To investigate the in vitro antioxidant properties of the ovulation induction drug, Citrate clomiphene (CC), and to access whether its effects are influenced by the Ala16Val polymorphism in the SOD2 gene, which encodes mitochondrial manganese superoxide dismutase (SOD), an in vitro experimental study testing the effect of different concentrations of CC on antioxidant capacity, reactive oxygen species (ROS) production and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) culture viability was performed. A total of 58 healthy adult women were genotyped for the Ala16Val SOD2 polymorphism, and blood samples were collected to perform in vitro experiments analyzing the biological antioxidant effects of CC. Free radical production and cytotoxicity assays were performed on blood and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with different Ala16Val SOD2 genotypes. According to the observations described here, CC exhibited antioxidant effects. Additionally, the CC treatments led to a decrease in ROS production, with blood samples from the AA genotype displaying a more responsive antioxidant effect from CC than other genotypes. AA and AV PBMCs showed an increase in viability following treatment with 10 μM CC when compared with PMBCs from control groups. In the VV PBMC group, only the 5 μM and 10 μM CC treatments presented a significant positive viability effect. The CC exhibits antioxidant activity, similar to that observed with other Selective Estrogen Receptor Modulators (SERMs), in the presence of the Ala16Val-SOD2 polymorphism suggesting pharmacogenetic effect. / Para investigar in vitro as propriedades antioxidantes de drogas que induzem a ovulação, como citrato de clomifeno (CC) e verificar se os efeitos são influenciados pelo polimorfismo Ala16Val do gene da SOD2, o qual codifica a superóxido dismutase (SOD) mitocondrial dependente de manganês. Um estudo experimental in vitro foi conduzido testando o efeito de diferentes concentrações de CC sobre a capacidade antioxidante, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e na viabilidade de células mononucleadas de sangue periférico (CMSP) em cultura celular. Um total de 58 mulheres adultas saudáveis foram genotipadas para o polimorfismo Ala16Val do gene da SOD2, e sangue foi coletado para realizar os experimentos in vitro e analisar os efeitos antioxidantes biológicos do CC. A produção de radicais livres e análise de citotoxicidade foram conduzidas em sangue e CMSP com diferentes genótipos do Ala16Val SOD2. De acordo com as observações descritas aqui, o CC exibiu um efeito antioxidante. Adicionalmente, os tratamentos com CC levaram a um decréscimo na produção de EROs, com amostras de sangue o genótipo AA desenvolveu um efeito antioxidante mais responsivo para o CC do que os outros genótipos. A cultura de CMSP dos genótipos AA e AV mostraram um aumento na viabilidade seguida do tratamento com 10μM CC quando comparada com as culturas CMSP do grupo controle. No grupo de cultura CMSP do genótipo VV, somente os tratamentos com 5μM e 10μM de CC apresentaram efeito positivo na viabilidade. O CC apresentou uma atividade antioxidante similar à observada com outros moduladores seletivos dos receptores de estrogênio (SERMs). Entretanto, essa atividade foi influenciada pelos diferentes genótipos do polimorfismo Ala16Val SOD2 sugerindo efeito farmacogenético.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Pampa Biome has a great biodiversity of plants, among them the Family Malvaceae. Despite the medicinal use of many of these plants, studies on the biological activity of these are still very scarce. This is the case of the plant known as "erva de ovelha", which is traditionally used in therapy against prostate cancer, used as tea and prepared from two species of the genus Pavonia, highlighting the Pavonia xanthogloea. Therefore, this study aimed to identify bioactive compounds in the extract and five fractions of P. xanthogloea, evaluating their antioxidant and antitumor action in the lineage of prostate cancer DU145. Additionally, the potential cytotoxic effect via pharmacogenetic studies on human red blood cells (RBCs) bearers