Multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) have emerged as therapeutic tools for a wide range of pathological conditions. Yet, the still existing deficits regarding MSC phenotype characterization and the resulting heterogeneity of MSC used in different preclinical and clinical studies hamper the translational success. In search for novel MSC characterization approaches to complement the traditional trilineage differentiation and immunophenotyping assays reliably across species and culture conditions, this study explored the applicability of lipid phenotyping for MSC characterization and discrimination. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), human fibroblasts, and human and equine adipose-derived MSC were used to compare different mesodermal cell types and MSC from different species. For MSC, cells cultured in different conditions, including medium supplementation with either fetal bovine serum or platelet lysate as well as culture on collagen-coated dishes, were additionally investigated. After cell harvest, lipids were extracted by chloroform/ methanol according to Bligh and Dyer. The lipid profiles were analysed by an untargeted approach using liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LCMS) with a reversed phase column and an ion trap mass spectrometer. In all samples, phospholipids and sphingomyelins were found, while other lipids were not detected with the current approach. The phospholipids included different species of phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylserine (PS) in all cell types, whereas phosphatidylglycerol (PG) species were only present in MSC. MSC from both species showed a higher phospholipid species diversity than PBMC and fibroblasts. Few differences were found between MSC from different culture conditions, except that human MSC cultured with platelet lysate exhibited a unique phenotype in that they exclusively featured PE O-40:4, PG 38:6 and PG 40:6. In search for specific and inclusive candidate MSC lipid markers, we identified PE O-36:3 and PG 40:7 as potentially suitable markers across culture conditions, at which PE O-36:3 might even be used across species. On that basis, phospholipid phenotyping is a highly promising approach for MSC characterization, which might condone some heterogeneity within the MSC while still achieving a clear discrimination even from fibroblasts. Particularly the presence or absence of PG might emerge as a decisive criterion for future MSC characterization.

Introdução: Células-troco mesenquimais (CTM) vêm mostrando seus benefícios na doença do enxerto-versus-hospedeiro (DECH), observada no transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH), existem três questões em aberto: (1) Expansão de CTM em meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (SFB), pelo o risco de xenorreação; (2) Otimização de condições de cultura para a obtenção, em tempo hábil, de um numero que permita de 4 a 6 infusões de 2x106cells/kg do receptor; (3) Obter células do doador de medula óssea, evitando assim a utilização de um terceiro doador. Objetivos: Este estudo foi desenhado para comparar o lisado de plaquetas (LP) e o SFB na expansão de CTM, a densidade de plaqueamento das células e os dias entre cada passagem, e para investigar se as células nucleadas totais obtidas da bolsa e filtro do TCTH, podem ser utilizadas para expansão de CTM para utilização clínica. Métodos: Células residuais foram removidas do filtro e da bolsa utilizados para o TCTH, plaqueadas e depois da primeira passagem foram cultivadas em diferentes concentrações com SFB ou LP e observado o número de dias que levaram para chegar a 80% de confluência. Em seguida, as culturas com as mesmas densidades de plaqueamento foram suplementadas com LP ou SFB e depois de sete dias contou-se o número de células para analisar o quanto elas cresceram nesse período. Resultados: A proliferação de CTM, na presença de LP e SFB foi em média 11,88 e 2,5 vezes, respectivamente, num período de 7 dias. A concentração mais elevada de células usando LP demorou menos tempo para atingir a confluência, em comparação com os três inferiores. Este estudo sugere que o LP é a melhor escolha como suplemento para expandir CTM, e permite a proliferação de um número suficiente de CTM de doadores para uso clínico. / Introduction: Mesenchymal stromal cells (MSC) have shown their benefits in graft-versus-host disease (GVHD), with three unsettled matters:(1) MSCs expansion in medium with Fetal Calf Serum (FCS) and its risk of xenoreaction; (2) The number of cells indicated for therapy is 2x106cells/Kg with the need to optimize expansion, number and time wise; and (3) the utilization of third party donors. Aims: This study was designed to compare the platelet lysate (LP) and FCS on the expansion of MSC, the optimal cell plating density and days between each pass, and to investigate if donor total nucleated cells (TNC) obtained from the washouts of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) explants can be expanded to be used at clinical grade. Methods: TNC were removed, plated and after the first passage were cultivated in different concentrations with FCS or PL and the number of days reach 80% of confluence was observed. Next, cultures with the same plating density were fed either with PL or FCS and after seven days counted to analyze how much they have grown in that period. Results: The proliferation of mesenchymal stromal cells in the presence of PL and SFB was averaged 11.88 and 2.5 times, respectively, in a period of 7 days. The highest concentration of plating cells using PL, took less time to reach confluence as compared with the three lower ones. This study suggests that the PL is the best choice as a supplement to expand MSC, and allows the proliferation of a sufficient number of donors MSC at P2 for clinical use.

