Memoria para optar al título de Bioquímico / Las proteínas son moléculas versátiles que juegan una variedad de roles en la mantención del cuerpo humano, tal como el transporte de nutrientes. La transtiretina (TTR) es una proteína homotetramérica de 55 kDa que se encuentra en el plasma humano y en el cerebro, la cual es responsable del transporte de retinol (vitamina A) y T4 (tiroxina). Sin embargo, probablemente no es necesaria para la vida, puesto que ratones knock out tienen un desarrollo fetal y longevidad normales. La transtiretina, al igual que otras 25 proteínas humanas, ha sido asociada a la deposición de agregados amiloides. Algunas investigaciones anteriores han mostrado que las mutaciones incrementan considerablemente la tendencia de la proteína a formar agregados. A pesar de esto, la proteína wild type (wt-TTR) también muestra la capacidad para agregarse. Esto genera la enfermedad llamada amiloidosis sistémica senil, la cual afecta a 20% de las personas sobre los 80 años de edad. Es sabido que la asociación entre subunidades monoméricas gatilla la enfermedad a través de la disociación del tetrámero, puesto que la estabilización de la estructura cuaternaria suprime la formación de agregados. Recientemente nuestro grupo descubrió que la wt-TTR purificada a 4°C es tan tóxica como los agregados de bajo peso molecular más tóxicos para células de neuroblastoma humanas, sin embargo no lo es cuando se purifica a temperatura ambiente (22°C; RT). Para nuestro asombro, esta actividad citotóxica era inducida por la proteína en su forma tetramérica. Estudios biofísicos revelaron un ligero reordenamiento de la estructura terciaria de la proteína. Es de especial interés si este pequeño cambio estructural puede conducir al descubrimiento de nuevos epítopes citotóxicos. En este trabajo exploramos la estructura proteica en más detalle mediante métodos biofísicos para confirmar la existencia de este cambio conformacional e intentar encontrar dónde específicamente ocurre en la estructura de la proteína. Expresamos wt-TTR recombinante en Escherichia coli y la purificamos mediante cromatografía de intercambio iónico y cromatografía por exclusión de tamaño a 4°C y a RT. Estudiamos la fluorescencia intrínseca de triptófano de la proteína tetramérica para confirmar que wt-TTR purificada y almacenada en frío tiene una menor barrera de activación para la disociación a monómeros comparado con la proteína purificada y almacenada a RT. Esto fue llevado a cabo mediante el desplegamiento de la estructura usando una alta concentración de urea (6,0 M) como agente caotrópico. También realizamos un experimento de intercambio isotópico de hidrógeno y deuterio con espectrometría de masas (HXMS) con el objetivo de estudiar el intercambio local de hidrógenos en los grupos amida del esqueleto polipeptídico, los cuales permiten medir el aumento/disminución de la protección de diferentes segmentos de la proteína en cuanto al intercambio, dependiendo de la temperatura. Por último, un experimento de resonancia magnética nuclear (NMR) llamado correlación heteronuclear de cuanto sencillo (HSQC), poniendo a prueba wt-TTR marcada con el isótopo 15N cultivada en un medio M9 con agua deuterada al ~99%, nos permitió seguir el espectro de acoplamiento-J bidimensional entre 15N-1H de la proteína. El análisis de los espectros bidimensionales obtenidos a ambas temperaturas reveló que algunos residuos experimentan un claro cambio en su desplazamiento químico, indicando que efectivamente ocurren cambios en la estructura terciaria de la proteína. En conclusión, determinamos que wt-TTR sufre un cambio conformacional cuando es purificada a 4°C, a pesar de que la localización específica de éste en la estructura proteica continúa siendo desconocida / Proteins are versatile molecules that play a variety of roles in maintaining the human body, e.g. transport of nutrients. Transthyretin (TTR) is a 55 kDa homotetrameric protein found in human plasma and in the brain, responsible for the transport of retinol (vitamin A) and T4 (thyroxine). This protein is probably not essential for life, since TTR knockout mice have normal fetal development and lifespan. TTR, like 25 other human proteins, has been associated to the deposition of amyloid aggregates. Previous research has shown that mutations considerably increase the propensity of the protein to form aggregates. However, the wild type protein (wt-TTR) also exhibits this ability to aggregate, giving rise to the senile systemic amyloidosis disease that affects 20% people over 80 years of age. It is well accepted at the moment that self association of monomeric subunits triggers the disease through tetramer dissociation, since stabilization of the quaternary structure suppresses aggregate formation. Recently, our group discovered that wt-TTR purified at 4°C is just as toxic to human neuroblastoma cells as the most toxic small molecular weight aggregates, while when purified at room temperature (22°C; RT) it is not. Strikingly, this cytotoxicity was exhibited by the protein as a tetramer. Biophysical studies revealed a slight rearrangement of the tertiary structure of the protein. It is of high interest whether this minor structural change can lead to the discovery of new cytotoxic epitopes. Herein, we explored the protein structure in more detail by biophysical methods to confirm the existence of this conformational change and attempt to resolve where it specifically takes place in the protein structure. Recombinant wt-TTR was expressed in Escherichia coli and purified by ion exchange chromatography and size exclusion chromatography at 4°C and RT. We studied the tetramer’s intrinsic tryptophan fluorescence to confirm that cold purified