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Análise do fenótipo de células-tronco neoplásicas em células epiteliais displásicas orais e de carcinoma epidermóide oral resistentes à terapia fotodinâmica / Analysis of the tumor stem cell phenotype in oral dysplastic epithelial cells and oral squamous cell carcinoma resistant to photodynamic therapyBuck, Marina Gabriela Teixeira 17 October 2018 (has links)
O carcinoma epidermóide oral (CEO) tem alta incidência e mortalidade no mundo, sendo frequentes casos de recidivas em função da resistência aos tratamentos convencionais. Essa resistência tem sido associada à presença de células tronco tumorais (CTT). A terapia fotodinâmica (PDT) tem sido utilizada nos casos de desordens orais potencialmente malignas (DOPM) e CEOs superficiais, com relativo índice de sucesso. Contudo, são relatados casos de recidivas, que sugerem certa resistência à PDT. O objetivo do presente trabalho foi avaliar se células de DOPM desenvolvem resistência à PDT mediada pelo ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), tal qual ocorre com células de CEO expostas ao mesmo tratamento, bem como verificar se as células displásicas e neoplásicas orais exibem um fenótipo sugestivo de células tronco tumoral. Foram cultivadas células epiteliais displásicas orais (linhagem DOK) e células de CEO de língua (linhagem SCC9), divididas nos seguintes grupos experimentais: Grupo Controle - células sem tratamento; Grupo ALA - células tratadas com 5-ALA, com concentração e tempo de incubação igual ao do grupo PDT; Grupo LED - células tratadas com LED, com dosimetria igual ao do grupo PDT; Grupo PDT - células tratadas com PDT mediada pelo 5-ALA, subdivididas em duas gerações: geração 1 - células expostas a somente um ciclo de PDT; geração 4 - células expostas a quatro ciclos de PDT e que exibiram resistência (maior viabilidade) à dose inicial aplicada para a geração 1. Para esses grupos, foram realizados ensaios de formação de colônias e de invasão, bem como citometria de fluxo para verificar a expressão de CD44, ESA e p75NTR. Observou-se que todos os grupos expostos à PDT contendo células da linhagem DOK exibiram resistência à dose inicial de PDT, porém em intensidade menor àquela observada para a linhagem SCC9. As células resistentes à PDT de ambas as linhagens exibiram maior potencial de formação de colônias, mas somente a primeira geração de células exibiu maior potencial de invasão. Na análise de citometria de fluxo, observou-se que as células resistentes à PDT de ambas as linhagens exibiram superexpressão de CD44high/ESAhigh. A linhagem SCC9 exibiu ainda maior frequência de células CD44high/ESAlow e CD44high/p75NTR+, sugerindo a presença de uma subpopulação com alto potencial de invasão e resistente aos tratamentos convencionais. Não houve diferenças significativas na frequência de células ESAhigh/p75NTR+ em ambas as linhagens. Concluiu-se que as células displásicas orais desenvolvem resistência à PDT com intensidade menor se comparada às células SCC9. Em ambas as linhagens, as células resistentes exibiram um fenótipo sugestivo de células tronco tumorais. Esse fato deve ser considerado ao se instituir a PDT mediada pelo 5-ALA em lesões displásicas e neoplásicas orais que demandam múltiplos ciclos de tratamento. / Oral squamous cell carcinoma (SCC) has a high incidence and mortality in the world. There are frequent cases of relapses due to its resistance to conventional treatments. This resistance has been associated with the presence of cancer stem cells (CSC). Photodynamic therapy (PDT) has been used in cases of potentially malignant oral lesions (PMOL) and superficial SCC\'s, with a relative success rate. However, relapses are reported, which suggest some resistance to PDT. The aim of the present study was to evaluate whether PMOL cells develop resistance to PDT mediated by the 5- aminolevulinic acid (5-ALA), as occurs with SCC cells exposed to the same treatment, as well as to verify if dysplastic and oral neoplastic cells exhibit a suggestive phenotype of CSC. Oral dysplastic epithelial cells (DOK lineage) and CSC cells of the tongue (SCC9 lineage) were divided into the following experimental groups: Control Group - cells with no treatment; Group ALA - 5-ALA treated cells, with concentration and incubation time equal to that of the PDT group; LED group - LED light treated cells, with dosimetry equal to that of the PDT group; PDT group - cells treated with PDT mediated by the 5-ALA, subdivided into two generations: Generation 1 - cells exposed to only one PDT cycle; Generation 4 - cells exposed to four PDT cycles and exhibiting resistance (greater viability) to the initial dose applied for Generation 1. Colony forming and invasion assays, as well as flow cytometry to verify the expression of CD44, ESA and p75NTR were performed to the experimental groups. It was observed that all groups exposed to PDT containing DOK lineage cells exhibited resistance to the initial dose of PDT, but at a lower intensity than those observed for the SCC9 lineage. PDTresistant cells from both lineages exhibited increased potential for colony formation, but only the first generation of cells exhibited increased invasion potential. In flow cytometric analysis, PDT-resistant cells from both lineages exhibited overexpression of CD44high / ESAhigh. SCC9 lineage also exhibited higher frequency of CD44high / ESAlow and CD44high / p75NTR+ cells, suggesting the presence of a subpopulation with high invasion potential and resistant to conventional treatments. There were no significant differences in the frequency of ESAhigh / p75NTR+ cells in both lineages. It was concluded that the oral dysplastic cells develop resistance to PDT, with lower intensity when compared to SCC9 cells. In both lineages, the resistant cells exhibited a phenotype suggestive of CSC. This fact should be considered when establishing PDT mediated by the 5-ALA in oral dysplastic and neoplastic lesions that require multiple cycles of treatment.