Introdução: Células tronco mesenquimais (CTM) são uma população residente nos tecidos adultos de origem mesodérmica, com funções regenerativas de manutenção da integridade tecidual, com destaque no desempenho imunomodulador. Esse aspecto levou as CTM a tornarem-se ferramentas terapêuticas valiosas da pesquisa à assistência ao paciente em doenças autoimunes e de cunho inflamatório. Além disso, CTM podem ser isoladas de materiais tidos como descarte de procedimentos, como dentes decíduos, filtros de transplante de medula óssea e gordura. Nesse panorama, torna-se necessário estabelecer o efeito que a origem tecidual tem na eficiência imunoreguladora e na possível aplicabilidade clínica destas células. Objetivo: Comparar o potencial imunomodulador de células mesenquimais isoladas a partir de filtros descartados após a infusão de medula óssea, de lipoaspirado e de polpa de dentes decíduos. Métodos: Foi realizada a comparação da capacidade proliferativa de CTMs, cultivadas na presença de lisado plaquetário, das diversas fontes através do cálculo de population doubling das CTM em co-cultura com linfócitos T isolados em coluna magnética e com células mononucleares de sangue periférico, estimuladas com fitohemaglutinina; e determinado por citometria de fluxo o efeito das CTM das diversas fontes sobre as subpopulações linfocitárias. Resultados: CTM das três fontes foram capazes de inibir a proliferação de linfócitos e CTM de tecido adiposo foram mais eficientes em induzir o fenótipo de células T reguladoras e na diminuição de células T citotóxicas. Conclusão: comparadas à CTM isoladas de medula óssea e de polpa dentária, as CTM originadas de tecido adiposo exibem efeito imunomodulador mais acentuado. / Background: Mesenchymla stromal cells (MSC) reside in most adult tissue of mesenchymal origen, with a broad functions envolving cell repopulation and maintenence of tissue homeostasis, trough immunemmodulatory action. MSC are valuable terapêutic instruments applied from research to autoimune and inflamatory diseases. MSC can be isolated from diverse discarted biological matherials, like lipoaspirate, exfoliated deciduous teeeth and boné marrow ransplant filters. There so it´s necessary to stablish how source can impact MSC efficiency and possible clinical aplications. Objective: Compare immunomodulatory potential of adipose MSC and dental pulp MSC to boné marrow MSC. Methods: MSC from three selected sources were cocultured with phytohemaglutinin stimulated and magnetically isolated T cells and peripheral blood mononuclear cells; immunephenotype of cocultivated lymphocytes were also conducted. Results: MSC from all analyzed sources were capable to inhibit lymphocyte proliferation. Adipose MSC were capable to induce Treg phenotype and decrease T CD8+ limphocytes. Conclusion: Cell culture and therapy with MSC present many paradigms and we address to some of those to elucidate the possible most efficient source.

