Submitted by Leonardo Cavalcante (leo.ocavalcante@gmail.com) on 2018-07-17T18:53:07Z No. of bitstreams: 1 Arquivototal.pdf: 3232624 bytes, checksum: 559aa25bbe9205467b3fdd737354219e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-17T18:53:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arquivototal.pdf: 3232624 bytes, checksum: 559aa25bbe9205467b3fdd737354219e (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / The high incidence of pain in the general population has encouraged research about this theme. Products derived from plant species have been widely used in the pharmacological treatment of pain relief. Recent studies have reported the important role of monoterpenes, active compounds found in the essential oils of aromatic plants, having relevant analgesic and anti-inflammatory potential. The geraniol (GER) is a monoterpenic alcohol, found in >160 essential oil of plant species, especially Cymbopogon gender. In the literature consulted, several biochemical and pharmacological properties are shown of GER: antitumor, antimicrobial, antiinflammatory, antioxidant, gastric and intestinal protector, neuroprotective and antiarrhythmic. In this study was evaluated the antinociceptive activity of GER, not yet reported, by animal behavioral and electrophysiological in vitro models. Male and female adult Swiss mice were used. Initially the acute toxicity of GER was investigated by calculating the lethal dose 50 (LD50) by intraperitoneal (i.p.) (= 199.9 mg/kg) and oral (p.o.) (> 1 g/kg). In psychopharmacological screening, after the administration of single doses of GER (i.p. and p.o.), behavioral changes were observed indicating a depressant profile on the central nervous system (CNS) and/or peripheral nervous system (SNP), and relevant antinociceptive effect of geraniol. Therefore, more specific antinociceptive property evaluation tests were performed. The GER (12.5, 25 or 50 mg/kg i.p. and 50 or 200 mg/kg p.o.) decreased (p<0.001) the number of abdominal contractions induced by i.p. injection of acetic acid, when compared with the control. The opioid antagonist naloxone (5 mg/kg) administered subcutaneously (s.c.) in mice, subsequently treated with GER (25 mg/kg i.p.), did not reverse its antinociceptive activity. The GER (12.5, 25 and 50 mg/kg i.p.) reduced (p<0.001) paw licking time in the second phase (15-30 min, inflammatory phase) of the formalin test. Also, in the glutamate test was reduced (p<0.01) paw licking time when GER 50 mg/kg i.p. administered. In a subsequent step, it was investigated the effect of GER on the excitability of peripheral nerve fibers through extracellular recording in the sciatic nerve in mice. The GER presented depressant effect of the compound action potential (CAP), which was reversed after washing and recovery period. The GER blocked components of the CAP concentration-dependent manner and exposure time to the drug: 1 mM after 120 min for the first component (Aγ and Aβ fibers) and 0.6 mM after 90 min for the second (Aγ and Aδ fibers). The concentration, which induces 50% inhibition of the peak-to-peak amplitude of the PAC (IC50) for the GER was calculated, being equal to 0.48±0.04 mM. The conduction velocity was also reduced by exposure to GER from the 0.3 mM concentration, for the 1st component [46.18±2.60 m/s to 36.04±1.60 m/s; p<0.05 (n=7)] and the 2nd component [18.37±1.31 m/s to 12.71±0.56 m/s; p<0.001 (n=7)]. In conclusion, the results obtained show that GER has antinociceptive activity, mainly in pain related to inflammation. Participation of the opioid pathway in its mechanism of action is unlikely, but the modulation of glutamatergic neurotransmission in a dose-dependent manner is a possible mechanism. Its antinociceptive activity is also related to the reduction in peripheral neuronal excitability, firstly in thinner fibers Aδ, which are directly connected to the conduction pain. / A