La O-fucosylation, catalysée par Pofut1, est une glycosylation rare qui consiste en l’ajout d’un fucose O-lié sur la sérine ou la thréonine d’une séquence consensus (C2X4(S/T)C3), portée par un domaine EGF-like (ELD) d’une glycoprotéine membranaire ou sécrétée. Notre analyse de la lignée murine Pofut1cax/cax, hypomorphe pour le gène Pofut1, a révélé une hypertrophie musculaire post-natale associée à une diminution du pool de cellules satellites. Ce phénotype est en partie associé à un défaut d’interaction entre les récepteurs NOTCH hypo-O-fucosylés des myoblastes dérivés de cellulessatellites (MDCS) et leurs ligands DSL, ce qui aboutit à une plus faible activation de la signalisation Notch. D’autres protéines potentiellement impliquées dans la myogenèse peuvent également être la cible de POFUT1. C’est notamment le cas de la protéine Wnt inhibitory factor 1 (WIF1), qui dispose de cinq ELDs, dont deux sont potentiellement aptes à recevoir un O-fucose (ELDs III et V). Par une approche phylogénétique, nous avons montré la conservation de ces deux sites de O-fucosylation et de deux sites de N-glycosylation chez la plupart des bilatériens. Nos expériences démontrent l’occupationde tous ces sites, excepté le site de O-fucosylation de l’ELD V, chez la protéine WIF1 murine. La capacité de l’ELD III, produit de manière isolée, à recevoir un fucose O-lié a été démontrée après O-fucosylation in vitro, par l’association de cycloaddition azide-alcyne assistée au cuivre (CuAAC) et de spectrométrie de masse en mode MRM. Cette nouvelle approche expérimentale a par la suite été standardisée et sa sensibilité évaluée en comparant deux autres ELDs (ELDs 12 et 26 de NOTCH1) connus pour être O-fucosylés mais présentant des affinités différentes pour POFUT1. De façonsurprenante, l’ELD V de WIF1 ne peut être O-fucosylé, probablement en raison d’un clash stérique entre cet ELD et POFUT1, prévenant ainsi leur interaction. L’analyse de la protéine WIF1 entière a confirmé les résultats obtenus sur les ELDs isolés et démontre l’occupation des deux sites de N-glycosylation. Enfin, nos résultats montrent également l’importance de ces deux N-glycanes, mais également celle du O-fucose de l’ELD III, pour une sécrétion optimale de la protéine WIF1 murine. / The, Pofut1-catalyzed O-fucosylation, is a rare glycosylation which consists of the addition of an O-linked fucose to the serine or threonine of a consensus sequence (C2X4(S/T)C3), carried by an EGF-like domain (ELD) of a membrane or secreted glycoprotein. Our analysis of the murine line Pofut1cax/cax, hypomorphic for the Pofut1 gene, revealed post-natal muscle hypertrophy associated with a decrease in the satellite cell pool. This phenotype was partly associated with a lack of interaction between hypo-O-fucosylated NOTCH receptors of satellite cell-derived myoblasts (SCDM) and their DSL ligands, which resulted in a lower activation of Notch signaling. Other proteins potentially involved in myogenesis may also be the target of POFUT1. This is indeed the case for the protein Wnt inhibitory factor 1 (WIF1), which has five ELDs, whose only two are potentially able to receive an O-fucose (ELDs III and V). Using a phylogenetic approach, we showed in most bilaterians that these two O-fucosylation sites and two N-glycosylation sites were conserved. Our experiments showed theoccupation of all these sites, except for the O-fucosylation site of murine WIF1 protein ELD V. The ability of the ELD III, produced as an isolated protein, to receive O-linked fucose was demonstrated after an in vitro O-fucosylation by combination of copper-catalysed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and MRM-mass spectrometry. This new experimental approach was then standardized and its sensitivity was evaluated by comparing two other ELDs (NOTCH1 ELDs 12 and 26) known to beO-fucosylated but with different affinities for POFUT1. Surprisingly, WIF1's ELD V could not be O-fucosylated, probably due to a steric clash between this ELD and POFUT1, thus preventing their interaction. The analysis of the full-length WIF1 protein confirmed our results obtained with isolated ELDs and demonstrated the occupation of the two N-glycosylation sites. Finally, our results also showed the importance of these two N-glycans, but also the importance of ELD III’s O-fucose, foroptimal secretion of the murine WIF1 protein.