Introdução: Células-troco mesenquimais (CTM) vêm mostrando seus benefícios na doença do enxerto-versus-hospedeiro (DECH), observada no transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH), existem três questões em aberto: (1) Expansão de CTM em meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (SFB), pelo o risco de xenorreação; (2) Otimização de condições de cultura para a obtenção, em tempo hábil, de um numero que permita de 4 a 6 infusões de 2x106cells/kg do receptor; (3) Obter células do doador de medula óssea, evitando assim a utilização de um terceiro doador. Objetivos: Este estudo foi desenhado para comparar o lisado de plaquetas (LP) e o SFB na expansão de CTM, a densidade de plaqueamento das células e os dias entre cada passagem, e para investigar se as células nucleadas totais obtidas da bolsa e filtro do TCTH, podem ser utilizadas para expansão de CTM para utilização clínica. Métodos: Células residuais foram removidas do filtro e da bolsa utilizados para o TCTH, plaqueadas e depois da primeira passagem foram cultivadas em diferentes concentrações com SFB ou LP e observado o número de dias que levaram para chegar a 80% de confluência. Em seguida, as culturas com as mesmas densidades de plaqueamento foram suplementadas com LP ou SFB e depois de sete dias contou-se o número de células para analisar o quanto elas cresceram nesse período. Resultados: A proliferação de CTM, na presença de LP e SFB foi em média 11,88 e 2,5 vezes, respectivamente, num período de 7 dias. A concentração mais elevada de células usando LP demorou menos tempo para atingir a confluência, em comparação com os três inferiores. Este estudo sugere que o LP é a melhor escolha como suplemento para expandir CTM, e permite a proliferação de um número suficiente de CTM de doadores para uso clínico. / Introduction: Mesenchymal stromal cells (MSC) have shown their benefits in graft-versus-host disease (GVHD), with three unsettled matters:(1) MSCs expansion in medium with Fetal Calf Serum (FCS) and its risk of xenoreaction; (2) The number of cells indicated for therapy is 2x106cells/Kg with the need to optimize expansion, number and time wise; and (3) the utilization of third party donors. Aims: This study was designed to compare the platelet lysate (LP) and FCS on the expansion of MSC, the optimal cell plating density and days between each pass, and to investigate if donor total nucleated cells (TNC) obtained from the washouts of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) explants can be expanded to be used at clinical grade. Methods: TNC were removed, plated and after the first passage were cultivated in different concentrations with FCS or PL and the number of days reach 80% of confluence was observed. Next, cultures with the same plating density were fed either with PL or FCS and after seven days counted to analyze how much they have grown in that period. Results: The proliferation of mesenchymal stromal cells in the presence of PL and SFB was averaged 11.88 and 2.5 times, respectively, in a period of 7 days. The highest concentration of plating cells using PL, took less time to reach confluence as compared with the three lower ones. This study suggests that the PL is the best choice as a supplement to expand MSC, and allows the proliferation of a sufficient number of donors MSC at P2 for clinical use.