elevada incidência da dor na população em geral tem incentivado as pesquisas entorno desse tema. Produtos oriundos de espécies vegetais têm sido amplamente utilizados no tratamento farmacológico de alívio da dor. Estudos recentes têm relatado o importante papel dos monoterpenos, princípios ativos encontrados nos óleos essenciais de plantas aromáticas, tendo relevante potencial analgésico e anti-inflamatório. O geraniol (GER) é um álcool monoterpênico, encontrado no óleo essencial de >160 espécies vegetais, especialmente do gênero Cymbopogon. Na literatura consultada, pesquisas apontam várias propriedades bioquímicas e farmacológicas para o GER: antitumoral, antimicrobiana, anti-inflamatória, antioxidante, de proteção gástrica e intestinal, neuroprotetora e antiarrítmica. Neste estudo foi avaliada a atividade antinociceptiva do GER, ainda não relatada, mediante modelos animais comportamentais e eletrofisiológicos in vitro. Foram utilizados camundongos machos e fêmeas Swiss adultos. Inicialmente, foi investigada a toxicidade aguda do GER mediante cálculo da dose letal 50 (DL50) pela via intraperitoneal (i.p.) (=199,9 mg/kg) e oral (v.o.) (>1 g/kg). Na triagem psicofarmacológica, após a subministração de doses únicas de GER (i.p. e v.o.) foram observadas alterações comportamentais que indicaram perfil depressor do sistema nervoso central (SNC) e/ou periférico (SNP), e relevante efeito antinociceptivo do geraniol. Portanto, foram realizados testes comportamentais de avaliação de propriedade antinociceptiva mais específicos. O GER (12,5; 25 e 50 mg/kg i.p. e 50 ou 200 mg/kg v.o.) reduziu (p<0,001) o número de contorções abdominais induzidas por injeção i.p. de ácido acético, quando comparado com o controle. O antagonista opióide naloxona (5 mg/kg) administrado pela via subcutânea (s.c.) em camundongos, subsequentemente tratados com GER (25 mg/kg i.p.), não reverteu sua atividade antinociceptiva. O GER (12,5; 25 e 50 mg/kg i.p.) reduziu (p<0,001) o tempo de lambida da pata na segunda fase (15-30 min, fase inflamatória) do teste da formalina. Também, no teste do glutamato houve redução (p<0,01) do tempo de lambida da pata quando administrado GER 50 mg/kg i.p. Em uma etapa subsequente, investigou-se o efeito do GER sobre a excitabilidade de fibras nervosas periféricas, mediante registro extracelular em nervo ciático de camundongo. O GER apresentou efeito depressor do potencial de ação composto (PAC), o qual foi parcialmente revertido após lavagem durante o período de recuperação. O GER bloqueou as componentes do PAC, de maneira dependente da concentração e do tempo de exposição à droga: 1 mM aos 120 min para a primeira componente (fibras Aγ e Aβ) e 0,6 mM aos 90 min para a segunda (fibras Aγ e Aδ). Foi calculada para o GER, a concentração que induz 50% de inibição da amplitude pico-a-pico do PAC (CI50), sendo igual a 0,48±0,04 mM. A velocidade de condução também, foi reduzida pela exposição ao GER, a partir da concentração de 0,3 mM para a 1ª componente [46,18±2,60 m/s para 36,04±1,60 m/s; p<0,05 (n=7)] e para a 2ª componente [18,37±1,31 m/s para 12,71±0,56 m/s; p<0,001 (n=7)]. Em conclusão, os resultados obtidos mostram que o GER tem atividade antinociceptiva, principalmente na dor relacionada à inflamação. A participação da via opióide no seu mecanismo de ação é pouco provável, mas a modulação da neurotransmissão glutamatérgica de maneira dependente da dose é um mecanismo possível. Sua atividade antinociceptiva tambèm, está relacionada à redução da excitabilidade neuronal periférica, primeiramente de fibras mais finas como Aδ, ligadas diretamente à condução da dor.