Made available in DSpace on 2016-03-04T14:01:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 rafael_cuadrat_ioc_dout_2014.pdf: 4008307 bytes, checksum: f638f1e7b8458c6f20d884b710ddaf75 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os ambientes marinhos cobrem cerca de 70% da superfície do planeta. Esses habitats apresentam uma grande variabilidade de temperatura, pressão e salinidade, abrigando uma vasta biodiversidade microbiana, pertencentes aos 3 domínios da vida (Archaea, Bacteria e Eukarya). Estes microrganismos representam até 98% da produção primária destes ambientes representando grande potencial para exploração e descoberta de novos compostos naturais de interesse para a indústria farmacêutica e da biotecnologia. Entretanto, apenas cerca de 1% dos microrganismos podem ser cultivados com as técnicas atuais utilizando-se meios de cultura em laboratório. Com objetivo de contornar esta limitação, estudos de metagenômica vem sendo conduzidos para analisar amostras de diferentes ambientes, incluindo ambientes aquáticos como rios, lagos e regiões costeiras ou de oceano aberto. No presente estudo, foram avaliados a diversidade taxonômica e o potencial metabólico de uma amostra (fracionada em duas por filtração, nomeadas: amostra E \2013 retida na membrana de 0,8 \03BCm e amostra P \2013 retida na membrana de 0,22 \03BCm) coletada na Praia dos Anjos (Arraial do Cabo \2013 RJ), um ambiente de grande interesse por ser afetado pelo fenômeno da ressurgência, além de sofrer impacto antrópico (turismo e pesca). Foram também triados genes do metabolismo secundário (PKS e NRPS) de microrganismos através de pirosequenciamento do DNA total da comunidade Um total de 651.083 e 542.647 sequências de nucleotídeos (reads) foram obtidas das amostras P e E, respectivamente. As sequências obtidas foram analisadas através de similaridade com bancos de sequências públicas (Genbank) utilizando o pacote BLAST e o programa MEGAN para classificação taxonômica baseada no algoritmo do Último Ancestral Comum (LCA). O filo mais abundante nas duas amostras foi Proteobacteria, seguido por Bacteroidetes e Cyanobacteria (este último principalmente na amostra E). Membros do clado Roseobacter (principalmente gêneros Roseobacter e Ruegeria) foram encontrados em alta abundância nas duas amostras, porém a dominância é maior na amostra P (representando até 29% dos gêneros identificados). Através de modelos HMM (do inglês \201CHidden Markov Models\201D), foram triadas sequências de domínios conservados ceto-acil sintase - KS e domínio de condensação \2013 C, de enzimas PKS e NRPS, respectivamente. Um total de 84 sequências de KS e 46 sequências de domínio C foram encontradas nas duas amostras, mostrando o potencial deste ambiente para a descoberta de novos compostos de interesse para a indústria Adicionalmente, a abundância e diversidade de bactérias aeróbias fotossintetizantes anoxigênicas (AAP) no metagenoma de Arraial do Cabo e em metagenomas públicos do projeto GOS foi investigada através de uma metodologia in silico utilizando perfis de modelos ocultos de markov (pHMM) para triar os genes do núcleo de reação da fotossíntese anoxigênica (pufM e pufL), além do gene bchX, e através destes estimar a abundância e diversidade de AAPs em metagenomas. A amostra de maior abundância em AAPs foi a amostra P de Arraial do Cabo, com aproximadamente 23,88% do total de células presentes na amostra. Das 10 amostras do GOS mais abundantes em AAPs, 8 (80%) foram obtidas de regiões próximas a linha do equador. Foi possível classificar as sequências de pufM em filogrupos, mostrando alta abundância do filogrupo G (clado das Roseobacter) em Arraial do Cabo. Este filogrupo se mostrou o mais cosmopolita, presente em 11 das 12 (91,66%) amostras analisadas. Os resultados nos permitiram concluir que o ambiente estudado foi afetado pelo fenômeno da ressurgência, e a amostra foi coletada após o bloom do fictoplanton / The marine environments cover ~70% of the Earth's surface. These habitats present great variability of temperature, pressure and salinity, harboring a wide range of microorganisms from the three domains of life (Archaea, Bacteria and Eukarya) which are responsible for ~98% of the marine primary production. This huge biodiversity represents a great potent ial, as its exploration