Introdução: Células tronco mesenquimais (CTM) são uma população residente nos tecidos adultos de origem mesodérmica, com funções regenerativas de manutenção da integridade tecidual, com destaque no desempenho imunomodulador. Esse aspecto levou as CTM a tornarem-se ferramentas terapêuticas valiosas da pesquisa à assistência ao paciente em doenças autoimunes e de cunho inflamatório. Além disso, CTM podem ser isoladas de materiais tidos como descarte de procedimentos, como dentes decíduos, filtros de transplante de medula óssea e gordura. Nesse panorama, torna-se necessário estabelecer o efeito que a origem tecidual tem na eficiência imunoreguladora e na possível aplicabilidade clínica destas células. Objetivo: Comparar o potencial imunomodulador de células mesenquimais isoladas a partir de filtros descartados após a infusão de medula óssea, de lipoaspirado e de polpa de dentes decíduos. Métodos: Foi realizada a comparação da capacidade proliferativa de CTMs, cultivadas na presença de lisado plaquetário, das diversas fontes através do cálculo de population doubling das CTM em co-cultura com linfócitos T isolados em coluna magnética e com células mononucleares de sangue periférico, estimuladas com fitohemaglutinina; e determinado por citometria de fluxo o efeito das CTM das diversas fontes sobre as subpopulações linfocitárias. Resultados: CTM das três fontes foram capazes de inibir a proliferação de linfócitos e CTM de tecido adiposo foram mais eficientes em induzir o fenótipo de células T reguladoras e na diminuição de células T citotóxicas. Conclusão: comparadas à CTM isoladas de medula óssea e de polpa dentária, as CTM originadas de tecido adiposo exibem efeito imunomodulador mais acentuado. / Background: Mesenchymla stromal cells (MSC) reside in most adult tissue of mesenchymal origen, with a broad functions envolving cell repopulation and maintenence of tissue homeostasis, trough immunemmodulatory action. MSC are valuable terapêutic instruments applied from research to autoimune and inflamatory diseases. MSC can be isolated from diverse discarted biological matherials, like lipoaspirate, exfoliated deciduous teeeth and boné marrow ransplant filters. There so it´s necessary to stablish how source can impact MSC efficiency and possible clinical aplications. Objective: Compare immunomodulatory potential of adipose MSC and dental pulp MSC to boné marrow MSC. Methods: MSC from three selected sources were cocultured with phytohemaglutinin stimulated and magnetically isolated T cells and peripheral blood mononuclear cells; immunephenotype of cocultivated lymphocytes were also conducted. Results: MSC from all analyzed sources were capable to inhibit lymphocyte proliferation. Adipose MSC were capable to induce Treg phenotype and decrease T CD8+ limphocytes. Conclusion: Cell culture and therapy with MSC present many paradigms and we address to some of those to elucidate the possible most efficient source.

Introdução: Células tronco mesenquimais (CTM) são uma população residente nos tecidos adultos de origem mesodérmica, com funções regenerativas de manutenção da integridade tecidual, com destaque no desempenho imunomodulador. Esse aspecto levou as CTM a tornarem-se ferramentas terapêuticas valiosas da pesquisa à assistência ao paciente em doenças autoimunes e de cunho inflamatório. Além disso, CTM podem ser isoladas de materiais tidos como descarte de procedimentos, como dentes decíduos, filtros de transplante de medula óssea e gordura. Nesse panorama, torna-se necessário estabelecer o efeito que a origem tecidual tem na eficiência imunoreguladora e na possível aplicabilidade clínica destas células. Objetivo: Comparar o potencial imunomodulador de células mesenquimais isoladas a partir de filtros descartados após a infusão de medula óssea, de lipoaspirado e de polpa de dentes decíduos. Métodos: Foi realizada a comparação da capacidade proliferativa de CTMs, cultivadas na presença de lisado plaquetário, das diversas fontes através do cálculo de population doubling das CTM em co-cultura com linfócitos T isolados em coluna magnética e com células mononucleares de sangue periférico, estimuladas com fitohemaglutinina; e determinado por citometria de fluxo o efeito das CTM das diversas fontes sobre as subpopulações linfocitárias. Resultados: CTM das três fontes foram capazes de inibir a proliferação de linfócitos e CTM de tecido adiposo foram mais eficientes em induzir o fenótipo de células T reguladoras e na diminuição de células T citotóxicas. Conclusão: comparadas à CTM isoladas de medula óssea e de polpa dentária, as CTM originadas de tecido adiposo exibem efeito imunomodulador mais acentuado. / Background: Mesenchymla stromal cells (MSC) reside in most adult tissue of mesenchymal origen, with a broad functions envolving cell repopulation and maintenence of tissue homeostasis, trough immunemmodulatory action. MSC are valuable terapêutic instruments applied from research to autoimune and inflamatory diseases. MSC can be isolated from diverse discarted biological matherials, like lipoaspirate, exfoliated deciduous teeeth and boné marrow ransplant filters. There so it´s necessary to stablish how source can impact MSC efficiency and possible clinical aplications. Objective: Compare immunomodulatory potential of adipose MSC and dental pulp MSC to boné marrow MSC. Methods: MSC from three selected sources were cocultured with phytohemaglutinin stimulated and magnetically isolated T cells and peripheral blood mononuclear cells; immunephenotype of cocultivated lymphocytes were also conducted. Results: MSC from all analyzed sources were capable to inhibit lymphocyte proliferation. Adipose MSC were capable to induce Treg phenotype and decrease T CD8+ limphocytes. Conclusion: Cell culture and therapy with MSC present many paradigms and we address to some of those to elucidate the possible most efficient source.

