Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. [166]-176. Publié aussi en version électronique.

Acrolein is an electrophilic α, β-unsaturated aldehyde. Additionally, acrolein is a metabolite of the antineoplastic alkylating agent cyclophosphamide and is implicated in off-target effects, including to bladder hemorrhagic cystitis and cyclophosphamide-induced cardiotoxicity, both of which have led to serious secondary iatrogenic injury during and following chemotherapy. At low concentrations acrolein inhibits cell proliferation without inducing apoptosis, while at high concentrations may result in secondary apoptosis promotion. This investigation assessed the role of the enzyme poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) in acrolein induced toxicity using the established toxicological H9c2 (2-1) cardiomyoblast in vitro model. H9c2 (2-1) cells were plated in 24-well plates at 75,000 cells per well three days prior to testing, followed by acrolein dosing at concentrations between 10 µM and 1000µM for either 30 or 55 minutes. PARP activity was quantitatively measured in total cell lysates using a biotin-avidin-conjugated horseradish peroxidase-TMB reporter system in a 96-well microplate formate. The lowest effective dose of toxicity at 30 minute dosing was found at 25 μM (PARP Activity 1.65-fold control) which returned to baseline at 100 μM; concentrations at or above 250 μM results in significant PARP activity reductions (≤ 0.46-fold control). Biomarkers were further characterized for cytotoxicity (AST presence), and viability (MTT reduction) in order to facilitate mechanistic characterization of PARP-mediated acrolein cardiotoxicity. Investigation of a PARP inhibitor was assessed to explore the intervention for acrolein induced cardiac tissue damage.

Drug-induced cardiotoxicity has resulted in a thorough evaluation of patient doses, treatments, and rehabilitation. One of the most commonly prescribed chemotherapeutic agents is cyclophosphamide. The active metabolite, acrolein, is one of the most potent inducers of cardiomyopathy. In this study, research was conducted on the H9c2 (2-1) cardiomyocyte cell line derived from the embryonic myocardium of rattus norvegicus to assess its competency for evaluation of the change in poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) activity. The application of this model to study the effects of acrolein on PARP activation was chosen as an ideal determinant of cell damage produced by nitrogen mustards. To verify the legitimacy of this model, cardiomyocytes were exposed to acrolein in varying concentrations and time durations with a subsequent protein concentration measurement determined through the BCA Protein Assay. After the normalization of samples through volume adjustments and verification of sufficient protein, other aliquots were subjected to a PARP Assay in order to measure PARP activity. PARP was activated at exposure concentrations of 75 μM in all trials, with an average detection of 0.00569 ± 0.001 mU/200ng protein. Other concentrations showed varying degrees of PARP activation, verifying the model’s competency. PARP activation implies the potential use of this model for further research into targeted molecular therapy of PARP inhibition. Therefore, this model has the ability to be used as an assessment tool for the combined use of PARP inhibitors and chemotherapeutic agents; it can be useful for future research investigating the use and efficacy of PARP inhibitors in reducing drug-induced cardiotoxicity.

L'exposition aux rayons ultraviolets (UV) est essentielle à la vie et bénéfique pour la santé humaine. Cependant, la surexposition aux UV solaires, en particulier aux UVB, rayons les plus énergétiques atteignant la surface terrestre, peut entrainer des cancers de la peau chez l'être-humain comme les cancers de la peau de type non-mélanome (NMSC). La capacité des UVB à initier des NMSC provient principalement de leurs habilités à causer des dommages directs à l'ADN, tels que les dimères cyclobutyliques de pyrimidine (CPD) et les produits pyrimidine-pyrimidone (6-4PP), qui sont pris en charge par le mécanisme de réparation par excision de nucléotide (NER). L'incidence croissante de NMSC chez les patients déficients pour l'une des protéines de la NER souligne l'importance d'un processus fonctionnel. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la NER permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour la prévention ou le traitement des cancers de la peau. L'une des premières réponses cellulaires aux dommages CPD/6-4PP induits par UVB dans la peau des mammifères est l'activation de l'enzyme nucléaire poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP1) qui catalyse la formation de polymères d'ADP-ribose. Les précédents travaux de notre laboratoire et d'autres équipes ont démontré que PARP1 et son activité enzymatique facilitent la NER en collaboration avec la protéine UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), qui va aussi s'accumuler rapidement aux sites CPD/6-4PP pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN de la NER. Cependant, plusieurs aspects des interactions de PARP1 avec DDB2 et avec les dommages directs à l'ADN sont inconnus. Ainsi, le premier objectif de mon projet de doctorat a été de caractériser précisément la nature de la liaison de PARP1 aux dommages CPD/6-4PP induits par UV vis-à-vis la protéine DDB2. Mes recherches ont mis en évidence l'empreinte asymétrique formée par PARP1 de -12 à +9 nucléotides de chaque côté des dommages CPD/6-4PP en présence ou en absence de DDB2. Nous avons également démontré que PARP1 augmente l'affinité de DDB2 pour les dommages CPD/6-4PP. De plus, les résultats de notre étude indiquent un rôle de PARP1 indépendant de DDB2 pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN. Cibler PARP1 et son rôle dans les voies de réparation des dommages à l'ADN est l'une des stratégies les plus efficaces développées ces dernières années pour le traitement des cancers des ovaires et du sein. L'application translationnelle de mon projet de doctorat a alors été de comprendre le rôle de PARP1 dans la NER dans le contexte des NMSC. À cet égard, nous avons développé un modèle PARP1-KO dans la lignée de souris SKH-1, qui est un modèle largement adopté pour étudier les NMSC induits par UVB. Puisque les souris SKH-1 développent principalement des carcinomes spinocellulaires (CSC) cutanés après une exposition chronique aux UVB, notre étude rapporte le rôle de PARP1 dans le développement des CSC. En utilisant les souris nouvellement créées SKH-1 PARP1-KO et les souris SKH-1 PARP1-WT avec ou sans application topique d'inhibiteurs de PARP, nous avons mis en évidence que l'absence de PARP1 ou de son activité dans la peau des souris SKH-1 mâles et femelles réduit significativement le fardeau tumoral des CSC et prolonge la période de latence du développement tumoral. L'étude hebdomadaire de l'apparition et de la croissance de tumeurs tout au long du protocole révèlent aussi que cibler PARP1 est très efficace pour ralentir, à l'étape pré-maligne, le développement de CSC. Nos résultats sont surprenants à la lumière des propriétés onco-suppressives rapportées de PARP1 et de son activité catalytique dans des cas de cancérogenèse induits par des dommages à l'ADN causés par des agents alkylants, ainsi que de la susceptibilité croissante des souris knock-out pour d'autres protéines de la NER à développer des CSC induits par UVB. Le rôle de PARP1 dans les mécanismes cellulaires induits par UVB autres que la NER, comme la mort cellulaire et les modulations immunes, pourrait expliquer nos observations. Alors que d'autres analyses sont nécessaires pour comprendre le rôle de PARP1 dans ces mécanismes, notre étude met en avant l'utilisation potentielle d'inhibiteurs de PARP comme nouvel agent chimiopréventif contre les CSC induits par UVB. / The exposure to solar ultraviolet radiation (UV) is essential to life and beneficial to human health. However, an overexposure to terrestrial solar UV, especially its most energetic component UVB, can cause skin cancers including the non-melanoma skin cancers (NMSC) in humans. The NMSC initiating properties of UVB arise predominantly from their ability to cause direct DNA damage such as cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and 6-4photoproducts (6-4PP), which are repaired via nucleotide excision repair (NER) pathway. The increased incidence of NMSC in patients with hereditary defects in NER pathway proteins underscores the importance of efficient NER in humans. Therefore, detailed understanding of the molecular operation of NER pathway can provide novel therapeutic targets for the prevention or treatment of skin cancers. One of the earliest responses of the mammalian skin cells to UVB-induced CPD or 6-4PP is the activation of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1), which catalyzes the formation of polymers of ADP-ribose (PAR). The previous work from other teams and our laboratory have shown that PARP1 and its enzymatic activity facilitate NER in collaboration with UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), which also rapidly accumulates at the CPD/6-4PP site during the DNA damage recognition stage of NER. However, many aspects of interaction of PARP1 with DDB2 and direct DNA damage are not understood. Therefore, the first aim of my doctoral project was to characterize the precise nature of binding of PARP1 vis-à-vis DDB2 at UV-induced CPD/6-4PP. My doctoral research demonstrates that PARP1 casts asymmetric footprint from −12 to +9 nucleotides on