Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Proteoglicanos são macromoléculas complexas compostas de polissacarídeos lineares, os glicosaminoglicanos (GAGs), ligados covalentemente a um core protéico. Os GAGs contêm grupamentos sulfato em várias posições, formando domínios específicos, que permitem a interação com moléculas da matriz extracelular, incluindo os fatores de crescimento. Neste estudo, utilizamos o sistema de co-cultura em Transwell para analisar a interação entre fibroblastos e células de adenocarcinoma colorretal humano, Caco-2, e investigar os efeitos dessa interação na proliferação celular e na síntese de GAGs. Componentes solúveis trocados pelas células nesse sistema, induziram um aumento marcante na proliferação da Caco-2, efeito não observado nos fibroblastos. Um aumento na biossíntese de GAGs por incorporação de 35S-NaSO4, foi observado em ambas linhagens, contudo o aumento mais significativo de condroitim sulfato (CS) foi detectado nas células estromais. A microscopia confocal mostrou um aumento expressivo de versicam produzido pelos fibroblastos. TGF-b1 exógeno também foi testado e exibiu um significante aumento de CS dose-dependente. Estes resultados sugerem que este fator de crescimento possa ser, em parte, responsável pelo aumento de CS observado nas células estromais, durante a interação parácrina. A linhagem Caco-2, previamente analisada neste trabalho, também foi usada em comparação com outra linhagem de maior potencial metastático, HCT116. Uma linhagem de epitélio intestinal de rato, IEC-6, foi utilizada como controle. A marcação dessas células com 35S-NaSO4 e a investigação de GAGs com enzimas específicas, mostraram aumento de 6-O-sulfatação de HS e CS. Os dados estruturais foram confirmados por PCR em Tempo Real, onde observamos a elevação específica da expressão do mRNA da 6-Osulfotransferase de heparam nas células Caco-2 e HCT116, quando comparadas à IEC-6. O aspecto mais estudado até o momento, entre a estrutura fina do HS e a sinalização para fatores de crescimento, é o possível envolvimento da 6-O-sulfatação na ativação da sinalização do FGF. Altos níveis de expressão de 6-O-sulfotransferase de condroitim-4- sulfato, foram encontrados nas células HCT116, cuja estrutura do CS contem GalNAc-4,6-sulfato, presente nos tetrassacarídeos e dissacarídeos dissulfatados. A participação dessas estruturas super-sulfatadas no CS tem sido correlacionada com a motilidade de células tumorais. Os dados estruturais obtidos neste trabalho e as correlações com as funções biológicas mencionadas, necessitam ser melhor investigados. / Proteoglycans (PG) are complex macromolecules composed of linear polysaccharide chains, the glycosaminoglycans (GAGs), covalently attached to a core protein. These GAG chains contain sulphate groups at various positions, giving rise to specific domains, which allows them to interact with extracellular matrix molecules, including various growth factors. In this study, we have used a transwell coculture system to analyse the interaction between human fibroblasts stromal cells and human colonic carcinoma cell line (Caco-2) and investigate the effects of this interaction on cell proliferation and glycosaminoglycans synthesis. Soluble components exchanged between the cell lines in Transwell system caused a marked increase of Caco-2 cell proliferation, not observed on fibroblasts. An increase of GAGs biosynthesis was observed in both cell lines, whereas a prominent increase of CS was observed mainly in stromal cells, as determined by incorporation of 35SNa2SO4. Confocal microscopy showed significant increase of versican production by fibroblasts cells. TGF-â was also tested exhibiting a significant increase on GAG synthesis mainly in fibroblasts cells, producing a strong CS-stimulating response. These results suggest that this growth factor may be responsible for the CS increase observed in stromal cells. Caco-2 cells previously analyzed in this work were used to compare with a cell line with increased metastatic potential, HCT116. A normal rat intestinal epithelium cell line, IEC-6 was used as control. Labeling of cells with 35S-Na2SO4 and investigation of GAGs with specific enzymes showed an increased 6-O-sulfation of HS and CS. GAGs structural data were confirmed by Real Time PCR with elevation of specific heparan-6-O-sulfotransferase mRNA expression on Caco-2 and HCT116 cells, compared to IEC-6. The most extensively studied aspect of relationship between HS fine structure and growth factor signaling to date is the possible involvement of 6-Osulfation in the activation of FGF signaling. High levels of chondroitin-4,6-O-sulfotransferase expression was found only in HCT116 cells, whose CS structure contained GalNAc,4,6-sulfate, present on tetrasaccharides and disulfated disaccharides. The participation of the oversulfated structure on CS has been shown to promote tumoral cell motility. Whether these structural data obtained in this work correlate to the mentioned biological functions, remains to be elucidated. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Talita Mariana Morata Raposo null (talita_raposo@yahoo.com.br) on 2016-08-26T23:53:52Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 7349096 bytes, checksum: 15c4a9aa3753843c66b8604dad27c6e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-08-30T18:12:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ferreira_tmmr_dr_jabo.pdf: 7349096 bytes, checksum: 15c4a9aa3753843c66b8604dad27c6e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-30T18:12:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ferreira_tmmr_dr_jabo.pdf: 7349096 bytes, checksum: 15c4a9aa3753843c66b8604dad27c6e8 (MD5) Previous issue date: 2016-08-22 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os tumores mamários são os principais tumores que acometem as cadelas, sendo também os tumores mais frequentes em mulheres e, entre ambas as espécies, são observadas semelhanças relacionadas ao comportamento biológico e molecular dessa neoplasia. Assim, as cadelas podem ser um excelente modelo comparativo para o entendimento do processo carcinogênico desta neoplasia. A metástase é uma consequência comum e a principal causa de mortalidade em decorrência dessa enfermidade, em ambas as espécies. O perfil de expressão gênica global permite o melhor entendimento do processo de carcinogênese e de metástases, por permitir a identificação de inúmeros genes que possam estar envolvidos com esses processos. Assim, o objetivo desse estudo foi a realização do estudo em larga escala, através da técnica de microarray, em amostras de tecidos mamários caninos, considerando amostras de glândulas mamárias normais, tumores mamários benignos e tumores mamários malignos (carcinomas simples e mistos), além da avaliação de carcinomas mamários metastáticos e não metastáticos, para identificação de genes diferencialmente expressos entre esses grupos e relacionados com a tumorigênese e o desenvolvimento de metástases dos tumores mamários caninos. Observou-se, aproximadamente 1000 genes diferencialmente expressos entre as amostras tumorais e as glândulas mamárias normais e 465 genes diferencialmente expressos entre os tumores mamários benignos e malignos, sendo observados genes relacionados com o ciclo celular, desenvolvimento da glândula mamária e supressores tumorais. Em relação aos carcinomas mamários metastáticos e não metastáticos, verificou-se 633 genes diferencialmente expressos. Os genes supressores tumorais, como pertencentes a via de sinalização do ATM e do BRCA1, sugeriram importante papel tanto na progressão tumoral quanto no desenvolvimento de metástases. Outras vias observadas foram as relacionadas com angiogênese e de organização da matriz extracelular. Portanto, a análise do perfil gênico em larga escala permitiu a identificação de inúmeros genes e vias envolvidas tanto no processo de progressão tumoral como envolvidas com o desenvolvimento de metástases, permitindo a realização de estudos futuros em busca de marcadores prognósticos específicos. / Mammary tumors are the main tumors that affect female dogs, as well as in women and in both species, it is observed similarity related to the biological and molecular behavior of this neoplasia. So, female dogs are considered an excellent model for the understanding of carcinogenesis process from mammary tumors. Metastasis occurs frequently and it is the main responsible for the mortality by this neoplasia in both species. Global gene expression profile allows the better understanding of carcinogenesis and metastasis process by the identification of several genes that may be involved with these processes. Therefore, the aim of study was to perform a large-scale study by microarray technique using samples from canine mammary tissues, as normal mammary gland, benign tumors and malignant tumors (simple and mixed carcinomas), beyond metastatic and non-metastatic mammary carcinomas for the identification of differentially expression genes among these groups and related to canine mammary tumors tumorigenesis and metastasis. It was observed next to 1000 differentially expression genes between tumors and normal mammary glands samples and 465 differentially expression genes between benign and malignant mammary tumors mostly related to cell cycle, mammary gland development and tumor suppressors. Related to metastatic and non-metastatic mammary carcinomas was identified 633 differentially expression genes. ATM and BRCA1, associated with tumor suppressor gene pathway, showed to play an important role in both tumor progression and metastasis development. Other networks observed were related to angiogenesis and extracellular matrix organization. Thus, large-scale gene profile analysis allowed the identification of numerous genes and networks involved with both tumor progression and metastasis, allowing new studies in search of specific prognostic markers. / FAPESP: 2013/03940-4 / FAPESP: 2013/25220-3