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Análise da expressão de marcadores de morte celular em lesões potencialmente malignas orais induzidas com 4-NQO e tratadas com terapia fotodinâmica / Analysis of cellular death biomarkers expression in potentially malignant lesions induced with 4-NQO and treated with photodynamic therapyBarcessat, Ana Rita Pinheiro 05 April 2013 (has links)
As lesões potencialmente malignas orais (LPMO) constituem processos com chances de malignização e, portanto, o acompanhamento rigoroso e a retirada das lesões em situações de displasia são mandatórios. A terapia fotodinâmica (PDT) tem sido apontada como uma alternativa promissora e não invasiva para o tratamento dessas lesões. O princípio terapêutico da PDT envolve a geração de altos níveis de estresse oxidativo, pela associação de uma substância fotoativa com a energia eletromagnética e o oxigênio tecidual. É capaz de inviabilizar, através de cascatas de morte ainda pouco esclarecidas, células com alterações metabólicas significativas. A maioria dos trabalhos aponta a necessidade de várias sessões de PDT para erradicar as LPMO, porém o intervalo entre as sessões ainda é discutível. O objetivo deste trabalho foi estabelecer a relação anatomocronológica de marcadores de morte celular (caspase 3, beclin 1 e RIP 1 ) e de proteína de reparo do DNA durante o ciclo celular (PCNA) presentes após a PDT, com o intuito de verificar a cinética morte/proliferação celular e sugerir o intervalo de tempo entre as sessões de PDT mais adequado para a repetição da terapia. Para tanto, LPMOs foram induzidas por intermédio da aplicação tópica de 4-nitroquinolina-1-óxido (4-NQO) na mucosa lingual de ratos e posteriormente tratadas com PDT mediada pela administração tópica do ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) e laser comercial (660nm, 90J. cm-2, 1000mW. cm-2). O efeito da PDT foi analisado nos tempos experimentais de 6h, 24h, 48h e 72h após a primeira sessão de PDT, e em 6h e 72h após uma segunda sessão. Nesses períodos, as línguas foram avaliadas clinica e histopatologicamente em relação ao percentual de redução das lesões induzidas e à morfologia do tecido, bem como por meio de análise imuno-histoquímica para PCNA; caspase 3 clivada (presente na apoptose), Beclin 1 (presente na autofagia) e RIP 1 (presente na necroptose). Foi determinada a porcentagem de células positivas para esses marcadores no epitélio da mucosa lingual. Não houve remissão completa das lesões nas duas sessões de PDT, mas a segunda sessão acarretou diminuição em torno de 50% no tamanho das lesões. O período de 6h após a PDT foi o que exibiu significativa atrofia epitelial, bem como a maior porcentagem de células positivas para todos os marcadores analisados, incluindo o PCNA, em ambas as sessões. Caspase 3, beclin 1 e RIP 1 exibiram significativa diminuição da expressão em 24h. O PCNA exibiu aumento significativo no período 72h, e nos dois períodos do segundo ciclo. Como não houve a presença de necrose, a expressão aumentada de RIP 1 foi associada ao processo de apoptose e autofagia. Concluiu-se que a PDT mediada pelo 5-ALA provocou aumento da expressão de caspase 3, beclin 1 e RIP 1 em LPMO nas primeiras 6h após a terapia. Nesse modelo de PDT, essas proteínas parecem interagir em mecanismos de morte por apoptose e por autofagia, mas não por necrose. Considera- se o intervalo de 24h como o mais adequado para novo ciclo com os presentes parâmetros, sem que se estenda além de 72h. / The potentially malignant oral lesions (PMOL) are processes with great chances for cancer transformation and therefore the close monitoring and removal of lesions in cases of dysplasia are mandatory. Photodynamic therapy (PDT) has been identified as a promising and noninvasive treatment for these injuries. The therapeutic principle of PDT involves the generation of high levels of oxidative stress, by association of a photoactive substance with electromagnetic energy and tissue oxygen. It can kill metabolically changed cells through cascades of death which are still unclear. Most studies indicate the need of several PDT sessions to eradicate PMOL, however the interval between sessions is not consensual. The aim of this study was to establish the anatomical and chronological relationship between cellular death biomarkers (caspase 3, beclin 1 and RIP 1 ) and a DNA