allows us to discover new enzymes for industrial use. However, only ~1% of the environmental microorganism can be cultivated using culture - dependent approaches. To overcome this limitation, metagenomics studies have been conducted u sing samples for different environments, including aquatic ones like costal seawater, deep seawater, open ocean waters and freshwater from rivers and lagoons. In this work, we explore the taxonomic diversity and the metabolic potential (to find new natural compounds produced by PKS and NRPS enzymes) of the Praia dos Anjos (Angel's Beach), in Arraial do Cabo, Rio de Janeiro, Brazil by pyrosequencing its metagenome. The sample was fractionated by filtration in 2 membranes to separate the eukaryotic (sample E) from prokaryotic communities (sample P). A total of 651,083 and 542,647 reads were obtained for samples P and E, respectively. The obtained sequences were analyzed by similarity using the BLAST package and the MEGAN program, applying the Last Common Ancest ral (LCA) algorithm. The MG - RAST pipeline was used to annotate the genes from the community. The most abundant bacterial phylum present in both samples was Proteobacteria, followed by Bacteroidetes and Cyanobacteria (mainly on sample E). Members of the Ros eobacter clade ( Roseobacter and Ruegeria genus) was abundant in both samples, but in larger abundance on sample P (up to 29% of identified genus) . The keto - acyl synthase (KS) domains from PKSs and condensation domain (C) from NRPS were screened using pHMMs approach. A total of 84 KS sequences and 46 C sequences were obtained from both samples, showing the potential of this environment for the discover y of new compounds. The aerobic anoxygenic phototrophs bacteria (AAP) are photoheterotrophic microorganisms that play important roles on biogeochemical cycles. In oceans, this group is wide ly distributed, however, its abundance and relevance in carbon fixation is poorly understood. In the present work, with the aim to estimate the abundance and diversity of AAPs in the metagenome from Arraial do Cabo, an in silico approach using Hiden Markov Models profiles (pHMM) was developed to screen core genes of anoxygenic photosynthesis ( pufM and pufL ), in addition to chlorophyllide reductase subunit X gene (bchX). The met agenomes from Global Ocean Sample Expedition (GOS) was also screened with comparative purposes. The most abundant sample was sample P from Arraial do Cabo, with ~23.88% of total cells in the sample . The 10 most abundant samples from GOS, in addition to the 2 samples from Arraial do Cabo, were selected to assembl y , ORF extraction and phylogenetic analysis of pufM genes. From the 10 GOS samples, 80% were collected in sites close to the Equador. It w as possible to classify the most of sequences in phylogroups, showing a high abundance of phylogroup G ( Roseobacter clade) in Arraial do Cabo samples. This phylogroup was the most ubiquitous, present on 11 from 12 ( 91.66%) assembled samples.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-25T17:22:15Z No. of bitstreams: 1 rafael_r_c_cuadrat_ioc_bcm_0020_2010.pdf: 3574577 bytes, checksum: 65d8a71b5e600c5b8c4651cfa407aa78 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T17:22:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rafael_r_c_cuadrat_ioc_bcm_0020_2010.pdf: 3574577 bytes, checksum: 65d8a71b5e600c5b8c4651cfa407aa78 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / O uso abusivo de antibióticos nos últimos tempos tem causado o surgimento de cepas multi-resistentes, inclusive em relação às moléculas de última geração, como por exemplo as cepas de Staphylococcus aureusresistentes à Vancomicina. Isto torna importante abusca por novas moléculas com ação antimicrobiana. A indústria farmacêutica, durante décadas, tem trabalhado com a modificação química dos produtos naturais (produzidos a partir de microorganismos cultivados) na tentativa de aumentar a potência destes compostos, para torná-los eficazes contra as cepas resistentes aos atuais fármacos. Porém, a descoberta de novos compostos naturais se mostra mais eficiente emenos onerosa do que a modificação de compostos já conhecidos. Entretanto, estudos vêm demonstrando que somente uma pequena porcentagem (1%-10%) dos microrganismos presentes na natureza pode ser isolada e