As células produtoras de anticorpos desempenham um papel chave na resposta efetora a microrganismos, sendo o foco principal da maioria das vacinas existentes. Entretanto, elas podem ter efeitos deletérios em doenças autoimunes e na rejeição a transplantes. Apesar de grandes avanços no controle da resposta humoral, alguns desafios permanecem e neste contexto, novos alvos terapêuticos têm sido explorados. Sabe-se que alterações metabólicas decorrentes da ativação de células B estão intimamente relacionadas com a função efetora destas células, o que anteriormente se imaginava ser apenas um reflexo de crescimento e proliferação celular. Estas alterações são controladas por sensores metabólicos ativados logo após a ativação de células B, como o mTOR, o qual é componente central de dois complexos: mTORC1 e mTORC2. Estudos anteriores já reportaram o papel positivo exercido por mTOR na via glicolítica em células T, bem como na função efetora destas células. Aqui, nós formulamos a hipótese de que a via do mTOR favorece a via glicolítica em detrimento de OXPHOS em células B, e que estas alterações metabólicas impactam as funções efetoras das mesmas. Desta maneira, para investigarmos alterações nestas vias em decorrência de mTOR, células B foram isoladas de animais controle (CT), ou de animais com células B deficientes de mTORC1 (RaptorΔB) ou mTORC2 (RictorΔB) e então estimuladas com LPS (lipopolissacarídeo) in vitro. Nossos dados indicam que a deficiência de mTORC2 beneficia OXPHOS em detrimento da via gicolítica, bem como a ativação de células B e a formação de plasmablastos. Na sequência, confirmamos que a redução nas taxas de glicólise, assim como a elevação da oxidação lipídica e de OXPHOS são cruciais para manter a elevada ativação de células B e formação de plasmablastos a partir de células B RaptorΔB e RictorΔB. Constatou-se ainda que a produção total de IgM é elevada em células RictorΔB após estímulo com LPS. Entretanto, identificamos que isso é decorrente do aumento de plasmablastos formados e não da capacidade individual de secreção dos mesmos. Diferentemente das células B deficientes, observamos que plasmablastos RaptorΔB e RictorΔB reduzem a atividade mitocondrial. Na sequência, confirmamos que a atividade mitocondrial via oxidação lipídica é fundamental para a produção de anticorpos. Além disso, demonstramos que a deficiência de mTORC2 eleva a troca de isotipo, enquanto a de mTORC1 a diminui após estimulo com LPS e IL4. Posteriormente, o impacto da deficiência de mTORC2 em células B foi avaliado in vivo em modelo de transplante de pele. Neste caso, não observamos diferenças significativas na sobrevida do enxerto entre CT e RictorΔB, mas foi constatado que apesar de ambos apresentarem formação de plasmócitos similares, animais deficientes apresentaram um número significativamente menor de células B na periferia. Assim, concluímos que a deficiência de mTORC1 ou mTORC2 em células B implica em uma maior diferenciação de plasmablastos e em uma maior produção total de anticorpos em RictorΔB in vitro, enquanto um papel funcional para essas moléculas no contexto das células B in vivo ainda precise ser determinado. / Antibodies are produced by Antibody Secreting Cells (ASCs), which are essential to fight infections. They are also the basis of most successful vaccines available, however they can present deleterious effects in autoimmune diseases and in graft rejection. Even though there have been great improvements in controlling the humoral response, its proper manipulation still remains a challenge, thus new targets need to be explored. It is known that metabolic shifts that occur upon B cell activation are not only essential for cell growth and proliferation, but are also interconnected with these cells effector function. Metabolic shifts are controlled by metabolic sensors, as the mTOR, which is a core component of two complexes, mTORC1 and mTORC2. Previous studies with T cells have already reported that mTOR exerts a positive role on glycolysis, which in turn impacts the effector function of T cells. We then hypothesized that mTOR favors glycolysis over Oxidative Phosphorylation (OXPHOS) in B cells, and that these metabolic changes impact the effector function of B cells. Thus, to investigate the impact of the mTOR pathway on B cells, we isolated B cells from mice with mTORC1 deficient B cells (RaptorΔB) or mTORC2 deficient B cells (RictorΔB) or Control mice (CT), and stimulated them in vitro with lipopolysaccharide (LPS). Our results indicate that the deficiency of mTORC2 favors OXPHOS over glycolysis, as well as B cell activation markers expression and plasmablast formation. Next, we confirmed that the reduced glycolysis levels, improved lipid oxidation and OXPHOS are in fact crucial for the enhanced activation and plasmablast formation observed in RaptorΔB and RictorΔB B cells. We also described that IgM secretion was elevated in B cells from RictorΔB after stimuli with LPS, however we found that this increase was due to the overall increase in plasmablasts in this group and not to their individual antibody secretion capacity. Interestingly, RaptorΔB and RictorΔB plasmablasts differently from B cells, reduce their mitochondrial activity. Subsequently, we confirmed that the mitochondria via lipid oxidation is actually essential for antibody secretion. In addition, we showed that mTORC2 deficiency increases isotype switching, while mTORC1 deficiency diminishes it when IL4 was added to LPS. We then sought to determine if mTORC2 deficiency in B cells would present an impact in vivo in a skin graft model. However, we did not observe a significant difference in graft survival between the CT and RictorΔB mice and in plasmacyte numbers, but we did observe a significant reduction in B cells in the periphery. Thus, we conclude that mTORC1 and mTORC2 deficiency leads to an improved plasmablast differentiation and an overall increase in antibody secretion in the last one in vitro, whereas the role of these sensors remains to be determined in vivo.