of different genotypes of the polymorphism found in the gene of the enzyme superoxide dismutase manganese dependent (Ala16Val-SOD2). These RBCs afterwards were exposed to extract and fractions of P. xanthogloea. The results were arranged and shown as three scientific papers. Manuscript 1: The chemical composition of the extract and fractions (ethyl acetate, hexane, n-butanol, aqueous and dichloromethane) was determined by liquid chromatography of high efficiency. The antioxidant activity was determined by DPPH assay. The antioxidant activity and the cytotoxicity evaluated by exposure of human lymphocytes exposed to different concentrations of extract/fractions with and without sodium nitroprusside and H2O2. Tiliroside was found in all extracts. The aqueous and ethyl acetate fractions showed high antioxidant capacity. The crude extract (ethanol) and hexane, n-butanol and aqueous fractions reverts the ROS levels generated by H2O2. The crude extract and hexane, ethyl acetate and n-butanol fractions do not cause cytotoxicity. The aqueous fraction was cytotoxic at concentration of 300 μg/mL. The reversal of the cytotoxicity caused by SNP was dependent on the concentration and extract/fraction. The dichloromethane fraction was cytotoxic at all concentrations. The results suggest potential medicinal use of this species. Manuscript 2: The study evaluated in vitro the hemolytic effect of chelerythrine (CHE), alkaloid extracted from Zanthoxylum rhoifolium, and the possible pharmacogenetic influence of SOD2-Ala16Val in RBCs. The CHE inhibits protein kinase C activity decreasing the RBCs deformation and causing oxidative stress. Blood was collected from healthy subjects previously genotyped for the polymorphism Ala16Val-SOD2. The CHE was incubated with RBCs (1 × 109 cell/mL) at concentrations 0.1 μM, 2 μM and 8 μM. Pharmacogenetic effect was evaluated through spectrophotometric analysis of indicators of oxidative stress, lipid peroxidation, catalase, advanced oxidation protein products (AOPP) and nitrate/nitrite (NOx), and hemolysis. The RBCs were maintained under controlled conditions. The response to treatment with CHE was genotype dependent and AA RBCs were more sensitive than VV. The SOD2 plays an important role in erythropoiesis and causes an impact on the quality of RBC. Therefore, the results presented here suggest toxicogenetic influence of SOD2 in hemolytic assay using human cells. Manuscript 3: To evaluate the antitumor effect viability assays of (24 hour exposure) and cell proliferation (72 hour exposure) were performed by MTT assay and spectrophotometric analisys. The pharmacogenetic effect through the hemolysis assay by spectrophotometry. Blood was collected from healthy subjects previously genotyped for the polymorphism Ala16Val-SOD2. Both erythrocytes and tumor cells were grown under controlled conditions. Study the pattern of hemolysis associated with different genotypes of the polymorphism Ala16Val-SOD2 suggests pharmacogenetic effect. When hemolysis assay was performed for different concentrations of extract and fractions of P. xanthogloea the anti-hemolytic protective effect observed was independent of the gene SOD2. Cytotoxic and antiproliferative activity was observed in the cell lineage of prostate cancer DU145 was dependent on the type of extract/fraction and concentration, highlighting n-butanol fraction that showed strong antiproliferative activity. These results showed great similarity to antitumor activity of doxorubicin chemotherapeutic and also seem to be associated with tiliroside isolated from P. xanthogloea. The overall results match with the popular use of P. xanthogloea regarding the prostate cancer therapy. However, further investigations should be performed to evaluate the antitumor action mechanisms of P. xanthogloea. / O Bioma Pampa possui uma grande biodiversidade de plantas, entre as quais as da Família Malvaceae. Apesar do uso medicinal de muitas destas plantas, estudos sobre a atividade biológica das mesmas ainda são muito escassos. Este é o caso da planta conhecida como erva de ovelha , que é tradicionalmente utilizada na terapia contra o câncer de próstata, na