Introdução: Células-troco mesenquimais (CTM) vêm mostrando seus benefícios na doença do enxerto-versus-hospedeiro (DECH), observada no transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH), existem três questões em aberto: (1) Expansão de CTM em meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (SFB), pelo o risco de xenorreação; (2) Otimização de condições de cultura para a obtenção, em tempo hábil, de um numero que permita de 4 a 6 infusões de 2x106cells/kg do receptor; (3) Obter células do doador de medula óssea, evitando assim a utilização de um terceiro doador. Objetivos: Este estudo foi desenhado para comparar o lisado de plaquetas (LP) e o SFB na expansão de CTM, a densidade de plaqueamento das células e os dias entre cada passagem, e para investigar se as células nucleadas totais obtidas da bolsa e filtro do TCTH, podem ser utilizadas para expansão de CTM para utilização clínica. Métodos: Células residuais foram removidas do filtro e da bolsa utilizados para o TCTH, plaqueadas e depois da primeira passagem foram cultivadas em diferentes concentrações com SFB ou LP e observado o número de dias que levaram para chegar a 80% de confluência. Em seguida, as culturas com as mesmas densidades de plaqueamento foram suplementadas com LP ou SFB e depois de sete dias contou-se o número de células para analisar o quanto elas cresceram nesse período. Resultados: A proliferação de CTM, na presença de LP e SFB foi em média 11,88 e 2,5 vezes, respectivamente, num período de 7 dias. A concentração mais elevada de células usando LP demorou menos tempo para atingir a confluência, em comparação com os três inferiores. Este estudo sugere que o LP é a melhor escolha como suplemento para expandir CTM, e permite a proliferação de um número suficiente de CTM de doadores para uso clínico. / Introduction: Mesenchymal stromal cells (MSC) have shown their benefits in graft-versus-host disease (GVHD), with three unsettled matters:(1) MSCs expansion in medium with Fetal Calf Serum (FCS) and its risk of xenoreaction; (2) The number of cells indicated for therapy is 2x106cells/Kg with the need to optimize expansion, number and time wise; and (3) the utilization of third party donors. Aims: This study was designed to compare the platelet lysate (LP) and FCS on the expansion of MSC, the optimal cell plating density and days between each pass, and to investigate if donor total nucleated cells (TNC) obtained from the washouts of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) explants can be expanded to be used at clinical grade. Methods: TNC were removed, plated and after the first passage were cultivated in different concentrations with FCS or PL and the number of days reach 80% of confluence was observed. Next, cultures with the same plating density were fed either with PL or FCS and after seven days counted to analyze how much they have grown in that period. Results: The proliferation of mesenchymal stromal cells in the presence of PL and SFB was averaged 11.88 and 2.5 times, respectively, in a period of 7 days. The highest concentration of plating cells using PL, took less time to reach confluence as compared with the three lower ones. This study suggests that the PL is the best choice as a supplement to expand MSC, and allows the proliferation of a sufficient number of donors MSC at P2 for clinical use.