and stored wt-TTR has a lower activation barrier for dissociation into monomers compared to the protein purified and stored at RT. This was performed by submitting the protein to unfolding using a high concentration of urea (6 M) as the chaotropic agent. We also carried out a hydrogen/deuterium isotope exchange mass spectrometry (HXMS) experiment in order to study the local exchange of backbone amide hydrogens, which serve as probes for increased/decreased protection of different segments of the protein towards exchange, depending on the temperature. At last, nuclear magnetic resonance spectroscopy using the heteronuclear single quantum coherence (HSQC) experiment probing a 15N isotope labeled wt-TTR grown in ~99% deuterated water M9 medium, allowed us to track the two dimensional 15N-1H J-coupling spectrum of the protein. Analysis of 2D spectra run at both temperatures revealed that some residues experience a clear change in chemical shift, indicating that changes in tertiary structure occurred. In conclusion, we determined that wt-TTR undergoes a conformational rearrangement when purified and stored at 4°C, although the exact location of this conformational change in the protein structure remains unclear

Avui en dia, els clínics no disposen de cap marcador tumoral eficaç per a realitzar el seguiment de pacients amb càncers de cap i coll (CCC). Objectius: Analitzar les característiques operatives de la prealbúmina (PRB) com a marcador d’activitat tumoral a pacients amb CCC en comparació amb altres marcadors utilitzats habitualment a pràctica clínica. Métodes: Es va dissenyar un estudi observacional prospectiu amb pacients atesos a l’ Hospital Universitari Arnau de Vilanova de Lleida amb diagnòstic principal de CCC. Durant el temps a estudi es varen recollir les principals característiques demogràfiques, clíniques i analítiques (inclosa la PRB) dels malalts a 3 fases diferents: al diagnòstic de la malaltia, al finalitzar el tractament i 12 mesos després. Resultats: Es van realitzar 174 determinacions de 138 pacients des de l’1 de gener del 2007 fins l’1 de febrer del 2010, l’edat mitja fou de 62,48(29-89) anys i 121 (88%) eren homes. Els diagnòstics histològics foren majoritàriament carcinomes escamosos 87 (63%).La mortalitat acumulada fou de 14,5% durant el període de seguiment. La sensibilitat, especificitat, així com els valors predictius positiu i negatiu foren 63,2%, 100%, 87% y 100% respectivament per a identificar activitat tumoral. Es va obtenir un àrea sota la curva ROC per a la PRB de 0,82 (interval de confiança de 0,74 a 0,90) que va ser superior a altres variables analitzades. Conclusions: La PRB és eficaç per a identificar activitat tumoral a pacients amb CCC i podria constituir una eina útil per a el clínic al seguiment de dits pacients. / Actualmente los clínicos no disponen de un marcador tumoral eficaz para realizar el seguimento de pacientes con cáncer de cabeza y cuello (CCC). Objetivos: Analizar las características operativas de la prealbúmina(PRB) como marcador de actividad tumoral en pacientes con CCC en comparación con otros marcadores habitualmente utilizados en la práctica clínica. Métodos: Se diseñó un estudio observacional prospectivo en pacientes atendidos en el Hospital Universitario Arnau de Vilanova de Lleida con diagnóstico principal de CCC. Durante el tiempo en estudio se recogieron las principales características demográficas, clínicas y analíticas (incluida la PRB) de los enfermos en 3 fases diferentes: al diagnóstico de la enfermedad, al finalizar el tratamiento y 12 meses después. Resultados. Se realizaron 174 determinaciones en 138 pacientes con CCC desde el 1 de enero del 2007 hasta el 1 de febrero del 2010. La edad media fue de 62,4 (29-89) años y 121 (88%) eran varones. El tipo histológico más frecuente fue el carcinoma escamoso (63%). La mortalidad acumulada fue del 14,5%. La sensibilidad, especificidad así como los valores predictivos positivo y negativo de la PRB para identificar actividad tumoral fue del 63,2%, 100%, 87% y 100%, respectivamente. Se obtuvo un área bajo la curva ROC para la PRB de 0,82 (IC 95%, 0,74 - 0,90), que fue superior a otras variables analizadas. Conclusiones: PRB es eficaz para identificar actividad tumoral en pacientes con CCC y podría constituir una herramienta útil para el clínico en el seguimiento de éstos enfermos. / Nowadays clinicians don’t have a useful tumoral marker to perform the follow up of patients affected of head and neck cancers (H&NC). Objectives: To Analize the operative characteristics of prealbumin (PRB) as a tumoral activity marker in those affected of head and neck cancer compared to other tumoral markers with common use in clinical practice. Methods: It was performed an observational prospective study with patiens visited in Hospital Universitari Arnau de Vilanova de Lleida with the main diagnosis of H&NC. During study time main epidemiological, clinical and analytical (including PRB) characteristics were collected in 3 times: at diagnosis, after finishing the treatment and 12 months later. Results: 174 blood samples were obertained from 138 patients from the 1st January 2007 till the 1st February 2010. Mean age was 62,48 (29-89) years and 121 (88%) were males. Most frequent histological diagnosis was scamous carcinoma 87 cases (63%). 19 patients (14,5) died during that time. Sensitivity, Specificity, positive and negative predictive values were 63,2%, 100%, 100%, 87% respectively. The area under the curve ROC was 0,82 (CI 0,74-0,90), that was better than other parameters studied. Conclussions: Prealbumin is a useful tumoral activity marker in those affected of head and neck cancer and It could be a useful tool in these patients follow up