mantida em meios de cultura artificiais, fazendo com que estes isolados e suas respectivas moléculas sejam sempre “redescobertos”, limitando o desenvolvimento de novos fármacos. Contudo, abordagens moleculares como a metagenômica e ferramentas de bioinformática têm sido utilizadas combinadamente para o acesso direto ao DNA dos microrganismos não cultiváveis. Através da clonagem de fragmentos de DNA ambiental e posterior triagem por hibridização, PCR e sequenciamento, podemos obter informações referentes a genes que codificam moléculas de interesse biotecnológico e farmacológico, como por exemplo: lipases, esterases, celulases, quitinases, policetídeo sintases, etc. As famílias de genes que codificam as enzimas PKSs (polyketides synthases) e halogenases flanqueadoras são consideradas de interesse biotecnológico pois são produzidas no metabolismo secundário de diversos organismos e são fundamentais para a síntese de compostos antimicrobianos e antitumor. Visando a identificação e análise da variabilidade das PKSs, é interessante que se utilize amostras de DNA de ambientes com alta diversidade genética, como é o caso dos ambientes marinhos costeiros. Trabalhos preliminares realizados por nosso grupo mostram considerável diversidade em águas superficiais marinhas, composta por fungos, dinoflagelados, cianobactérias e actinobactérias não cultivados. O objetivo deste trabalho é analisar a diversidade de PKSs em ambientes marinhos, realizando inferências sobre evolução e filogenia destas enzimas. Foi possível sequenciar 5novas regiões KS de PKS tipo I iterativa e modular, além de constatar uma grande diversidade de PKS nos bancos de dados ambientais estudados. / Overuse of antibiotics in recent times has caused the emergence multi-resistents strain, including some molecules of last generation, such as strains of Staphylococcus aureus resistant to Vancomycin. This makes it important tosearch for new molecules with anti-microbial activity. The pharmaceutical industry, for decades, has worked with the chemical modification of natural products (produced from cultivated microorganisms) in an attempt to increase the potency of these compounds to make them effective against strains resistant to current drugs. However, the discovery of new natural compounds is more efficient and less costly than the modification of compounds known. However, research has shown that only a small percentage (1% -10%) of microorganisms in nature can be isolated and kept in artificial culture medium, making these isolates and their molecules are always "rediscovered" by limiting the development of new drugs. However, molecular approaches such as metagenomic and bioinformatics tools have been used in combination for direct access to the DNA of non-cultivable microorganisms. By cloning DNA fragmentsand subsequent environmental screening by hybridization, PCR and sequencing, we can obtain information about the genes that encode molecules of pharmacological and biotechnological interest, for example, lipases, esterases, cellulases, chitinases, polyketide synthases, etc. The families of genes that encode enzymes PKSs (polyketides synthases) and flanking halogenases are considered of biotechnological interest because they are producedin the secondary metabolism of different organisms and are essential for the synthesis of antimicrobial compounds and antitumor. For the identification and analysis of variability of PKSs, it is interesting to use DNA samples from environments with high genetic diversity, as is the case of coastal marine environments. Preliminary work performed by our group show considerable diversity in marine surface waters, composed of fungi, dinoflagellates, cyanobacteria and uncultured actinobacteria. The objective of this study is to analyze the diversityof PKSs in marine environments, making inferences about evolution and phylogeny of these enzymes. It was possible to sequence 5 new regions of KS type I iterative and modular, and seea great diversity of PKSs in environmental databases studied.