either side of the CPD/6-4PP in presence or absence of DDB2. We also demonstrated that PARP1 facilitates the binding of DDB2 to CPD/6-4PP. Moreover, our study reports DDB2-independent role of PARP1 during the DNA damage recognition phase in NER. Targeting the role of PARP1 in DNA strand break repair pathways has emerged as one of the successful strategies for the treatment of ovarian and breast cancers in last decade. Consequently, the ultimate translational goal of my doctoral project was to understand the implication of NER facilitating role of PARP1 in NMSC. In this regard, we first developed a PARP1-KO model in the albino hairless SKH-1 mouse strain, which is a widely adopted mouse model to study UVB-induced NMSC. Since SKH-1 mice mainly develop cutaneous squamous cell carcinoma (SCC) upon chronic UVB-exposure, our present study reports the role of PARP1 in development of SCC. Using the newly developed PARP1-KO and PARP1-WT SKH-1 mice with or without topical application of PARP inhibitor, we report that the absence of PARP1 or its activity in skin of both male and female SKH-1 mice significantly reduces the SCC tumor burden and prolongs the tumor latency period. The analyses of appearance and growth of individual tumors on a weekly basis during this protocol also revealed that targeting of PARP1 was most effective in suppressing the premalignant stage of the SCC development. Our results are surprising in light of the reported onco-suppressive property of PARP1 and its catalytic activity in alkylating DNA damage-induced tumorigenesis and the increased susceptibility of other NER protein knock-out mice to UVB-induced SCC. We reason that the roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes other than NER, such as cell death and immune modulations, can account for our observation. While further studies are required to understand these roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes, our study underscores the potential for use of PARP inhibitors as a novel chemopreventive agents against UVB-induced SCC.

Les tumeurs neuroendocrines (TNEs) sont des maladies rares dont l'incidence augmente depuis le début des années 2000. Lorsque la maladie est métastatique, ce qui arrive dans plus de 20% des cas au diagnostic, peu d'options curatives s'offrent aux patients. La thérapie radionucléidique (PRRT) au ¹⁷⁷Lu-DOTA,Tyr3-octréotate (¹⁷⁷Lu-octréotate) dépendante des récepteurs de la somatostatine a récemment été démontrée plus efficace que le traitement de première ligne actuel, soit les analogues de la somatostatine. Or, les cas de rémission avec la PRRT restent très rares et peu d'agents ont actuellement été utilisés pour en améliorer l'efficacité. Pour l'heure, les traitements pour améliorer la PRRT dans les études cliniques sont principalement tournés vers la combinaison avec des doses thérapeutiques de chimiothérapie. Dans les études précliniques, de nombreuses avenues sont à l'essai que ce soit en augmentant la perfusion des tumeurs, l'internalisation de ¹⁷⁷Lu-octréotate, la létalité des dommages induits par la radioactivité ou en ajoutant un fardeau supplémentaire de dommage à l'ADN. Les inhibiteurs de la poly(ADP-ribose) polymérase (iPARP) interfèrent avec la réparation de l'ADN, principalement la réparation par excision de base. La combinaison d'un iPARP avec la PRRT dans un modèle de sphéroïdes de TNEs humaines bronchopulmonaires (NCI-H727) et pancréatiques (BON-1) a démontré que la combinaison ralentissait davantage la croissance que l'iPARP seul ou la PRRT seule pour les deux lignées cellulaires. Le témozolomide (TMZ) et le 5-fluorouracile (5-FU), deux agents de chimiothérapie couramment utilisés pour traiter les TNEs, ont possiblement un rôle plus vaste que la toxicité à l'ADN. En effet, en exposant les cellules BON-1 au TMZ et au 5-FU à des doses toxiques, mais non létales, une augmentation des récepteurs à la somatostatine et de l'internalisation du ¹⁷⁷Lu-octréotate a été observée. Donc, les traitements combinatoires pour potentialiser la PRRT, notamment les iPARPs et la chimiothérapie, pourraient permettre un meilleur traitement des TNEs. / Neuroendocrine tumors (NETs) are rare diseases, the incidence of which has been increasing over the past 20 years. When the disease is metastatic, which happens in more than 20% of cases at diagnosis, few curative options are available for patients. Peptide receptor radionuclide therapy (PRRT) via somatostatin receptors (SSTR) and ¹⁷⁷Lu-DOTA,Tyr3-octreotate (¹⁷⁷Lu-octreotate) has recently been shown to be more effective than the current first-line therapy, namely somatostatin analogues. However, cases of remission with PRRT remain very rare and few agents have currently been used to improve its effectiveness. At present, treatments to improve PRRT in clinical studies