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 parte1.pdf: 4104748 bytes, checksum: 578975146349baff07079d6c3f9756b6 (MD5) Previous issue date: 2008-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Snake venoms contain a complex arsenal of protein bio-active components, many of these being neurotoxins (NTXs). These snakes have high neurotoxic activity venom, corresponding to the Elapidae family, which includes coral snakes (Micrurus) whose venom contains circa 90-95% of low molecular mass protein components. Among these, several are postsynaptic neurotoxins or α- NTXs (MM = 6-9 kDa). The Micrurus ibiboboca (Merren, 1820) is a snake of the Elapidae family witch is quite common in the Northeast of Brazil. In spite of the great diversity of species of Micrurus, scarce works involving the nervous system with isolated and pure toxins of those serpents has been developed in level biochemical, pharmacological and electrophysiological. The aim of this study was to purify the toxin Mic6c7NTX of the Micrurus ibiboboca venom, characterize to biochemically and electrophysiologically the toxin Mic6c7NTX in the peripheral nervous system (PNS) of rats, evaluating alterations in the record of the Compound Action Potential (CAP) of the isolate nerve and the toxin activity on the voltage-dependent sodium channels (Nav) in the neurons of the dorsal root ganglion (DRG). The venom was extracted from the Micrurus ibiboboca collected in Paraiba State (Brazil). Initially, electrophysiological tests (current clamp method) using the single sucrose gap technique were accomplished with crude venom (100μg/mL). It was observed that in this concentration the crude venom caused reduction in the CAP amplitude (25%). This neurotoxity led into an intriguing question: what components of the venom would promote to reduction in the excitability of the nerve? Based upon this question, I decided to purify the venom throughout the Liquid Chromatography of the High Performance (HPLC) of the Cation Exchange Chromatography (CIEX) and the Reverse Phase Chromatography (RPC). The molecular mass (MM) of the raw toxin was determined by mass-spectrometry (MALDI-QTOF/ MS) and N-terminal sequence by means of Edman s Degradation. The search for similarity with other toxins was accomplished against proteomic data bank. The CIEX profile showed 19 fractions and the highest peak fraction was used for the second dimension. The toxin Mic6c7NTX obtained by RPC showed elution in 26.7%of the acetonitrile (ACN) and MM 7.047.56Da. The obtained partial N-terminal sequence showed 31 aminoacid residues. The search for similarity of structure and function showed great similarity (65%) with other short chain α-NTXs Australian elapids snakes. The electrophysiological studies (single sucrose gap technique) showed that the toxin Mic6c7NTX (1 μM) reduced the excitability of the isolate nerve similarly to the reduction observed in the crude venom about 21%. Other CAP parameters such as despolarization speed (DSCAP), repolarization time (τCAP) and peak of time (PTCAP) did not show alterations. This suggests that the toxin may be affecting the Nav channels. For the confirmation of that hypothesis experiments were accomplished with whole cell patch-clamp technique in DRG neurons. This results showed that the toxin Mic6c7NTX (1 WM) abolished completely the current of Nav channels sensitive the tetrodotoxin (TTX-S). Also the Nav channels TTX resistant (TTX-R) were investigated in the presence of the Mic6c7NTX toxin previously using TTX (100 nM). This results showed that the toxin Mic6c7NTX (100 nM) abolished completely the current of Nav channels TTX-R and IC50 = 30nM. However, reversion of this blocking was not observed. The present study biochemically and electrophysiologically characterized an α-NTX of the Micrurus ibiboboca elapid snake. Furthermore, it showed a potent toxin with affinity Nav channels TTX-S and TTX-R of the PNS. This is the first α-NTX isolated and identified of the venom from the Micrurus ibiboboca (Merrem, 1820) snake. / As serpentes da família Elapidae possuem uma peçonha com alta atividade neurotóxica e capacidade de letalidade. Fazem parte dessa família as serpentes