentranyar les bases moleculars de l'efecte de la ciprosulfamida han resultat en la identificació de gens que són potencialment responsables de la millora del rendiment de les plantes d'arròs sota estrès per salinitat. L'anàlisi proteòmic de les plantes d'arròs sense tractar i de les tractades amb ciprosulfamida i / o ABA en presència o absència d'estrès per salinitat ens ha permès identificar gens de resposta a l'estrès amb funcions relacionades amb la defensa, la destoxificació, l'energia, el metabolisme, la fotosíntesi, el plegament i el transport de proteïnes, entre d'altres. Curiosament, moltes proteïnes que eren modulades per l'exposició a estrès per salinitat també van ser modulades per ciprosulfamida o ciprosulfamida més ABA. Proposem que l’agent fitoprotector ciprosulfamida indueix gens de resposta a l'estrès abiòtic i preadapta les plantes per suportar les condicions d’estrès abiòtic. Tres gens que codifiquen per late embryogenesis abundant group 3 protein (OsLEA3), putative fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) i mitochondrial import inner membrane translocase (TIM) estan induïdes fortament per l'estrès salí, així com per ciprosulfamida o ciprosulfamida més ABA en l'absència d'estrès. Es va trobar una correlació positiva entre els perfils d'expressió génica determinada per la reacció en cadena de la polimerasa quantitativa o en temps real amb la transcriptasa inversa (qRT-PCR) i les dades de proteòmica. / Estreses abióticos como la sequía y la salinidad son los factores ambientales más importantes que limitan la productividad de los cultivos. Estrategias para mejorar el crecimiento de los cultivos bajo condiciones de estrés abiótico incluyen la mejora convencional, la selección asistida por marcadores, la ingeniería genética y la aplicación de biorreguladores naturales o sintéticos. Los biorreguladores naturales son hormonas vegetales como el ácido abscísico (ABA), citoquininas, giberelinas y ácido jasmónico, mientras que los biorreguladores sintéticos son productos químicos que mejoran el crecimiento de plantas en condiciones de campo. Safeners son biorreguladores sintéticos que selectivamente protegen a las plantas del cultivo pero no a las malas hierbas de los herbicidas, induciendo de forma coordinada todas las vías de detoxificación de herbicidas. Además de su papel directo en la detoxificación, algunos safeners también pueden mejorar el crecimiento de plantas en particular bajo condiciones de estrés abiótico. He evaluado diversos biorreguladores sintéticos candidatos, solos o en combinación con ABA para seleccionar las combinaciones que mejoren el crecimiento y la productividad del arroz en condiciones de sequía o salinidad moderada, pero a largo plazo, optimizado en una cámara de crecimiento. Cyprosulfamide solo o en combinación con ABA se ha encontrado que promueve el crecimiento del arroz bajo estrés por salinidad, dando lugar a una floración temprana y a la aparición de tallos nuevos. Estas respuestas eran ausentes o mucho más limitadas en las plantas no tratadas sometidas a estrés. Experimentos para desentrañar las bases moleculares de la actividad de cyprosulfamide resultaron en la identificación de genes que son potencialmente responsables de la mejora del rendimiento de las plantas de arroz bajo estrés por salinidad. El análisis proteómico de las plantas de arroz sin tratar y las tratadas con cyprosulfamide y / o ABA en presencia o ausencia de estrés por salinidad nos ha permitido identificar genes de respuesta a estrés con funciones relacionadas con la defensa, la detoxificación, la energía, el metabolismo, la fotosíntesis, el plegamiento de proteínas y el transporte de proteínas, entre otros. Curiosamente, muchas proteínas que eran moduladas por la exposición a estrés por salinidad también eran moduladas por cyprosulfamide o cyprosulfamide más ABA. Nosotros proponemos que el safener cyprosulfamide induce genes responsables de estrés abiótico y adapta a las plantas para soportar las condiciones de estrés abiótico. Tres genes que codifican late embryogenesis abundant group 3 protein (OsLEA3), putative fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) y mitochondrial import inner membrane translocase (TIM) fueron inducidas fuertemente por el estrés de salinidad, así como por cyprosulfamide o cyprosulfamide más ABA en la ausencia de estrés. También se vió una correlación positiva entre los perfiles de expresión genética determinada por la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real o cuantitativa con transcriptasa inversa (qRT-PCR) y los datos de proteómica. / Abiotic stresses such as drought and salinity are important environmental factors that limit crop productivity. Strategies to improve the growth of crops under abiotic stress conditions include conventional breeding, marker-assisted breeding, genetic engineering and the application of natural and synthetic bioregulators. Natural bioregulators include plant hormones such as abscisic acid (ABA), cytokinins, gibberellins and jasmonic acid, whereas synthetic bioregulators are chemical products that improve plant growth under field conditions. Safeners are synthetic bioregulators that selectively protect crop plants but not weeds from herbicides by coordinately inducing entire herbicide detoxification pathways. In addition to their direct role in detoxification, some safeners can also improve plant growth particularly under abiotic stress conditions. I evaluated a number of potential synthetic bioregulators alone or in combination with ABA to select the combinations that improved rice growth and productivity under mild but long-term drought and salinity stress conditions optimized in a growth chamber. Cyprosulfamide alone or in combination with ABA was found to promote rice growth under salinity stress, resulting in earlier flowering and the appearance of new tillers. These responses were either absent or much more limited in untreated plants under stress. Experiments to unravel the molecular basis of cyprosulfamide activity resulted in the identification of genes that were potentially responsible for the improved performance of rice plants under salinity stress. Proteomic analysis of untreated rice plants and those treated with cyprosulfamide and/or ABA in the presence or absence of salinity stress allowed us to identify stress-response genes with roles in defense, detoxification, energy, metabolism, photosynthesis, protein folding and protein transport among others. Interestingly, many proteins that were modulated by exposure to salinity stress were also modulated by cyprosulfamide or cyprosulfamide plus ABA. We propose that cyprosulfamide induces abiotic stress-response genes and pre-adapts the plants to withstand abiotic conditions. Three genes encoding a late embryogenesis abundant group 3 protein (OsLEA3), a putative fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) and a mitochondrial import inner membrane translocase (TIM) were strongly upregulated by salinity stress as well as by cyprosulfamide or cyprosulfamide plus ABA in the absence of stress. There was good agreement between gene expression profiles determined by quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction and the proteomic data.