forma de chá e preparado a partir de duas espécies do gênero Pavonia, com destaque a Pavonia xanthogloea. Portanto, o presente estudo teve como objetivo principal identificar compostos bioativos do extrato e cinco frações de P. xanthogloea, avaliando a sua ação antioxidante e antitumoral na linhagem de câncer de próstata DU145. Adicionalmente, o potencial efeito citotóxico via estudos farmacogenéticos em células sanguíneas vermelhas (RBCs) humanas, portadoras de diferentes genótipos do polimorfismo encontrado no gene da enzima superóxido dismutase dependente de manganês (Ala16Val-SOD2). Estas RBCs posteriormente foram expostas ao extrato e frações da P. xanthogloea. Os resultados obtidos foram organizados e apresentados sob a forma de três artigos científicos. Manuscrito 1: A composição química do extrato e frações (acetato de etila, n-butanol, hexano, aquosa e diclorometano) foi determinada por cromatografia de líquida de alta eficiência. A capacidade antioxidante foi determinada pelo ensaio do DPPH. A atividade antioxidante e a citotoxicidade avaliada através da exposição de linfócitos humanos expostos a diferentes concentrações de extrato/frações com e sem nitroprussiato sódico e H2O2. O tilirosídeo foi encontrado em todos os extratos. As frações aquosa e acetato de etila mostraram alta capacidade antioxidaente. O extrato bruto (etanólico) e frações hexano, aquosa e n-butanol revertem os níveis de ROS gerados pelo H2O2. O extrato bruto e frações hexano, acetato de etila e n-butanol não causam citotoxidade. A fração aquosa foi citotóxica na concentração de 300 μg/mL. A reversão da citotoxicidade causada pelo SNP foi dependente do extrato/fração e da concentração. A fração diclorometano foi citotóxica em todas as concentrações. O resultado sugere potencial uso medicinal desta espécie. Manuscrito 2: O estudo avaliou in vitro o efeito hemolítico da Queleritrina (CHE), alcaloide extraído da Zanthoxylum rhoifolium, e da possível influência farmacogenética da SOD2-Ala16Val em RBCs. A CHE inibe a atividade da proteina quinase C diminuindo a deformação das RBCs e causando estresse oxidativo. O sangue foi coletado de sujeitos saudáveis, previamente genotipados para o polimorfismo Ala16Val-SOD2. A CHE foi incubada com RBCs (1 × 109 cell/mL) nas concentrações 0.1 μM, 2 μM and 8 μM. O efeito farmacogenético foi avaliado através de análises espectrofotométricas de indicadores do estresse oxidativo, lipoperoxidação, catalase, produtos avançados da oxidação de proteínas (AOPP) e nitrato/nitrito (NOx), e hemólise. As RBCs foram mantidas em condições controladas. A resposta ao tratamento com CHE foi genótipo dependente e, RBCs AA foram mais sensíveis que as VV. A SOD2 tem um importante papel na eritropoiese e causa impacto na qualidade das RBC. Portanto, os resultados aqui apresentados sugerem influência toxicogenética de SOD2 em ensaio hemolítico utilizando células humanas. Manuscrito 3: Para avaliar o efeito antitumoral foram feitos ensaios de viabilidade (24 horas de exposição) e proliferação celular (72 horas de exposição) e análise espectrofotométrica pelo ensaio MTT. O efeito farmacogenético através do ensaio de hemólise, por espectrofotometria. O sangue foi coletado de sujeitos saudáveis, previamente genotipados para o polimorfismo Ala16Val-SOD2. Tanto os eritrócitos quanto as células tumorais foram cultivadas em condições controladas. O estudo do padrão de hemólise associado aos diferentes genótipos do polimorfismo Ala16Val-SOD2 sugere efeito farmacogenético. Quando foi realizado ensaio de hemólise para diferentes concentrações do extrato e frações de P. xanthogloea o efeito anti-hemolítico protetor observado foi independente do gene da SOD2. Atividade citotóxica e antiproliferativa observada na linhagem celular de câncer de próstata DU145 foi dependente do tipo de extrato/fração e concentração, com destaque a fração butanol que apresentou intensa atividade antiproliferativa. Estes resultados apresentaram grande similaridade a atividade antitumoral do quimioterápico doxirrubicina e também parecem estar associados ao tilirosídeo, isolado da P. xanthogloea. O conjunto dos resultados condizem com o uso popular da P. xanthogloea em relação a terapia do câncer de próstata. Entretanto, investigações complementares devem ser feitas para avaliar os mecanismos de ação antitumorais da P. xanthogloea.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Epidemiological studies suggest that the imbalance in antioxidant enzymes activity genetically caused, increases the risk of metabolic disorders and chronic noncommunicable diseases. This is the case of polymorphism that occurs in an substitution of Alanine (A) by a Valine (V) at codon 16 of the gene for superoxide dismutase manganese-dependent (Ala16Val-SOD2). The A allele has a higher efficiency of catalysis than allele V. However, this efficiency increases the levels of H2O2 leading to a consequent oxidative imbalance that, in turn, increases the risk of cancer. Furthermore, the V allele that presents a smaller efficiecy SOD2 is associated with endothelial dysfunction and cardiometabolic. Therefore, Ala16VALSOD2 polymorphism serves as a model for in vitro analysis of differential responses to pro and antioxidants factors. The objective of this study was to investigate the in vitro response of lymphocytes culture with different genotypes (AA, VV and AV) from healthy subjects exposed to ultraviolet (UV) is a pro-oxidant factor. In lymphocyte not exposed and UV exposed it was analyzed the cytotoxic variables (cell viability, mitotic index), biomarkers of oxidative metabolism (lipid peroxidation, enzymatic activity of SOD, catalase, thiol groups, protein carbonylation, total polyphenols and ascorbic acid) and genotoxic effects (by Comet Assay and chromosomal instability). The results showed that cells carrying the AA genotype had higher cell viability and mitotic index. However, after UV exposure such viability was similar between genotypes. At baseline levels higher SOD and total polyphenol levels were observed in AA genotype when compared to the VV genotype. However, lymphocytes AA had higher rates of DNA damage in the presence of UV radiation. These results suggest that the polymorphism Ala16Val-SOD2 may differentially affect the toxicity factors such as UV radiation. / Estudos epidemiológicos sugerem que o desbalanço na atividade de enzimas antioxidantes, geneticamente causado, aumenta o risco de disfunções metabólicas e doenças crônicas não-transmissíveis. Este é o caso do polimorfismo em que ocorre uma troca da Alanina (A) por uma Valina (V) no códon 16 do gene da enzima superóxido dismutase dependente de manganês (Ala16Val-SOD2). O alelo A possui uma eficiência de catálise maior do que o alelo V. Entretanto, esta maior eficiência aumenta os níveis de H2O2 levando a um conseqüente desbalanço oxidativo que, por sua vez, aumenta o risco de neoplasias. Por outro lado, o alelo V que apresenta uma SOD2 menos eficiente está associado a disfunções endoteliais e cardiometabólicas. Portanto, este polimorfismo serve como modelo in vitro para análises de respostas diferenciais a agentes pró e antioxidantes. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi investigar a resposta in vitro de cultura de linfócitos com diferentes genótipos (AA, VV e AV), provenientes de indivíduos saudáveis, expostas a radiação ultravioleta (UV) que é um fator pró-oxidante. Antes e após exposição, foram analisados os efeitos citotóxicos (viabilidade celular e índice mitótico), indicadores do metabolismo oxidativo (peroxidação lipídica, atividade enzimática da SOD, catalase, grupos tióis, polifenóis totais e de ácido ascórbico) e efeitos genotóxicos (dano de DNA pelo Ensaio Cometa e instabilidade cromossômica,). Os resultados mostraram que as células portadoras do genótipo AA apresentaram maior viabilidade celular e índice mitótico. Entretanto, após a exposição UV tal viabilidade foi similar entre os genótipos. Em condições basais níveis elevados de SOD e polifenóis totais plasmáticos foram observados no genótipo AA em relação ao genótipo VV. Porém, linfócitos AA apresentaram maior índice de danos no DNA na presença da radiação UV. Estes resultados sugerem que o polimorfismo Ala16Val- SOD2 pode afetar diferencialmente a toxicidade a fatores como a radiação UV.