corais americanas (gênero Micrurus) com suas peçonhas contendo cerca de 90-95% de componentes protéicos, sendo na sua maior parte neurotoxinas com baixa massa molecular (6-8 kDa), podendo ser destacadas as neurotoxinas com ação pós-sinápticas ou α-Neurotoxinas (α-NTX). A Micrurus ibiboboca (Merrem, 1820) é uma serpente da família Elapidae, comum na região Nordeste. Apesar da grande diversidade de espécies do gênero Micrurus sp., escassos trabalhos envolvendo atividade de toxinas isoladas e puras destas peçonhas e sistema nervoso têm sido desenvolvidos em nível bioquímico, farmacológico ou eletrofisiológico. O objetivo desse estudo foi purificar a toxina Mic6c7NTX da peçonha de M. ibiboboca, caracterizar bioquímicamente e investigar com ferramentas eletrofisiológicas a ação da toxina no Sistema Nervoso Periférico (SNP) de ratos avaliando alterações no Potencial de Ação Composto (PAC) do nervo isquiático isolado e a atividade da toxina nos canais para sódio dependentes de voltagem (Nav) em neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG). A peçonha da M. ibiboboca foi extraída de serpentes coletadas no Estado da Paraíba (Brasil). Inicialmente, ensaios eletrofisiológicos com o método de current clamp utilizando a técnica de single sucrose gap foram realizados com a peçonha bruta (100 Wg/mL). Os resultados mostraram que a peçonha bruta nessa concentração promoveu redução na amplitude do PAC (25%). Esse efeito da toxina na excitabilidade do nervo levantou o questionamento: Que componentes da peçonha estariam causando essa diminuição da excitabilidade? A peçonha foi purificada por meio de Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC), de troca catiônica (CIEX) e fase reversa (RPC). Na sequência, os picos da CIEX foram submetidos à RPC e posteriormente analisados por espectrometria de massas (MALDI-TOF/MS) que detectou a massa molecular da toxina Mic6c7NTX de 7.047,56 Da. Em seguida, foi determinado o seu N-terminal por Degradação de Edman que apresentou 31 resíduos de aminoácidos e serviu de estudo para a bioinformática na busca por similaridade em banco de dados proteômicos com outras toxinas protéicas, demonstrando que a toxina Mic6c7NTX apresentou similaridade (65%) com α-NTXs de cadeia curta de serpentes elapídicas australianas. Posteriormente, foi investigado o efeito da toxina isolada no SNP. Os estudos eletrofisiológicos em single sucrose gap demonstraram que a toxina Mic6c7NTX (1 WM) reduziu a excitabilidade do nervo isolado de forma similar à observada pela peçonha bruta. Não foram observadas alterações significantes em outros parâmetros do PAC, como velocidade de despolarização (VDPAC), tempo de repolarização (τPAC) e tempo de pico (PTPAC), sugerindo que a toxina atuasse num sítio de ligação específico dos [Escreva uma citação do documento ou o 11 canais Nav no SNP. Para a confirmação dessa hipótese foram realizados experimentos de voltage clamp com a técnica de whole cell patch-clamp em cultura primária de neurônios DRG da medula espinhal de ratos. Os resultados mostraram que a toxina Mic6c7NTX (1 WM) aboliu completamente as correntes dos canais Nav sensíveis à tetrodotoxina (TTX-S). Também foi investigado o efeito da toxina sobre a população de canais Nav resistentes à TTX (TTX-R), utilizando previamente TTX (100 nM) para bloquear os canais Nav TTX-S. Os registros com a toxina Mic6c7NTX (100 nM) demonstraram um bloqueio total da corrente nos canais Nav TTX-R dos DRGs e uma IC50 da toxina em torno de 30 nM. Também foi observado que essa toxina se liga aos canais Nav de forma lenta e irreversível. O presente estudo caracterizou bioquímica e eletrofisiologicamente uma α-NTX da serpente elapídica Micrurus ibiboboca. Farmacologicamente, trata-se de uma potente toxina com afinidade aos canais Nav TTX-S e TTX-R do SNP. Essa é a primeira α-NTX isolada e caracterizada da peçonha da serpente Micrurus ibiboboca (Merrem, 1820).