have mainly focused on combination with therapeutic doses of chemotherapy. In preclinical studies, many avenues are being tested whether by increasing tumor perfusion, internalization of ¹⁷⁷Luoctreotate, lethality of radioactivity-induced damage or by adding an additional burden of DNA damage to the tumor. Poly (ADP-ribose) polymerase inhibitors (PARPi) interfere with DNA repair, mainly altering base excision repair pathways. Combining PARPi with PRRT in a spheroid model of bronchopulmonary NETs (NCI-H727) and pancreatic NETs (BON-1) demonstrated that the combination slows growth more than PARPi alone or PRRT alone for both cell lines. Temozolomide (TMZ) and 5-fluorouracil (5-FU), two chemotherapeutic agents commonly used to treat NETs, may have a broader role than conventional cytotoxicity via DNA damage in NET therapy. Indeed, by exposing BON-1 cells to TMZ and 5-FU to toxic, but not lethal doses, an increase in somatostatin receptors and internalization of ¹⁷⁷Lu-octreotate was observed. Acting on various mechanisms to potentiate PRRT is possible with PARPis or chemotherapy. Having multiples targes for potentiation could be key for a better treatment of NETs.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2017-2018 / La poly(ADP-ribose) polymérase 1 (PARP1) est une enzyme nucléaire très abondante chez les eucaryotes supérieurs, humains compris, mais néanmoins absente chez les bactéries et les levures. En réponse aux dommages à l’ADN, elle utilise le substrat nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) pour former des polymères d’ADP-ribose (PAR) sur elle-même et sur d’autres protéines cibles. L’enzyme PARP1 et son activité catalytique sont impliquées dans la réparation des dommages à l’ADN contenant des cassures simple et double brin. Cependant, l’hypothèse que l’enzyme PARP1 joue un rôle dans la réparation de dommages sans cassures de brin a toujours rencontré des réticences. Par exemple, la PARP1 est activée rapidement par ces dommages, comme ceux induits par les radiations ultraviolettes (UV), mais son rôle dans leur réparation par excision de nucléotides (NER) n’était pas accepté généralement. Ainsi, ce projet de doctorat consiste à déterminer le mécanisme exact par lequel la PARP1 et son activité catalytique contribuent à la NER. Cette voie de réparation utilise plus de 30 protéines pour réparer une très grande variété de dommages. Bien que nous ayons une bonne connaissance des étapes de la NER grâce aux études in vitro chez les bactéries et les levures, les facteurs qui influencent le fonctionnement de la NER chez les eucaryotes supérieurs ne sont pas tous connus. Cependant, de récentes études ont montré que des complexes de remodelage de la chromatine et des modifications post-traductionnelles facilitent la NER dans la chromatine. Dans ce contexte, l’implication de la modification posttraductionnelle effectuée par la PARP1, dite PARylation, est encore inconnue dans la NER. Dans la NER, l’étape cruciale de la réparation globale du génome est la reconnaissance des quelques bases endommagées qui sont entourées de nombreuses bases non modifiées par la protéine «Xeroderma pigmentosum C» (XPC). Un autre facteur clé de cette phase est le facteur «UV-damaged DNA binding protein 2» (DDB2) qui fait partie du complexe ubiquitine-ligase UV-DDB. Ici, nous avons démontré que, après irradiation aux UVC, la PARP1 se lie asymétriquement à la photolésion et elle interagit avec le facteur DDB2. Ce dernier stimule l’activité catalytique de la PARP1 et est à son tour PARylé par la PARP1. Les polymères formés autour de la photolésion agissent comme signal de recrutement pour le complexe PARP1-XPC déjà présent dans le nucléoplasme. La confluence de ces facteurs de réparation au site de dommage assure la séparation de la protéine XPC de ce complexe suivi de son transfert et de sa stabilisation autour du dommage. Ainsi, la PARP1 n'est pas seulement l'une des premières protéines recrutées aux lésions induites par les UV, mais son activation rapide par ces dommages joue un rôle clé dans les étapes situées en aval de la phase de reconnaissance des dommages de la NER. En effet, nous avons montré que l’inhibition ou la déplétion de la PARP1 ralentit radicalement la réparation par la NER des dommages directs induits à l’ADN par les UV. Cette étude montre que la PARP1, en coopération avec les protéines DDB2 et XPC augmente l’efficacité de la voie NER dans les cellules des mammifères. / Poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) is a highly abundant nuclear enzyme which is present in higher eukaryotes but absent in bacteria and yeasts. In response to DNA damage, it uses the nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to form polymers of ADPribose (PAR) on itself and other target proteins. PARP1 and its catalytic