Orientador: Fabiana Fantinatti-Garboggini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T12:39:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mantovani_CristinaKampus_M.pdf: 1137189 bytes, checksum: 2db8a522e2d39a0ae80a5e302d4d79e8 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Nas últimas décadas um grande número de compostos de interesse biotecnológico, como por exemplo, citotoxinas, agentes antifúngicos, antimicrobianos, antivirais e anticancerígenos têm sido isolados de esponjas marinhas. Entretanto, estudos comprovam que, em muitos casos, os compostos ativos desses animais são oriundos de micro-organismos associados, que podem compor até 60% do volume tecidual das esponjas. A presente proposta teve por objetivo a caracterização taxonômica da diversidade de bactérias cultiváveis associadas às esponjas coletadas no litoral norte do estado de São Paulo, Brasil, e a avaliação da atividade antimicrobiana a partir de extratos orgânicos brutos dessas bactérias. Um total de 86 bactérias foi recuperado das esponjas Axinella corrugata, Dragmacidon reticulata, Chelonaplysilla erecta e Petromica citrina utilizando diferentes meios de cultivo. A diversidade das bactérias foi caracterizada utilizando dados de morfologia, ARDRA (Amplified Ribossomal Restriction Analysis) e sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S, cuja análise permitiu a identificação de membros pertencentes aos filos Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes e Firmicutes num total de 15 gêneros distintos. O gênero Pseudovibrio foi o único presente em todas as esponjas amostradas, e os gêneros Bacillus, Ruegeria, Vibrio, Staphylococcus e Erythrobacter estavam presentes em mais de uma esponja. A esponja Dragmacidon reticulata apresentou a maior diversidade bacteriana, englobando oito diferentes gêneros, dentre eles, um representate do gênero Cyclobacterium, o qual até onde se sabe, foi isolado pela primeira vez de uma esponja marinha. O gênero Bacillus esteve presente em três esponjas, mas na Petromica citrina, endêmica do Brasil, o gênero ficou representado em 74% dos isolados obtidos. Este estudo foi o primerio relato sobre a diversidade de bactérias cultiváveis da esponja Petromica critrina. Todos os isolados foram avaliados quanto à presença ou ausência dos fragmentos dos genes PKS (Polyketide Synthases) e NRPS (Non Ribossomal Peptide Synthetases), visando à investigação do potencial biotecnológico das bactérias, e mais da metade delas apresentaram pelo menos um dos genes estudados. Uma triagem da atividade antimicrobiana utilizando o método da difusão em bloco de ágar demonstrou que 21 isolados foram promissores para produção de antimicrobianos. Destes isolados foram obtidos os extratos orgâncios brutos, os quais foram testados quanto à determinação da concentração inibitória mínima contra oito micro-organismos indicadores. Um total de 13 extratos orgânicos brutos, em sua maioria respresentantes do gênero Bacillus, demonstraram ação contra o micro-organismo Bacillus subtilis ATCC 6051 e um deles demonstrou ação contra o micro-organismo Escherichia coli ATCC 11775. A numerosa inibição de estirpes de Bacillus por outros Bacillus sugere que a atividade possa ser gerada por bacteriocinas, polipeptídeos produzidos pela via ribossomal que atuam na inibição de crescimento de grupos próximos de micro-organismos. Sua possível função no meio ambiente é prover vantagem seletiva através da eliminação de um competidor relativamente próximo. Ainda, um representante do gênero Exiguobacterium apresentou atividade antimicrobiana contra B. subtilis, resultado este não descrito até o presente na literatura / Abstract: In recent decades a large number of compounds of biotechnological interest, such as cytotoxins, antifungal, antimicrobial, antiviral and anticancer substances have been isolated from marine sponges, however, studies show that, in many cases, the active compounds are actually produced by associated microorganisms, which can comprise up to 60% of the volume of sponge tissue. This proposal aimed to characterize the taxonomic diversity of culturable bacteria associated with sponges collected in the northern coast of São Paulo, Brazil, and to evaluate the antimicrobial activity from crude organic extracts of these bacteria. A total of 86 bacteria were recovered from sponges the Axinella corrugata, Dragmacidon reticulata, Petromica citrina and Chelonaplysilla erecta using different culture media. The diversity of bacteria was characterized using data from morphology, ARDRA (Amplified Ribossomal Restriction Analysis) and