La croissance musculaire postnatale chez la souris s’effectue principalement par une hypertrophie et un allongement des fibresmusculaires. L’augmentation de l’aire des fibres est contrôlée par plusieurs voies de signalisation telle que la voie Notch, qui est impliquée dans l’activation des cellules satellites (CS) en début de croissance musculaire postnatale chez la souris. La O-fucosylation, médiée par la protéine O-fucosyltransférase 1 (POFUT1), des répétitions EGF-like de la partie extracellulaire des récepteurs NOTCH joue un rôle déterminant dans la modulation des interactions récepteur-ligand (R-L), nécessaires à l’activation de la voie Notch.Les souris Pofut1cax/cax sont hypomorphes pour le gène Pofut1 et nosrésultats montrent, en plus de malformations squelettiques, unehypertrophie musculaire post-natale, pas d’hyperplasie et une réduction du pool de CS. Pour comprendre l’origine de cette hypertrophie, des cultures primaires de myoblastes dérivés de CS (MDCS) de muscles squelettiques ont été réalisées dans des conditions de prolifération ou de différenciation. Les MDCS Pofut1cax/cax présentent une activité réduite de la signalisation Notch, due à une moins bonne interaction R-L provoquée par une O-fucosylation amoindrie des répétitions EGF-like. Il en résulte une diminution de l’expression de Pax7, marqueur de l’état indifférencié, et une dérégulation de l’expression des facteurs régulateurs de lamyogenèse (Myod, Myf5 et Myogénine). La conséquence ultime est laréduction de la proportion en progéniteurs Pax7+/MyoD- au profit decellules Pax7-/MyoD+ engagées dans la différenciation. Ces observations sont en accord avec la différentiation précoce des MDCS Pofut1cax/cax. Nos résultats indiquent que cette hypertrophie musculaire post-natale chez les souris Pofut1cax/cax est due à une propension plus importante des CS activées à se différencier et à fusionner avec des fibres pré-existantes plutôt que retourner à l’état de quiescence. / Postnatal muscle growth in mice mainly occurs by hypertrophy and by anincrease of myofibres length. This increase in myofibres area is controlled by multiple signaling pathways such as Notch signaling, which is involved in activation of satellite cells (SC) at the beginning of postnatal muscle growth in mice. The O-fucosylation of EGF-like repeats within the extracellular domain of NOTCH receptors, mediated by protein O-fucosyltransferase 1 (POFUT1), plays a key role in the modulation of receptor-ligand interactions (R-L), necessary for activation of Notch signaling. Pofut1cax/cax mice are hypomorphic for the Pofut1 gene. In addition to skeletal defects, our results show postnatal muscular hypertrophy, no hyperplasia and a reduced pool of SC. To understand the origin of this hypertrophy, primary cultures of myoblasts derived from SC (SCDM) from skeletal muscles were studied in proliferating and differentiating conditions. Pofut1cax/cax SCDM showed a reduced Notch signaling due to aless efficient R-L interactions provoked by a low O-fucosylation of EGF-like repeats. This results in decreased expression of Pax7, a marker of undifferentiated state, and a change in the expression of myogenic regulatory factors (Myod, Myf5 and Myogenin). Subsequently, the proportion of Pax7+/MyoD- progenitors decreased while the proportion of Pax7-/MyoD+ cells committed in differentiation increased. These findings corroborate early differentiation of Pofut1cax/cax SCDM.Our results indicate that this postnatal muscle hypertrophy in Pofut1cax/caxmice is due to the fact that activated satellite cells are more prone todifferentiate and fuse with pre-existing myofibres that returning toquiescence.