repair protein during cell cycle (PCNA) present after PDT, aiming to check the kinetic death/cell proliferation and suggest the time interval between PDT sessions more suitable to repetition of the PDT. For this purpose, PMOLs were induced by 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO) topical application on the lingual mucosa of rats and further treated with PDT mediated by topical administration of 5-aminolevulinic acid (5-ALA) and a commercial laser (Twin flex-MM Optics São Carlos-Brazil 660nm, 90J.cm-2,1000mW.cm-2).The effect of PDT was analyzed at 6h, 24h, 48h and 72h after the first session, and at 6h and 72h after a second session. In these periods, the tongues have been evaluated clinically and histopathologically regarding the percentage reduction of lesions induced and tissue morphology as well as by immunohistochemical analysis for PCNA, cleaved caspase 3 (present in apoptosis), Beclin 1 (present in autophagy) and RIP (present in necroptosis). The percentage of positive cells for these markers was determined in the epithelium of the tongue mucosa. There was no complete remission of lesions after two PDT sessions, but the second session resulted in a decrease of around 50% in lesion size. The period of 6 hours after PDT was the one in which significant epithelial atrophy was exhibited, as well as the highest percentage of positive cells for all tested markers, including PCNA in both sessions. Caspase 3, beclin 1 and RIP 1 exhibited a significant decrease of the expression at 24 hours. PCNA showed significant increase in the 72-hour period and after 6h and 72h from the second session. As there was no necrosis, the increased expression of RIP 1 has been linked to apoptosis and autophagy. It was concluded that PDT mediated by 5-ALA promoted increased expression of caspase 3, beclin 1 and RIP 1 at the PMOLs in the first 6 hours after therapy. For this PDT model, these proteins appear to interact with mechanisms of death by apoptosis and autophagy, but not necrosis. It is considered the range of 24h as the most suitable for another cycle with these parameters of PDT, which should not be extended beyond 72 hours.
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Análise da expressão de marcadores de morte celular em lesões potencialmente malignas orais induzidas com 4-NQO e tratadas com terapia fotodinâmica / Analysis of cellular death biomarkers expression in potentially malignant lesions induced with 4-NQO and treated with photodynamic therapyAna Rita Pinheiro Barcessat 05 April 2013 (has links)
As lesões potencialmente malignas orais (LPMO) constituem processos com chances de malignização e, portanto, o acompanhamento rigoroso e a retirada das lesões em situações de displasia são mandatórios. A terapia fotodinâmica (PDT) tem sido apontada como uma alternativa promissora e não invasiva para o tratamento dessas lesões. O princípio terapêutico da PDT envolve a geração de altos níveis de estresse oxidativo, pela associação de uma substância fotoativa com a energia eletromagnética e o oxigênio tecidual. É capaz de inviabilizar, através de cascatas de morte ainda pouco esclarecidas, células com alterações metabólicas significativas. A maioria dos trabalhos aponta a necessidade de várias sessões de PDT para erradicar as LPMO, porém o intervalo entre as sessões ainda é discutível. O objetivo deste trabalho foi estabelecer a relação anatomocronológica de marcadores de morte celular (caspase 3, beclin 1 e RIP 1 ) e de proteína de reparo do DNA durante o ciclo celular (PCNA) presentes após a PDT, com o intuito de verificar a cinética morte/proliferação celular e sugerir o intervalo de tempo entre as sessões de PDT mais adequado para a repetição da terapia. Para tanto, LPMOs foram induzidas por intermédio da aplicação tópica de 4-nitroquinolina-1-óxido (4-NQO) na mucosa lingual de ratos e posteriormente tratadas com PDT mediada pela administração tópica do ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) e laser comercial (660nm, 90J. cm-2, 1000mW. cm-2). O efeito da PDT foi analisado nos tempos experimentais de 6h, 24h, 48h e 72h após a primeira sessão de PDT, e em 6h e 72h após uma segunda sessão. Nesses períodos, as línguas foram avaliadas clinica e histopatologicamente em relação ao percentual de redução das lesões induzidas e à morfologia do tecido, bem como por meio de análise