activity are involved in the repair of DNA damages comprising of single and double strand breaks. However, the role of PARP1 in repairing DNA damage without strand breaks has not been readily accepted. For example, although PARP1 is rapidly activated in response to such damages caused by ultraviolet radiation (UV), its role in their repair by nucleotide excision repair pathway (NER) was not generally recognized. Thus, the project of my doctoral work is to determine the exact mechanism by which PARP1 and its catalytic activity influence NER. This pathway uses more than 30 proteins to repair a wide variety of DNA damages. Although we have a good understanding of NER steps through studies in vitro, bacteria and yeasts, we still do not know all the factors that influence the functioning of the NER in higher eukaryotes including humans. Recent studies have shown that chromatin remodelling complexes and post-translational modifications facilitate NER in the context of chromatin. However, the contribution of PARylation, the post-translational modification carried out by PARP1, in NER remains largely unknown. Xeroderma pigmentosum C protein (XPC) plays a crucial role in NER by recognizing the few UV induced lesions in the vast undamaged chromatin. Another key factor in damage recognition is the UV- damaged DNA binding protein (DDB2), which is part of the UV-DDB ubiquitin-ligase complex. Here, we have demonstrated that after UVC irradiation, PARP1 binds asymmetrically to the photolesions and interacts with DDB2. DDB2 stimulates the catalytic activity of PARP1 and in turn it is PARylated. The polymers formed around the photolesion act as recruitment signal for the PARP1-XPC complex already present in the nucleoplasm. The confluence of these repair factors at the damage site ensures the separation of the XPC protein from its complex with PARP1 followed by its transfer and stabilization at the site of damage. Thus, PARP1 is not only one of the first proteins to respond to UV induced DNA damage, but also its early rapid activation plays a key role in the downstream events of NER. Indeed, we have shown that both inhibition and depletion of PARP1 significantly delays the repair of these lesions. This study demonstrates that PARP1 increases the efficiency of NER in cooperation with the DDB2 and XPC proteins in mammalian cells.

Les dommages génotoxiques sont très dangereux pour nos cellules. L'incapacité de détecter et de réparer adéquatement ces dommages avant que l'ADN ne soit répliqué peut mener à l'apparition de cellules cancéreuses. Chez le nématode Caenorhabditis elegans un orthologue de la tankyrase, la poly(ADP-ribose) metabolism enzyme-5 (pme-5), a été identifié et sous-cloné. Il est bien établi que C. elegans est un outil formidable pour la biologie moléculaire et la génétique. Afin de faire progresser plus rapidement les connaissances sur les tankyrases et le métabolisme du poly(ADP-ribose), le nématode est l'outil tout indiqué. L'objectif général de mon étude est de vérifier si C. elegans est un modèle approprié pour l'étude du rôle des tankyrases. Afin d'y arriver, mon premier objectif était de cloner pme-5 dans différents vecteurs afin de caractériser des anticorps monoclonaux et polyclonaux. Nous voulions vérifier la spécificité des anticorps avec la protéine recombinante et native. Ensuite, afin d'observer la localisation intracellulaire de PME-5, il nous a fallu trouver un vecteur convenable afin d'exprimer PME-5::GFP et ensuite de microinjecter la construction dans le nématode afin d'obtenir une lignée portant la construction extra-chromosomale. Nous avons ensuite utilisé les anticorps nouvellement caractérisés afin d'hybrider des extraits de vers par western Mot et de faire des immunohistochimies. Puis, nous avons effectué un microarray afin d'observer la réponse transcriptionelle générale suivant une irradiation gamma de 120 Gy. L'étude par immunohistochimie a permis d'observer la localisation de PME-5 lors de chaque stade du développement de même que dans chaque tissu et cellules et de confirmer que l'allèle ok446 est bien nulle. Ces études ont démontré que : (1) PME-5 est une protéine ubiquitaire et nucléaire chez le nématode, (2) qu'elle semble interagir avec la chromatine et les chromosomes condensés (bivalents) soit par l'intermédiaire de protéines associées à l'ADN ou par un domaine spécifique de liaison à l'ADN, ceci reste à déterminer, (3) sa transcription et sa traduction sont augmentées à la suite d'une exposition à des rayons gamma (120 Gy) et (4) elle fait partie des cinq gènes dont la transcription est la plus augmentée suivant une exposition à des rayons gamma (120 Gy). Compte tenu de ces résultats, nous concluons que C. elegans semble un modèle approprié pour l'étude des fonctions nucléaires des tankyrases.