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Au cours de la myogenèse post-natale, la voie de signalisation de Notch participe au développement et à la régénération du muscle squelettique chez les mammifères. Elle permet le maintien de l'état prolifératif des myoblastes, contrôle la quiescence des cellules satellites in vivo et préserve une sous-population de cellules de réserve indifférenciées in vitro. L' activation de la voie et l'interaction du récepteur Notch avec ses ligands est dépendante de leur entité glucidique, notamment de leurs O-fucosylglycannes. La synthèse de ces derniers est initiée par la protéine O-fucosyltransférase 1 (Pofut1) qui greffe un O-fucose sur des domaines peptidiques particuliers appelés EGF-like. Bien que les acteurs moléculaires de la différenciation myogénique aient été largement étudiés par la communauté scientifique, la contribution de la glycosylation des protéines dans ce processus reste peu documentée. Une approche expérimentale in vitro basée sur l'utilisation de la lignée myoblastique murine C2C12 nous a permis d'identifier une expression importante de Pofut1 dans les cellules de réserve tandis qu' elle est restreinte dans les myotubes durant la différenciation myogénique. Plusieurs lignées de cellules C2C12 ont été générées pour qu' elles expriment de manière stable et différentielle Pofut1. Elles permettent ainsi d' évaluer l' importance du niveau d' expression de Pofut1 sur la différenciation myogénique.La sous-expression de Pofut1 réduit l' activation de la voie de signalisation de Notch conduisant à une entrée précoce des myoblastes dans le programme myogénique. Ceci a pour conséquence la dépletion des cellules de réserve Pax7+/MyoD- au profit d' une augmentation du nombre de myotubes. Des études morphométriques ont révélé un défaut d' accrétion nucléaire dans les myotubes sous-exprimant Pofut1, caractéristique d' une altération de la fusion secondaire. Ces observations sont accompagnées d' une diminution significative de l' expression du récepteur à l' interleukine 4 dans les cellules de reserve sous-exprimant Pofut1. Les lignées cellulaires ré-exprimant Pofut1 présentent une activation de la voie de signalisation de Notch et un processus de fusion myoblastique correctement restaurés.Ces travaux de thèse ont mis en exergue pour la première fois le rôle essentiel de Pofut1 dans le devenir cellulaire et la fusion des myoblastes au cours de la différenciation myogénique. / During post-natal myogenesis, Notch signaling pathway is involved in the development and regeneration of skeletal muscle in mammals. It maintains progenitor cell properties during the development of the myogenic lineage and controls the transition of satellite cells from a quiescent to an active state and preserves a subpopulation of reserve cells, in cell culture, in an undifferentiated state. The interaction between Notch and its ligands and the activation of this signaling is mainly controlled by the activity of protein O-fucosyltranferase 1 (Pofut1) and thus by the O-fucosylation state of the EGF-like repeats.Although the molecular players in myogenic differentiation have been extensively studied by the scientific community, the contribution of glycosylated proteins in this process remains poorly documented. An experimental in vitro study based on the C2C12 mouse myoblast cell line allowed us to identify a high expression of Pofut1 in reserve cells while a low expression was found in myotubes during myogenic differentiation. Several C2C12 cell lines were generated to express Pofut1 at different levels. They were used to evaluate the contribution of Pofut1 expression to the myogenic differentiation.The knockdown of Pofut1 repressed Notch signaling pathway activation leading to an earlier entrance of myoblasts in myogenic program. This resulted in the depletion of reserve cells Pax7+/MyoD- and an increase in the number of myotubes. Morphometric analysis revealed a nuclear accretion defect in Pofut1 knockdown myotubes. A significant decrease in the expression of the interleukin-4 receptor in Pofut1 knockdown reserve cells was also observed. Cell lines re-expressing correctly Pofut1 restored Notch signaling pathway and subsequently myoblast fusion process.This thesis work highlights, for the first time, the crucial role of Pofut1 in the cell fate decision and the fusion of myoblasts during myogenic differentiation.