sequencing of 16S ribosomal RNA gene, whose analysis allowed the identification of members belonging to the phyla Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes and Firmicutes, in a total of 15 distinct genera. The genus Pseudovibrio was the only one present in all sponges sampled, and the genera Bacillus, Ruegeria, Vibrio, Staphylococcus and Erythrobacter were present in more than one sponge sampled. The sponge Dragmacidon reticulata showed the highest bacterial diversity, encompassing eight different genera, among which the genus Cyclobacterium, which, as far as is known, was first isolated from a marine sponge. The genus Bacillus was present in three sponges, but in Petromica citrina, endemic to Brazil, the genus accounted for 74% of the isolates. This study was the first report on the diversity of culturable bacteria from the sponge Petromica critrina. All isolates were evaluated for the presence or absence of NRPS (non ribossomal peptide synthetases) and PKS (polyketide synthase) genes in order to investigate the biotechnological potential of bacteria, and over half of the isolates had at least one of these genes. A screening of antimicrobial activity using the diffusion agar disk method showed that 21 isolates were promising for the production of antibiotics. Crude organic extracts from these isolates were produced and tested against eight indicator microorganisms to determine the minimum inhibitory concentration (MIC). A total of 13 crude organic extracts, most of the genus Bacillus, showed inhibitory activity against the microorganism Bacillus subtilis ATCC 6051, and one of them showed activity against the microorganism Escherichia coli ATCC 11775. The large inhibition of Bacillus strains to other Bacillus strains suggests that the activity can be generated by bacteriocins produced through ribosomal polypeptides that inhibit close groups of microorganisms. Its possible role in the environment is to provide a selective advantage by eliminating a relatively close competitor. Still, a representative of the genus Exiguobacterium showed antimicrobial activity against B. subtilis, which was not described in the literature up to date / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Fabiana Fantinatti Garboggini, Marta Cristina Teixeira Duarte / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T21:03:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franca_Paula_M.pdf: 7905078 bytes, checksum: 6735b6d77cec7c206090abaa6e56fdfc (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os micro-organismos associados ao continente Antártico apresentam populações diversas e metabolicamente ativas, porém o potencial farmacológico dos compostos obtidos pelos micro-organismos é pouco conhecido. As bactérias são importante fonte de compostos utilizados atualmente como antimicrobianos, e as principais vias de biossíntese de muitos antibióticos são catalisadas pelos genes PKS (Polyketide Synthases) e NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetases). O presente estudo teve como objetivo a avaliação genética e funcional da produção de compostos antimicrobianos obtidos de bactérias isoladas na Baía do Almirantado, Antártica, a identificação taxonômica das bactérias que apresentaram tal potencial e a identificação do perfil químico dos compostos antimicrobianos. O total de 153 bactérias foi isolado do ambiente antártico, 127 isolados apresentaram pelo menos um dos genes PKSI, PKSII e NRPS. Estes foram identificados através do sequenciamento parcial do gene RNA ribossomal 16S e pertencem a 28 gêneros distintos, sendo representantes dos Filos Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria e Bacteroidetes. A avaliação funcional da produção de antimicrobianos foi realizada com o total de 76 isolados dos quais 30 isolados formaram halos de inibição frente a micro-organismos testes. Os extratos brutos obtidos foram avaliados quanto à concentração inibitória mínima (MIC) frente a oito micro-organismos não virulentos, e 18 extratos brutos apresentaram atividade inibitória, onde se destaca o extrato denominado E131, obtido da bactéria do gênero Streptomyces, que apresentou atividade bacteriostática frente S. aureus e M. luteus, e atividade bactericida frente a C. albicans e B. subtilis. Frente a micro-organismos isolados de amostras