Os procedimentos para uso clínico de células-tronco derivadas de tecido adiposo (CT-TA) exigem grandes quantidades de células, por isso, em geral os protocolos envolvem a expansão e cultura celular in vitro. No entanto, as metodologias utilizadas rotineiramente para o cultivo de CT-TA envolvem a utilização de componentes xenobióticos, como a colagenase e o soro fetal bovino (SFB), que representam riscos potencias de reações imunológicas e transmissão de doenças infecciosas. Sendo assim, pretendeu-se no presente estudo analisar diferentes parâmetros metodológicos para isolamento e expansão de CT-TA, na ausência de componentes xenobióticos. Para tanto, as células-tronco foram isoladas por digestão enzimática ou dissociação mecânica e submetidas à expansão na presença de SFB ou lisado de plaquetas humano (LP). Os resultados mostraram que a metodologia de dissociação mecânica representa uma alternativa viável e eficiente para cultivo de CT-TA, e que o emprego de LP como suplemento para o meio de cultura aumentou de forma significativa a proliferação celular. Em função desses resultados, pode-se concluir que é possível a implementação de técnicas de isolamento e expansão de CT-TA, prescindindo-se de componentes xenobióticos. / The procedures for the clinical use of adipose-derived stem cells (ASC) require large amounts of cells, so in general protocols involve culture and cell expansion in vitro.However, the methods routinely used for the culture of ASC involves the use of xenobiotic components, such as collagenase and fetal bovine serum (FBS), that may representing potential risk of immunological reactions and the risk of transmission of infectious diseases. Thus, it was intended in this study to analyze different methodological parameters for the isolation and expansion of ASC in the absence of xenobiotic components. For this, stem cells were isolated by enzymatic digestion and mechanical dissociation and were submitted to expansion in the presence of FBS or human platelet lysate (PL). The results showed that the mechanical dissociation method represents an effective alternative to growing ASC, and that the use of PL as a supplement to the culture medium significantly increased cellular proliferation. In view of these results, we can conclude that it is possible to implement techniques for isolation and expansion of ASC, dispensing xenobiotic components.

Os procedimentos para uso clínico de células-tronco derivadas de tecido adiposo (CT-TA) exigem grandes quantidades de células, por isso, em geral os protocolos envolvem a expansão e cultura celular in vitro. No entanto, as metodologias utilizadas rotineiramente para o cultivo de CT-TA envolvem a utilização de componentes xenobióticos, como a colagenase e o soro fetal bovino (SFB), que representam riscos potencias de reações imunológicas e transmissão de doenças infecciosas. Sendo assim, pretendeu-se no presente estudo analisar diferentes parâmetros metodológicos para isolamento e expansão de CT-TA, na ausência de componentes xenobióticos. Para tanto, as células-tronco foram isoladas por digestão enzimática ou dissociação mecânica e submetidas à expansão na presença de SFB ou lisado de plaquetas humano (LP). Os resultados mostraram que a metodologia de dissociação mecânica representa uma alternativa viável e eficiente para cultivo de CT-TA, e que o emprego de LP como suplemento para o meio de cultura aumentou de forma significativa a proliferação celular. Em função desses resultados, pode-se concluir que é possível a implementação de técnicas de isolamento e expansão de CT-TA, prescindindo-se de componentes xenobióticos. / The procedures for the clinical use of adipose-derived stem cells (ASC) require large amounts of cells, so in general protocols involve culture and cell expansion in vitro.However, the methods routinely used for the culture of ASC involves the use of xenobiotic components, such as collagenase and fetal bovine serum (FBS), that may representing potential risk of immunological reactions and the risk of transmission of infectious diseases. Thus, it was intended in this study to analyze different methodological parameters for the isolation and expansion of ASC in the absence of xenobiotic components. For this, stem cells were isolated by enzymatic digestion and mechanical dissociation and were submitted to expansion in the presence of FBS or human platelet lysate (PL). The results showed that the mechanical dissociation method represents an effective alternative to growing ASC, and that the use of PL as a supplement to the culture medium significantly increased cellular proliferation. In view of these results, we can conclude that it is possible to implement techniques for isolation and expansion of ASC, dispensing xenobiotic components.