La protéine O-fucosyltransférase 1 (POFUT1) réticulaire, dont le gène est localisé dans la région chromosomique 20q11.21 chez l’Homme, catalyse le transfert d’un fucose qui sera O-lié sur la sérine ou la thréonine présente dans la séquence consensus (C2X4S/TC3), portée par un domaine EGF-like d’une glycoprotéine membranaire ou sécrétée. Le knockdown de Pofut1 (Po -) dans la lignée myoblastique murines C2C12 conduit à la formation de myotubes allongés et minces, à faible nombre de noyaux ainsi qu’à une sous-expression du marqueur myogénique tardif Myf6, suggérant des défauts significatifs dans la fusion secondaire. La signalisation NFATc2/IL-4 est décrite comme la voie principale associée à cette étape. Nous montrons que la moindre expression de Nfatc2 dans les myotubes Po - est corrélée à une baisse de l'IL-4 sécrétée et à une faible quantité de son récepteur (IL-4Rα) présent chez les cellules de réserve qui doivent participer à la fusion avec les myotubes naissants. La neutralisation de l’IL-4Rα sur les C2C12 sauvages provoque des défauts d'accrétion myonucléaire, semblables à ceux observés pour les Po -. Ainsi, POFUT1 pourrait être un nouveau médiateur de la croissance des myotubes au cours du processus myogénique, notamment par la signalisation NFATc2/IL-4. La glycoprotéine WIF1, cible potentielle de POFUT1, est un antagoniste de la signalisation WNT via sa fixation aux protéines WNT. Cette voie est connue pour être impliquée dans la prolifération et la différenciation des myoblastes. Néanmoins, aucune donnée ne concerne le rôle de WIF1 dans le processus myogénique. Par un apport exogène de WIF1, nous avons montré l’augmentation de la prolifération et l’altération de la différenciation myoblastique des C2C12. Lors de la prolifération, une augmentation de l’expression de Myf5 et une diminution de MyoG sont observées. A 7 jours de différenciation, les myotubes Po - ont un diamètre plus petit que les myotubes sauvages et ils sont plus nombreux à avoir un faible nombre de noyaux, traduisant des défauts de fusion. Nous démontrons pour la première fois, l’implication de la protéine WIF1 dans le processus myogénique. Récemment, POFUT1 a aussi été proposé comme nouveau biomarqueur pour certains cancers, mais pas évalué dans le cancer colorectal (CCR). Nous avons donc collecté des données issues de 626 tumeurs et 51 tissus adjacents non tumoraux disponibles dans FireBrowse, celles de lignées cellulaires cancéreuses colorectales et de prélèvements tumoraux provenant du Centre de Ressources Biologiques du CHU de Limoges. Une surexpression de POFUT1 est observée dès le stade I, majoritairement due à une amplification de la région 20q11.21. Elle est significativement associée aux adénocarcinomes non mucineux et à une localisation rectale. De plus, l’expression de POFUT1 est corrélée à celles des récepteurs NOTCH ainsi qu’au processus métastatique, probablement par activation de la voie NOTCH. A ce titre, POFUT1 pourrait être considéré comme un nouveau biomarqueur pour le diagnostic du CCR. / The ER protein O-fucosyltransferase 1 (POFUT1), whose gene is located at the 20q11.21 chromosomic region in humans, catalyzes O-linked fucose addition to serine or threonine present in the consensus sequence (C2X4S/TC3) carried by EGF-like domain of membrane or secreted glycoprotein. Pofut1 knockdown (Po -) in murine myoblast C2C12 cell line leads to formation of elongated and thin myotubes, with a low number of nuclei and to downexpression of the late myogenic marker Myf6, suggesting significant defects in secondary fusion. NFATc2/IL-4 signaling is described as the main pathway associated to this step. We showed that the slightest expression of Nfatc2 in Po - myotubes is correlated with a decrease in IL-4 secretion and a lower quantity of IL 4Rα in reserve cells, which had to fuse with nascent myotubes. IL-4Rα neutralization on wild-type C2C12 causes myonuclear accretion defects, similar to those observed in Po -. Then, POFUT1 could be a new mediator of myotube growth during myogenic process, particularly through NFATc2/IL-4 signaling. The glycoprotein WIF1, potential POFUT1 target, is an antagonist of WNT signaling via its binding to WNT proteins. This pathway is involved in proliferation and differentiation of myoblasts. However, no data are available on WIF1 role in the myogenic process. Through exogenous WIF1 treatment, we showed a proliferation increase and a myoblast differentiation impairment in C2C12. During proliferation, increase in Myf5 and decrease in MyoG expressions are observed. At 7 days of differentiation, Po - myotubes have a smaller diameter than wild-type ones and are more numerous to have a small number of nuclei, reflecting fusion defects. For the first time, we demonstrate the involvement of WIF1 in the myogenic process. Recently, POFUT1 was proposed to be a new biomarker for several cancers, but not evaluated in colorectal cancer (CRC). We used data from 626 tumors and 51 adjacent non-tumor tissues available at FireBrowse, colorectal cancer cell lines and tumor samples from the Biological Resource Centre of Limoges hospital. A POFUT1 overexpression is observed from stage I, mainly due to amplification of 20q11.21 region. It is significantly associated to non-mucinous adenocarcinoma and to rectum location. Moreover, POFUT1 expression is correlated with those of NOTCH receptors as well as the metastatic process, probably by activation of the NOTCH pathway. POFUT1 could therefore be considered as a new biomarker for CRC diagnosis.