En 2017, Statistique Canada a rapporté qu'un Canadien sur quatre mourra d’un cancer. Chaque jour, nous sommes confrontés à des facteurs environnementaux qui imposent à notre ADN un stress génotoxique. Ce stress peut avoir de graves conséquences au point de menacer notre intégrité génomique, comme les cassures d'ADN double-brin (DSBs). Heureusement, nos cellules ont deux voies principales pour combattre ce type de lésions : la recombinaison homologue (HR) et la Classical Non-Homologous End-Joining (CNHEJ). La voie HR, un type de réparation sans erreur utilisé dans la phase-S du cycle cellulaire, assure une réparation fidèle de la zone endommagée et conserve l'intégrité de l'information génétique. Les individus porteurs de mutations dans les protéines de cette voie, telles que BRCA1 et BCRA2, sont plus susceptibles de développer des cancers du sein et de l'ovaire. Récemment, la clinique a connu une percée majeure dans le traitement du cancer de l'ovaire. Une nouvelle classe de médicaments a été autorisée par la US Food and Drug Administration (FDA) pour traiter les cancers de l'ovaire récurrents qui présentent une HR défective. Ces médicaments inhibent un des acteurs les plus précoces dans la réponse aux dommages à l'ADN (DDR): la PARP-1 (Poly(ADP-ribose) polymerase-1). Lors de l'induction de dommages à l'ADN, la PARP-1 devient fortement activée, conduisant à la production massive de polymères de poly(ADP-ribose) (PAR) générés à partir de l'hydrolyse du nicotinamide adénine dinucléotide. Ce polymère agira comme une plateforme pour recruter des facteurs de réparation de l'ADN au site de réparation. L'application clinique réussie des inhibiteurs de la PARP (PARPi) vient des observations où les mutations ou l'extinction de BRCA1/2 entraînent une diminution de l'activité HR. L'inhibition de la PARP-1 combinée à cette déficience en HR favorise la mort cellulaire, un phénomène appelé létalité synthétique. Trois PARPi sont actuellement autorisés par la FDA et sont utilisés pour le traitement du cancer gynécologique. Malgré l'efficacité thérapeutique de ces inhibiteurs, les mécanismes induisant une régression tumorale ne sont pas complètement compris. Ainsi, il devient extrêmement important de déchiffrer davantage ces mécanismes pour atteindre le plein potentiel des PARPi. Pour ce faire, une recherche fondamentale sur les fonctions des PARPs, et de leurs partenaires dans la DDR, est essentielle et constitue l'objectif général de cette thèse. Durant mon doctorat, nous avons étudié l'influence de la PARP-1 dans la voie HR au moment de l'étape initiale de la résection, qui est essentielle pour l'élimination de l'ADN endommagé. Certaines études ont montré l'implication de la PARP-1 dans le recrutement de la protéine de résection MRE11. Ici, nous démontrons que la PARP-1 a une nouvelle fonction dans la résection des DSBs et nous proposons un nouveau modèle pour expliquer la létalité synthétique observée dans les tumeurs avec une HR défective. Pour compléter l'objectif de ce doctorat, nous avons étudié les rôles régulateurs de la PARP-1 au cours du processus HR, mais plus tard dans la résolution des lésions, c'est-à-dire au maximum de la formation des foyers RAD51, une étape cruciale pour la réparation efficace des DSBs via la HR. Nous avons observé que le PAR-interactome (PARylome) est, à ce moment, fortement enrichi en protéines impliquées dans le métabolisme de l'ARN. Plusieurs des protéines les plus abondantes étaient constituées d’hélicases d’ADN et d’ARN, et de facteurs de transcription. Puisque certains de ces gènes sont mutés dans les tumeurs, ils pourraient théoriquement être des cibles prioritaires pour une utilisation conjointe avec des PARPi. Nous avons également étendu notre étude de la PARylation à la chromatine, au niveau des histones. Nous avons constaté que les queues d'histones ne sont pas les seules cibles de la PARP-1 et que les domaines globulaires centraux sont également PARylés. Finalement, le grand intérêt clinique de la PARP-1 méritait une analyse approfondie de son expression systémique. Ainsi, j'ai terminé mes études en décrivant la distribution et l'abondance tissulaire de la PARP-1 dans les organes simiens, avec l'objectif principal de fournir des informations précieuses quant à l'efficacité potentielle des PARPi ou sa résistance, dans un tissu donné et maladies apparentées. En résumé, cette thèse fournit de nouvelles informations importantes sur les mécanismes orchestrés par la PARP-1 lors de la réponse aux DSBs, y compris les réseaux protéiques complexes engagés dans le remodelage des fonctions cellulaires nécessaire au maintien de l'intégrité génomique. / In 2017, Statistics Canada reported that one out of four Canadians will die of cancer. Every day, we face environmental factors that burden our DNA with genotoxic stress. This stress can lead to severe types of DNA damage that can threaten our genomic integrity, namely double-strand breaks (DSBs). Fortunately, our cells have evolved with different repair mechanisms to deal with such lesions. There are two primary types of repair against DSBs: Homologous Recombination (HR) and Classical Non-Homologous End-Joining (CNHEJ). The HR pathway is an error-free repair mechanism used in the S-phase of the cell cycle to ensure faithful repair of the damaged area and thus preserve our genetic information. Individuals that bear mutations in proteins involved in this pathway, such as BRCA1 and BCRA2, have been associated with the development of breast and ovarian cancers. Almost 4 years ago, the field went through a major breakthrough in ovarian cancer care. A new class of drugs was accepted by the US Food and Drug Administration (FDA) to manage recurrent ovarian cancers that display HR-deficiencies. These drugs consist of inhibitor molecules against one of the earliest sensors of DNA damage in the cell: PARP-1 (poly(ADP-ribose) polymerase-1). Upon DNA damage induction, PARP-1 becomes highly activated, leading to the massive production of poly(ADP-ribose) (PAR) polymers, from the hydrolysis of nicotinamide adenine dinucleotide, which in turn modify several proteins posttranslationally and act as a scaffold to recruit DNA repair factors to the repair site. The successful application of PARP inhibitors (PARPi) arose from the observations that mutations or silencing of BRCA1/2, resulted in diminished HR activity. In the context of HR deficiency, the concomitant inhibition of PARP resulted in cell-death, an effect called synthetic lethality. Three PARPi are currently accepted by the FDA and are being clinically used for the treatment of gynaecological cancers. Notwithstanding the great promise of these inhibitors for other types of cancers, the mechanism by which these are inducing cancer lethality is not fully understood. Thus, it becomes of extreme importance to further decipher its mechanistic ways, to achieve full potential of PARPi in the clinic. To achieve this, fundamental research on the functions of PARPs and their protein partners in the DNA damage response is indispensable and constitutes the general aim of this thesis. During my doctoral work, we investigated the influence of PARP-1 during the HR pathway, primarily during the initial step of resection, which is essential for the removal of damaged DNA. Early reports of PARP-1 involvement in resection described the recruitment of the resection protein MRE11 to sites of damage in a PARP-1 dependent manner. Here, we demonstrate that PARP-1 has a novel function in DSB resection and we propose a new model for the synthetic lethality observed in HR-deficient tumors. To further complement the general aim of this doctorate, we investigated the regulatory roles of PARP-1 during the HR pathway, however in a later stage of HR resolution, at the peak formation of RAD51 foci, which is a crucial step for the efficient repair of DSBs through HR. We observed that the PAR-interactome (PARylome) at this stage was abundantly enriched with RNA-processing factors. Several of the most abundant proteins consisted of DNA and RNA helicases, as well as transcription factors, some of which were found to be mutated in tumors, and thus can be seen as potentially druggable targets to be used in combination with PARPi. We also extended our PARylome study to the chromatin proteome and investigated the histone PARylome upon DNA damage. Interestingly, we found that histone tails are not the only targets of PARP-1 and that globular domains are also targets of PARylation. Lastly, the high clinical interest of PARP-1 warrants studies addressing PARP-1 organ distribution. Thus, I finalized my studies by extensively describing and reporting PARP-1 tissular and cellular distribution and abundance in monkey organs, with the main objective of providing valuable information to any study assessing PARP inhibition efficacy and resistance in any given tissue and related diseases. In summary, this thesis provides important new information on the mechanisms PARP-1 is regulating during the response to DSBs, including the networks PARP-1 is orchestrating to potentially help reshape the cell environment, to efficiently repair the most lethal lesion our genome faces.

Le cancer carcinoïde est une maladie rare caractérisée par des tumeurs neuroendocrines résistantes aux agents chimiothérapeutiques occasionnant un traitement difficile de celles-ci. Notre laboratoire travaille sur l'enzyme poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) impliquée dans différentes voies de réparation de l'ADN. La grande efficacité de ces voies est une des raisons pouvant expliquer la résistance observée des tumeurs neuroendocrines. Le but de ce projet était de déterminer le rôle de la PARP-1 dans le traitement du cancer carcinoïde par chimiothérapie. Nous avons obtenu un effet de potentialisation de la streptozotocine caractérisé par un ralentissement de la croissance cellulaire et de la réparation des dommages lors de l'inhibition de la PARP-1. D'un autre côté, nous avons constaté que le «knock down» de la PARP-1 résulte en une diminution du volume tumoral in vivo. Nos résultats montrent donc que la PARP-1 peut devenir une cible thérapeutique dans le traitement du cancer carcinoïde.

La poly(ADP-ribose) polymérase (PARP) est une enzyme nucléaire capable de catalyser la formation de polymères d'ADP-ribose sur plusieurs protéines acceptrices en utilisant le NAD comme substrat. Cette modification post-traductionnelle est notamment impliquée dans la régulation de la réparation, de la transcription et de la réplication de l'ADN. L'enzyme responsable de l'hydrolyse du polymère d'ADP-ribose se nomme la poly(ADPribose) glycohydrolase (PARG) et son action est essentielle afin de permettre aux protéines modifiées de regagner leurs fonctions. Toutefois, la régulation de la dégradation du polymère et les rôles précis de la PARG ne sont pas très bien connus. Ce projet de recherche décrit pour la première fois une caractérisation détaillée des deux gènes qui codent pour des PARG chez C. elegans, soient pme-3 et pme-4. Via un essai PARG, nous avons d'abord prouvé que le ver était capable d'hydrolyser le polymère et que les enzymes responsables de cette dégradation étaient PME-3 et PME-4. Une expérience de RT-PCR a démontré que ces gènes sont exprimés dans tous les stades de développement du ver, un résultat qui fut confirmé par l'utilisation de plasmides recombinants de fusion GFP. De plus, ces plasmides recombinants ont également été utilisés pour montrer que PME-3 semble être exprimée principalement dans les cellules neuronales ainsi que dans l'intestin et qu'elle se retrouve en grande majorité au noyau. PME-4 est également exprimée dans les cellules neuronales mais sa localisation sous-cellulaire semble exclusivement cytoplasmique. L'inactivation de pme-3 et pme-4 via l'interférence à l'ARN indique que ces enzymes sont importantes dans la réponse aux dommages à l'ADN. En effet, les vers dont l'expression de ces gènes est réduite montrent un taux de survie significativement plus faible que les vers contrôles suite à une induction de dommages à l'ADN. Via des expériences de double hybride de levure, nous avons effectué un criblage afin de trouver des partenaires protéiques de PME-3 et PME-4. Nous avons identifié un partenaire à PME3, soit la protéine de fonction inconnue MATH-41, mais aucun partenaire pour PME-4. Le patron d'expression de MATH-41 semble indiquer que cette protéine est principalement exprimée dans l'intestin du ver. Ces résultats montrent que les PARG semblent avoir un rôle dans la réponse aux dommages à l'ADN et dans la survie. De plus, ils constituent d'importants avancements dans l'étude des rôles que pourraient jouer les PARG dans plusieurs événements métaboliques.