imuno-histoquímica para PCNA; caspase 3 clivada (presente na apoptose), Beclin 1 (presente na autofagia) e RIP 1 (presente na necroptose). Foi determinada a porcentagem de células positivas para esses marcadores no epitélio da mucosa lingual. Não houve remissão completa das lesões nas duas sessões de PDT, mas a segunda sessão acarretou diminuição em torno de 50% no tamanho das lesões. O período de 6h após a PDT foi o que exibiu significativa atrofia epitelial, bem como a maior porcentagem de células positivas para todos os marcadores analisados, incluindo o PCNA, em ambas as sessões. Caspase 3, beclin 1 e RIP 1 exibiram significativa diminuição da expressão em 24h. O PCNA exibiu aumento significativo no período 72h, e nos dois períodos do segundo ciclo. Como não houve a presença de necrose, a expressão aumentada de RIP 1 foi associada ao processo de apoptose e autofagia. Concluiu-se que a PDT mediada pelo 5-ALA provocou aumento da expressão de caspase 3, beclin 1 e RIP 1 em LPMO nas primeiras 6h após a terapia. Nesse modelo de PDT, essas proteínas parecem interagir em mecanismos de morte por apoptose e por autofagia, mas não por necrose. Considera- se o intervalo de 24h como o mais adequado para novo ciclo com os presentes parâmetros, sem que se estenda além de 72h. / The potentially malignant oral lesions (PMOL) are processes with great chances for cancer transformation and therefore the close monitoring and removal of lesions in cases of dysplasia are mandatory. Photodynamic therapy (PDT) has been identified as a promising and noninvasive treatment for these injuries. The therapeutic principle of PDT involves the generation of high levels of oxidative stress, by association of a photoactive substance with electromagnetic energy and tissue oxygen. It can kill metabolically changed cells through cascades of death which are still unclear. Most studies indicate the need of several PDT sessions to eradicate PMOL, however the interval between sessions is not consensual. The aim of this study was to establish the anatomical and chronological relationship between cellular death biomarkers (caspase 3, beclin 1 and RIP 1 ) and a DNA repair protein during cell cycle (PCNA) present after PDT, aiming to check the kinetic death/cell proliferation and suggest the time interval between PDT sessions more suitable to repetition of the PDT. For this purpose, PMOLs were induced by 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO) topical application on the lingual mucosa of rats and further treated with PDT mediated by topical administration of 5-aminolevulinic acid (5-ALA) and a commercial laser (Twin flex-MM Optics São Carlos-Brazil 660nm, 90J.cm-2,1000mW.cm-2).The effect of PDT was analyzed at 6h, 24h, 48h and 72h after the first session, and at 6h and 72h after a second session. In these periods, the tongues have been evaluated clinically and histopathologically regarding the percentage reduction of lesions induced and tissue morphology as well as by immunohistochemical analysis for PCNA, cleaved caspase 3 (present in apoptosis), Beclin 1 (present in autophagy) and RIP (present in necroptosis). The percentage of positive cells for these markers was determined in the epithelium of the tongue mucosa. There was no complete remission of lesions after two PDT sessions, but the second session resulted in a decrease of around 50% in lesion size. The period of 6 hours after PDT was the one in which significant epithelial atrophy was exhibited, as well as the highest percentage of positive cells for all tested markers, including PCNA in both sessions. Caspase 3, beclin 1 and RIP 1 exhibited a significant decrease of the expression at 24 hours. PCNA showed significant increase in the 72-hour period and after 6h and 72h from the second session. As there was no necrosis, the increased expression of RIP 1 has been linked to apoptosis and autophagy. It was concluded that PDT mediated by 5-ALA promoted increased expression of caspase 3, beclin 1 and RIP 1 at the PMOLs in the first 6 hours after therapy. For this PDT model, these proteins appear to interact with mechanisms of death by apoptosis and autophagy, but not necrosis. It is considered the range of 24h as the most suitable for another cycle with these parameters of PDT, which should not be extended beyond 72 hours.
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