Anticorpos monoclonais (AcMos) para uso terapêutico correspondem a uma área importante na indústria de biofármacos, em especial os AcMos humanos, que apresentam menor probabilidade de elicitar imunogenicidade. O objetivo deste trabalho consistiu em obter AcMos humanos antitetânicos através da separação de linfócitos B produtores de anticorpos específicos utilizando o antígeno ou de plasmablastos. As células foram coletadas de doadores após vacinação e separadas por equipamento de cell sorter. As regiões variáveis dos anticorpos foram amplificadas e clonadas em vetores de expressão, que foram usados para transfectar transitoriamente células HEK293-F. O uso da toxina tetânica conjugada independentemente com dois marcadores, biotina e Alexa Fluor® 647, possibilitou a separação específica de linfócitos B produtores de AcMos antitetânicos, que foram avaliados por ELISA, western blotting e pela inibição da ligação da toxina ao gangliosídio GT1b. O ensaio in vivo mostrou proteção total dos animais contra a toxina tetânica quando três AcMos foram usados em conjunto. / Monoclonal antibodies (mAbs) for therapeutic use correspond to a major area of the biopharmaceutical industry, especially human mAbs that are less prone to elicit immunogenicity. The objective of this work was to obtain anti-tetanus human mAbs through separation of memory B lymphocytes producing specific antibodies stained with the antigen or plasmablasts. Cells were collected from peripheral blood of donors after vaccination and separated through cell sorting. The variable regions of the antibodies were amplified and cloned in expression vectors for transient transfection of HEK293-F cells. The staining with the tetanus toxin labeled independently with two markers, biotin and Alexa Fluor® 647 allowed the separation of specific B lymphocytes producing anti-tetanus mAbs. The antibodies expressed were evaluated by ELISA, western blotting and the inhibition of the binding of the tetanus toxin to the ganglioside GT1b. The in vivo neutralization assay showed that a pool of three different mAbs were able to protect mice against the tetanus toxin.

Anticorpos monoclonais (AcMos) para uso terapêutico correspondem a uma área importante na indústria de biofármacos, em especial os AcMos humanos, que apresentam menor probabilidade de elicitar imunogenicidade. O objetivo deste trabalho consistiu em obter AcMos humanos antitetânicos através da separação de linfócitos B produtores de anticorpos específicos utilizando o antígeno ou de plasmablastos. As células foram coletadas de doadores após vacinação e separadas por equipamento de cell sorter. As regiões variáveis dos anticorpos foram amplificadas e clonadas em vetores de expressão, que foram usados para transfectar transitoriamente células HEK293-F. O uso da toxina tetânica conjugada independentemente com dois marcadores, biotina e Alexa Fluor® 647, possibilitou a separação específica de linfócitos B produtores de AcMos antitetânicos, que foram avaliados por ELISA, western blotting e pela inibição da ligação da toxina ao gangliosídio GT1b. O ensaio in vivo mostrou proteção total dos animais contra a toxina tetânica quando três AcMos foram usados em conjunto. / Monoclonal antibodies (mAbs) for therapeutic use correspond to a major area of the biopharmaceutical industry, especially human mAbs that are less prone to elicit immunogenicity. The objective of this work was to obtain anti-tetanus human mAbs through separation of memory B lymphocytes producing specific antibodies stained with the antigen or plasmablasts. Cells were collected from peripheral blood of donors after vaccination and separated through cell sorting. The variable regions of the antibodies were amplified and cloned in expression vectors for transient transfection of HEK293-F cells. The staining with the tetanus toxin labeled independently with two markers, biotin and Alexa Fluor® 647 allowed the separation of specific B lymphocytes producing anti-tetanus mAbs. The antibodies expressed were evaluated by ELISA, western blotting and the inhibition of the binding of the tetanus toxin to the ganglioside GT1b. The in vivo neutralization assay showed that a pool of three different mAbs were able to protect mice against the tetanus toxin.