clínicas, 11 extratos brutos apresentaram atividade inibitória frente a quatro cepas de Neisseria meningitides, com MIC dos extratos brutos variando de 0,0313 mg.mL-1 até 2,0 mg.mL-1. O extrato E46, obtido da bactéria Pseudoalteromonas sp., destacou-se quanto à atividade inibitória observada frente às quatro cepas avaliadas. Frente à cepa B4, destacam-se a atividade antimicrobiana dos extratos brutos obtido das bactérias Pseudoalteromonas sp. e Pseudomonas azotoformans CUG12536. Frente à cepa YUSA, destaca-se a atividade antimicrobiana observada pelo extrato bruto obtido da bactéria Marinilactibacillus sp., cuja atividade antimicrobiana foi relatada pela primeira vez neste gênero de bactéria. Os extratos brutos possuem em sua composição, compostos cuja atividade antimicrobiana é conhecida, como ácidos graxos e compostos cuja atividade antimicrobiana não está descrita na literatura. Os testes de fracionamento dos extratos frente a solventes de diferentes polaridades indicou que os extratos brutos são solúveis, em sua maioria, a solvente polar. Portanto, as bactérias isoladas da Antártica produzem compostos de interesse farmacológico e podem ser utilizadas como fonte de novos compostos. Tais resultados enfatizam a necessidade de mais estudos de bactérias associadas a ambientes extremos, como a Antártica / Abstract: Microorganisms associated with the Antarctic continent have various and metabolically active populations, but the pharmacological potential of compounds obtained by micro-organisms is poorly understood. Bacterias are an important source of compounds currently used as antimicrobial, major biosynthetic pathways of many antibiotics are catalyzed by the PKS genes (Polyketide Synthases) and NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetases). This study had the objective to genetic and functional evaluation of the antimicrobial activity of bacteria isolated in Admiralty Bay, Antarctica, and the taxonomic identification of bacteria that had such potential and identification of the chemical profile of antimicrobial compounds. The total of 153 bacteria was isolated from Antarctic environment, among the isolates, 127 isolates showed at least one of the genes PKSI, PKSII and NRPS. These were identified by partial sequencing of 16S ribosomal RNA gene and belong to 28 different genera, with representatives of the phyla Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria and Bacteroidetes. The functional evaluation of the production of antibiotic was conducted with a total of 76 isolates including 30 isolates that formed inhibition halos against test microorganisms. The crude extracts were evaluated as the minimum inhibitory concentration (MIC) against eight non-virulent microorganisms, and 18 crude extracts showed activity, highlighting the so-called E131 extract, obtained from bacteria of the genus Streptomyces, which showed bacteriostatic activity against S. aureus and M. luteus, and bactericidal activity against C. albicans and B. subtilis. Faced with microorganisms isolated from clinical samples, 11 crude extracts showed inhibitory activity against four strains of Neisseria meningitides, with MIC ranging from 0.0313 mg.mL-1 to 2.0 mg.mL-1. The E46 extract obtained from the bacterium Pseudoalteromonas sp., stood out as the inhibitory activity observed across the four evaluated strains. Faced with the strain B4, stand out the antimicrobial activity of crude extracts obtained from bacteria Pseudoalteromonas sp. and Pseudomonas azotoformans CUG12536. Against YUSA strain, Marinilactibacillus sp. crude extract showed antimicrobial activity, which was the first reported in this bacterial genus. The extracts have in their composition, antimicrobial compounds whose activity is known, such as fatty acids, and compounds whose antimicrobial activity is not described in the literature. Fractionation tests of extracts using solvents of different polarities, indicated that the crude extracts are soluble mostly the polar solvent. Therefore, the bacteria isolated from the Antarctic produce compounds of pharmacological interest and can be used as a source of novel compounds. These results highlight the need for more studies of bacteria associated with extreme environments, such as Antarctica / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular