Plant breeding is focused on selection of new genotypes with improved traits. Conventional methods based on hybridization and those based on biotechnology (somatic hybridization, genetic transformation, ploidy manipulation, etc.) are used to create novel genetic variations. Biotechnology provides powerful tools for plant breeding, for instance, haploid technology allows achievement of homozygous lines from heterozygous parents in one step, which reduces significantly the time required by conventional methods. Concerning woody species, characterized by self-incompatibility, long juvenile period and high degree of heterozygosity, this technique is the only way to get homozygous lines. Haploid plants are of great interest for breeding and genomic studies, being used in mutation research, genetic analysis, genome mapping and gene transfer. Gametic embryogenesis, based on cellular totipotency, produces an embryo from an immature gamete, by switching its developmental pathway from gametophytic to sporophytic. This research is focused on inducing gametic embryogenesis in two important Mediterranean fruit crops: almond (Prunus dulcis Mill.) via in vitro anther culture and mandarin (Citrus reticulata Blanco) via isolation and microspore culture. Also ploidy manipulation was applied to loquat (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.) for getting genotypes whit different ploidy levels. The experiments were carried out through years 2014, 2015 and 2016 at the 'Università degli Studi di Palermo' (UNIPA) as well as at the 'Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias' (IVIA). Regarding the almond anther culture, formation of calli and production of embryos was achieved through the direct embryogenesis route. On then other hand, early embryo regeneration is reported, for the first time, from isolated microspore culture of mandarin, 'Mandarino Tardivo di Ciaculli'. Our results report the evidence of gametic embryogenesis and the production of homozygous regenerants in almond and mandarin, two species extremely recalcitrant to microspore embryogenesis. However, the results are affected by many factors that need further studies to better understand the embryogenic development and to increase the rate of embryo achievement. Moreover, another biotechnological tool (ploidy manipulation) was also applied for implementing the IVIA loquat breeding program. Polyploid plants are of great interest in this species, due to its potential for producing seedless genotypes via direct use of triploids or crosses between tetra and diploids. Aimed at obtaining new loquat genotypes, with different ploidy levels (polyploids), colchicine was applied to seeds before germination, to induce chromosome duplication. A total of three triploids (3x) and one tetraploid (4x) were obtained. / La mejora genética tiene como objetivo la selección de nuevos genotipos con mejores características. Los métodos de mejora convencional basados en hibridaciones y aquellos basados en Biotecnología (hibridación somática, transformación genética, manipulación de la ploidía, etc.) se utilizan para obtener nueva variación genética. La Biotecnología proporciona herramientas poderosas en mejora genética, por ejemplo, la obtención de haploides permite obtener líneas homocigotas en un solo paso, disminuyendo significativamente el tiempo requerido usando métodos convencionales. Respecto a especies leñosas, caracterizadas por autoincompatibilidad floral, largo período juvenil y alto grado de heterocigosidad, esta técnica es el único método de obtención de líneas homocigotas. Los genotipos haploides tienen un alto interés en estudios genómicos, siendo utilizados en estudios de mutaciones, análisis genéticos, mapeo genético y transferencia genética. Este estudio tiene como objetivo la inducción de embriogénesis gamética en dos especies mediterráneas muy importantes: el almendro (Prunus dulcis Mill.) por medio de cultivo in vitro de anteras y el mandarino (Citrus reticulata Blanco) por medio de aislamiento de microesporas. Además, se ha estudiado la obtención de poliploides en níspero (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.) con el objetivo de obtener genotipos con diversos niveles de ploidía. Los experimentos se llevaron a cabo en los años 2014, 2015 y 2016 en la 'Università degli Studi di Palermo' (UNIPA) y en el 'Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias' (IVIA). Respecto al cultivo de anteras en almendro, la formación de callos y producción de embriones se obtuvo mediante embriogénesis directa. Por otro lado, se ha conseguido regenerar por primera vez embriones a partir de microesporas aisladas en el cultivar de mandarino 'Mandarino Tardivo di Ciaculli'. Los resultados obtenidos muestran que la embriogénesis gamética y la regeneración de embriones homocigótos en almendro y mandarino, dos especies extremadamente recalcitrantes para la embriogenésis a partir de microesporas, es posible. Sin embargo, los resultados se ven afectados por muchos factores que necesitan estudios adicionales para comprender mejor el desarrollo embriogénico y para aumentar la tasa de obtención del embriones. Además, otra herramienta biotecnológica (manipulación de la ploidía) se aplicó con el objetivo de implementar el programa de mejora de níspero del IVIA. Las plantas poliploides en esta especie tienen un alto interés, pues podrían permitir la obtención de frutos sin semilla, por medio de la obtención directa de triploides o mediante cruzamiento entre tetraploides y diploides. Con el objetivo de obtener nuevos genotipos de níspero con diferentes niveles de ploidía (poliploides), se aplicó colchicina a semillas sin germinar con el fin de inducir la duplicación cromosómica y se obtuvieron 3 triploides (3x) y un tetraploide (4x). / La millora genètica té com objectiu la selecció de nous genotips amb millors característiques. Els mètodes de millora convencional basats en hibridacions i aquells basats en Biotecnologia (hibridació somàtica, transformació genètica, manipulació de la ploïdia, etc.) s'utilitzen per aconseguir nova variació genètica. La Biotecnologia proporciona eines poderoses en millora genètica, per exemple, l'obtenció d'haploides permet obtenir línies homozigòtiques en un sol pas, disminuint significativament el temps requerit usant mètodes convencionals. Pel que fa a espècies llenyoses, caracteritzades per autoincompatibilitat floral, llarg període juvenil i alt grau d'heterozigosi, aquesta tècnica és l'únic mètode d'obtenció de línies homozigòtiques. Els genotips haploides tenen un alt interès en estudis genòmics, sent utilitzats en estudis de mutacions, anàlisis genètics, mapatge genètic i transferència genètica. Aquest estudi té com objectiu la inducció d'embriogènesi gamètica en dos espècies mediterrànies molt importants: l'ametller (Prunus dulcis Mill.) a través del cultiu in vitro d'anteres i el mandariner (Citrus reticulata Blanco) per mitjà d'aïllament de micròspores. A més a més, s'ha estudiat l'obtenció de poliploides en nespra (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.) Amb l'objectiu d'aconseguir genotips amb diversos nivells de ploïdia. Els experiments es van dur a terme en els anys 2014, 2015 i 2016 a la 'Università degli Studi di Palermo' (UNIPA) i a 'l'Institut Valencià d'Investigacions Agràries' (IVIA). Respecte al cultiu d'anteres en ametller, la formació de calls i producció d'embrions es va obtenir mitjançant embriogènesi directa. D'altra banda, s'ha aconseguit per primera vegada la regeneració d'embrions a partir de micròspores aïllades en el conrear de mandariner 'Mandarino Tardivo di Ciaculli'. Els resultats obtinguts mostren que l'embriogènesi gamètica i la regeneració d'embrions homozigotics en ametller i mandariner, dues espècies extremadament recalcitrants per l'embriogènesi a partir de micròspores, és possible. No obstant això, els resultats es veuen afectats per molts factors que necessiten estudis addicionals per entendre millor el desenvolupament embriogènic i per augmentar la taxa d'obtenció dels embrions. A més, una altra eina biotecnològica (manipulació de la ploïdia) es va aplicar amb l'objectiu d'implementar el programa de millora de nespra de l'IVIA. Les plantes poliploides en aquesta espècie tenen un alt interès, ja que podrien permetre l'obtenció de fruits sense llavor, per mitjà de l'obtenció directa de triploides o mitjançant encreuament entre tetraploides i diploides. Amb l'objectiu d'aconseguir nous genotips de nespra amb diferents nivells de ploïdia (poliploides), es va aplicar colquicina a llavors sense germinar per tal d'induir la duplicació cromosòmica i es van obtenir 3 triploides (3x) i un tetraploide (4x). / Cimò, G. (2017). Ploidy manipulation for genetic improvement in some Mediterranean fruit crops [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/79874 / TESIS

Orientadores: Flavio Antonio Maës dos Santos, Maria Imaculada Zucchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:19:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silvestrini_Milene_D.pdf: 3891912 bytes, checksum: 6bb6bd65f788f261b8387e6c9daf17f8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A estrutura genética espacial de populações de plantas pode variar ao longo dos estádios ontogenéticos, através das gerações e entre diferentes condições ambientais. Estas mudanças são direcionadas por fatores ecológicos e evolutivos. As espécies pioneiras apresentam histórias de vida e estruturas populacionais características que são afetadas principalmente pelas mudanças ambientais geradas por distúrbios naturais ou antrópicos. O objetivo deste trabalho foi investigar como as características do ciclo de vida, os processos ecológicos e fatores genéticos associados aos distúrbios afetam a diversidade e estrutura genética de populações de uma espécie arbórea pioneira. Nós estudamos Croton floribundus Spreng. (Euphorbiaceae), uma espécie arbórea pioneira abundante em clareiras e em áreas secundárias da Floresta Estacional Semidecidual, em duas áreas com níveis contrastantes de distúrbios antrópicos: uma floresta primária e uma floresta secundária em estádio inicial de sucessão. A fim de abordar a principal questão deste estudo, nós avaliamos o padrão de distribuição da espécie sob as diferentes condições ambientais geradas por distúrbios naturais e antrópicos (Capítulo I); testamos e caracterizamos iniciadores universais cloroplastidiais (cpSSR) para C. floribundus (Capítulo II); desenvolvemos e caracterizamos marcadores microssatélites nucleares (SSR) para C. floribundus bem como examinamos algumas características citogenéticas da espécie com o objetivo de testar a ocorrência de poliploidia e avaliar sua implicação para o uso dos marcadores SSR (Capítulo III); avaliamos a diversidade e estrutura genética de C. floribundus entre duas classes de tamanho e entre populações em uma floresta primária e uma floresta secundária em estádio inicial de sucessão (Capítulo IV). C. floribundus foi frequente e igualmente distribuído em clareiras de todos os tamanhos na floresta primária, mas sua estrutura populacional variou entre áreas com níveis contrastantes de distúrbio antrópico. Seis locos cpSSR foram otimizados e caracterizados em C. floribundus. O estudo citogenético permitiu a caracterização mais precisa dos locos SSR, bem como forneceu novos dados sobre a origem e a evolução da espécie. O número de bivalentes observados na meiose, n = 56 (2n = 8x = 112), mostrou a ocorrência de poliploidia em todas as populações estudadas. Altos níveis de diversidade genética foram encontrados para C. floribundus. A dispersão de sementes e as colonizações (e extinções) foram determinantes para a estrutura genética em fina escala encontrada nas populações de C. floribundus em ambos os tipos de florestas. Além disso, os efeitos destes processos associados aos distúrbios antrópicos parecem aumentar fortemente a diferenciação genética entre as populações na floresta em estádio inicial de sucessão. As análises de marcadores moleculares nucleares e cloroplastidias sugeriram que o fluxo gênico por pólen é responsável por manter a diversidade genética dentro das populações de C. floribundus tanto na floresta primária quanto na floresta secundária em estádio inicial de sucessão. Nesta última, o fluxo gênico por sementes parece ser igualmente importante. Os resultados obtidos mostraram que a dinâmica de clareiras, o processo de colonização e a dispersão de pólen e sementes afetam a diversidade e estrutura genética da espécie arbórea pioneira, aumentando-os ou diminuindo-os conforme o número de colonizadores, número de populações-fonte, as taxas de fluxo gênico e o nível de perturbação antrópica da área / Abstract: The spatial genetic structure of plant populations may vary across life stages, across generations and among different environmental conditions. These changes are driven by evolutionary and ecological forces. Pioneer tree species exhibit particular life histories and population structures that are mainly affected by environmental changes generated by natural or human disturbances. Our aim was to investigate how the life-history traits, ecological processes, and the genetic factors associated to natural and human disturbances can affect the genetic diversity and structure of populations of a pioneer tree species. We studied Croton floribundus Spreng. (Euphorbiaceae), a pioneer tree species abundant in gaps and secondary areas of the semi-deciduous tropical forest, in two areas with contrasting levels of human disturbance: a primary forest and an early successional forest. In order to address the main question of this study, we examined the pattern of distribution of the species under the different environmental conditions generated by natural and human disturbances (Chapter I); tested and characterized universal chloroplast microsatellite (cpSSR) primers for C. floribundus (Chapter II); developed and characterized nuclear microsatellite (SSR) markers for C. floribundus as well as examined some cytogenetic traits of the species in order to test for polyploidy and to evaluate its implications for the appropriate use of the SSR markers (Chapter III); and evaluated the genetic diversity and structure of C. floribundus between two size classes and among populations in the primary forest and in the early successional forest (Chapter IV). C. floribundus was widespread and equally distributed along the gap size range in the primary forest, but its population structure varied between areas with contrasting levels of human disturbance. Six universal cpSSR loci were optimized and characterized for C. floribundus. The cytogenetic study allowed the accurate characterization of SSR loci as well as provided new data on the origin and evolution of the species. The number of bivalents observed in meiosis n=56 (2n=8x=112) showed the occurrence of polyploidy in all populations studied. High genetic diversity levels were found for C. floribundus. Seed dispersal and colonizations (and extinctions) were determinants of the fine-scale genetic structure of C. floribundus in both forest types. Also, their effects associated to the human disturbances seem to strongly increase the genetic differentiation among populations in the early successional forest. Analysis of nuclear and chloroplast markers suggested that gene flow by pollen is responsible for maintaining the genetic diversity within populations of C. floribundus in both primary and early successional forests. In the latter, gene flow by seeds seem to be equally important. The results showed that gap dynamics, colonization process, and pollen and seed dispersal affect the genetic diversity and structure of the pioneer tree species by increasing or decreasing them depending mainly on the number of colonizers, the number of source populations, the gene flow rates, and the level of human disturbance of the area / Doutorado / Ecologia / Doutora em Ecologia

Desde os primórdios da agricultura e pecuária, o homem seleciona indivíduos com características desejáveis para reprodução e aumento da proporção de novos indivíduos com tais qualidades. Com o conhecimento da estrutura de DNA e o advento da engenharia genética, a identificação e caracterização de espécies e indivíduos conta com novas tecnologias para auxiliar no desenvolvimento de novas variedades de plantas e animais para diversos fins. Tais tecnologias envolvem procedimentos bioquímicos e físicos cada vez mais apurados que produzem medidas cada vez mais precisas, um exemplo disso são as técnicas que empregam a espectometria de massa para comparar polimorfismos de base única (SNPs). Nas plantas é comum a ocorrência de poliploidia, que consiste na presença de mais de dois cromossomos num mesmo grupo de homologia. A determinação do nível de ploidia é fundamental para a correta genotipagem e por consequência maior eficiência no estudo e aprimoramento genético de plantas. Neste trabalho caracterizamos o fenômeno da poliploidia com modelos probabilísticos de urnas e bolas, propondo um método eficiente e adequado de simulação, assim como uma técnica simples para inferir níveis de ploidia e classificar amostras bialélicas aproveitando características geométricas do problema. Análises de dados simulados e reais provenientes de um experimento de cana-de-açúcar foram realizadas com diferentes medidas de separação entre agrupamentos e diferentes condições experimentais. Para os dados reais, métodos gráficos descritivos evidenciam a corretude e coerência do método proposto, que pode ser generalizado para a genotipagem de locos multialélicos poliplóides. Encerramos o trabalho comparando nossos resultados com a abordagem SuperMASSA [Serang2012] que trouxe excelentes resultados ao problema. Todo código desenvolvido em linguagem R está disponibilizado com o texto. / Since the beginnings of agriculture and livestock, the man selects individuals with desirable characteristics to breed and increase the proportion of new individuals with such qualities. With knowledge of the DNA structure and the advent of genetic engineering, the identification and characterization of individual species can make use of new technologies to help develop new varieties of plants and animals for many purposes. These technologies involve complex biochemical and physical procedures that produce even more accurated measures, like techniques that employ mass spectrometry to compare single nucleotide polymorphisms (SNPs). In plants it is common the occurrence of polyploidy, which is the presence of more than two chromosomes in the same group of homology. The determination of polyploidy level is essential for correct SNPs genotype calling and therefore greater efficiency in the study and genetic improvement of plants. In this work we characterize the phenomenon of poliploidy with probabilistic urns and balls models, proposing an efficient and appropriate method of simulation, as well as a simple technique to infer ploydy levels and classify biallelic samples accurately taking advantage of geometrical characteristics of the problem. Analysis of simulated and real data from an experiment of sugarcane were conducted with different measures of separation between groups and different experimental conditions. For the actual data, descriptive graphical methods show the correctness and consistency of the proposed method, which can be generalized to multi-allelic loci genotyping polyploid. We end our work comparing our results with the SuperMASSA [Serang2012] approach that brought excellent results to the problem. All code developed in language R were provided with the text.

Desde os primórdios da agricultura e pecuária, o homem seleciona indivíduos com características desejáveis para reprodução e aumento da proporção de novos indivíduos com tais qualidades. Com o conhecimento da estrutura de DNA e o advento da engenharia genética, a identificação e caracterização de espécies e indivíduos conta com novas tecnologias para auxiliar no desenvolvimento de novas variedades de plantas e animais para diversos fins. Tais tecnologias envolvem procedimentos bioquímicos e físicos cada vez mais apurados que produzem medidas cada vez mais precisas, um exemplo disso são as técnicas que empregam a espectometria de massa para comparar polimorfismos de base única (SNPs). Nas plantas é comum a ocorrência de poliploidia, que consiste na presença de mais de dois cromossomos num mesmo grupo de homologia. A determinação do nível de ploidia é fundamental para a correta genotipagem e por consequência maior eficiência no estudo e aprimoramento genético de plantas. Neste trabalho caracterizamos o fenômeno da poliploidia com modelos probabilísticos de urnas e bolas, propondo um método eficiente e adequado de simulação, assim como uma técnica simples para inferir níveis de ploidia e classificar amostras bialélicas aproveitando características geométricas do problema. Análises de dados simulados e reais provenientes de um experimento de cana-de-açúcar foram realizadas com diferentes medidas de separação entre agrupamentos e diferentes condições experimentais. Para os dados reais, métodos gráficos descritivos evidenciam a corretude e coerência do método proposto, que pode ser generalizado para a genotipagem de locos multialélicos poliplóides. Encerramos o trabalho comparando nossos resultados com a abordagem SuperMASSA [Serang2012] que trouxe excelentes resultados ao problema. Todo código desenvolvido em linguagem R está disponibilizado com o texto. / Since the beginnings of agriculture and livestock, the man selects individuals with desirable characteristics to breed and increase the proportion of new individuals with such qualities. With knowledge of the DNA structure and the advent of genetic engineering, the identification and characterization of individual species can make use of new technologies to help develop new varieties of plants and animals for many purposes. These technologies involve complex biochemical and physical procedures that produce even more accurated measures, like techniques that employ mass spectrometry to compare single nucleotide polymorphisms (SNPs). In plants it is common the occurrence of polyploidy, which is the presence of more than two chromosomes in the same group of homology. The determination of polyploidy level is essential for correct SNPs genotype calling and therefore greater efficiency in the study and genetic improvement of plants. In this work we characterize the phenomenon of poliploidy with probabilistic urns and balls models, proposing an efficient and appropriate method of simulation, as well as a simple technique to infer ploydy levels and classify biallelic samples accurately taking advantage of geometrical characteristics of the problem. Analysis of simulated and real data from an experiment of sugarcane were conducted with different measures of separation between groups and different experimental conditions. For the actual data, descriptive graphical methods show the correctness and consistency of the proposed method, which can be generalized to multi-allelic loci genotyping polyploid. We end our work comparing our results with the SuperMASSA [Serang2012] approach that brought excellent results to the problem. All code developed in language R were provided with the text.