Betel quid¡]BQ¡^chewing is recognized as a major risk factor for oral precancerous lesions¡]OPLs¡^in Taiwan. The compositions of Betel quid could cause DNA damage. X-ray repair cross complementing Group 1¡]XRCC1¡^plays a crucial role in the process of DNA repair. Polymorphisms in XRCC1 gene may affect DNA repairing ability and modulate the susceptibility of OPLs. The aim of this study was to investigate the association of XRCC1 genetic variants with the risk of BQ-related oral precancerous lesions, including oral leukoplakia¡]OL¡^ and oral submucous fibrosis ( OSF ). A total of 449 males¡]169 OL cases, 82 OSF cases, and 208 healthy controls¡^who habitually chewed BQ were recruited. The genotypes were determined by PCR-RFLP and TaqMan real-time assays. The C allele and T/C+C/C genotypes at XRCC1 -77 were associated with the reduced risk of OL ( AOR=0.54, 95%CI:0.34-0.85 and AOR=0.47, 95%CI:0.28-0.78, respectively ). The 399Gln allele and 399 Arg/Gln+Gln/Gln genotypes were associated with the increased risk of OL¡]AOR=1.94; 95%CI: 1.41-2.67 and AOR=2.64; 95%CI: 1.73-4.03, respectively¡^and OSF ( AOR=1.67; 95%CI: 1.11-2.49 and AOR=2.30; 95%CI: 1.35-3.91, respectively ). The haplotypes or diplotypes contain fewer risk alleles¡]-77T or 399Gln¡^ were with lower risk of OL¡]both Ptrend<0.001¡^and OSF (Ptrend=0.056 and Ptrend=0.040, respectively). In conclusion, our results suggest that polymorphisms of XRCC1 at -77 and 399 may be associated with the risk of OPLs.

by Chan Pui Chung, Denise. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2000. / Includes bibliographical references (leaves 119-135). / Abstracts in English and Chinese. / ACKNOWLEDGEMENTS --- p.i / ABSTRACT --- p.iii / ABSTRACT (CHINESE VERSION) --- p.v / TABLE OF CONTENTS --- p.vi / LIST OF TABLES --- p.x / LIST OF FIGURES --- p.xii / LIST OF ABBREVIATIONS --- p.xiv / Chapter CHAPTER 1 --- INTRODUCTION --- p.1 / Chapter 1.1 --- Biology of Human Papillomaviruses --- p.2 / Chapter 1.1.1 --- Taxonomy --- p.2 / Chapter 1.1.2 --- Genomic organisation --- p.2 / Chapter 1.1.3 --- "Types, subtypes and variants" --- p.4 / Chapter 1.2 --- Epidemiology of cervical cancers --- p.6 / Chapter 1.2.1 --- Incidence --- p.8 / Chapter 1.2.2 --- Cervical cancers screening programme --- p.10 / Chapter 1.3 --- Association between human papillomavirus and cervical cancers --- p.11 / Chapter 1.3.1 --- Infection --- p.11 / Chapter 1.3.2 --- Multistep pathogenesis of cervical cancers --- p.13 / Chapter 1.3.3 --- Geographical distribution --- p.14 / Chapter 1.3.4 --- Age distribution of HPV infection --- p.15 / Chapter 1.3.5 --- Oncogenic property of HPV --- p.15 / Chapter 1.3.6 --- Sequence variation --- p.20 / Chapter 1.4 --- Project design --- p.23 / Chapter CHAPTER 2 --- MATERIALS AND METHODS --- p.25 / Chapter 2.1 --- Evaluation of HPV DNA extraction methods for paraffin-embedded tissues --- p.26 / Chapter 2.1.1 --- Study population --- p.26 / Chapter 2.1.2 --- Paraffin-embedded tissue collection --- p.26 / Chapter 2.1.3 --- DNA extraction --- p.26 / Chapter 2.1.3.1 --- Phenol-chloroform extraction --- p.27 / Chapter 2.1.3.2 --- Microwave extraction --- p.28 / Chapter 2.1.3.3 --- QIAGEN spin column extraction --- p.28 / Chapter 2.1.4 --- PCR amplification --- p.29 / Chapter 2.1.4.1 --- PCR amplification for human beta-globin gene --- p.29 / Chapter 2.1.4.2 --- PCR amplification for HPV DNA --- p.30 / Chapter 2.1.5 --- Optimisation of PCRs --- p.30 / Chapter 2.1.5.1 --- Optimisation of beta-globin PCRs --- p.30 / Chapter 2.1.5.2 --- Optimisation of HPV PCRs --- p.31 / Chapter 2.1.5.3 --- Analytical sensitivity of PCRs --- p.31 / Chapter 2.1.5.3.1 --- Analytical sensitivity of beta-globin PCRs --- p.31 / Chapter 2.1.5.3.2 --- Analytical sensitivity of HPV PCRs --- p.32 / Chapter 2.1.5.4 --- Detection of PCR products --- p.32 / Chapter 2.1.6 --- PCR evaluation of DNA extraction methods --- p.33 / Chapter 2.1.6.1 --- Beta-globin PCRs --- p.33 / Chapter 2.1.6.2 --- HPV PCRs --- p.33 / Chapter 2.1.6.2.1 --- MY09/MY11 PCR --- p.33 / Chapter 2.1.6.2.2 --- GP5+/GP6+ PCR --- p.34 / Chapter 2.1.6.3 --- Detection of PCR products --- p.34 / Chapter 2.2 --- Prevalence and genotype distribution of HPV --- p.35 / Chapter 2.2.1 --- Study populations --- p.35 / Chapter 2.2.1.1 --- Women with normal cervices --- p.35 / Chapter 2.2.1.2 --- Women with abnormal cervical cytologies --- p.35 / Chapter 2.2.1.3 --- Women with cervical cancer --- p.35 / Chapter 2.2.2 --- Disease classification --- p.36 / Chapter 2.2.3 --- Specimen collection and preparation --- p.36 / Chapter 2.2.3.1 --- Cervical scrape collection --- p.36 / Chapter 2.2.3.1.1 --- DNA extraction --- p.37 / Chapter 2.2.4 --- HPV DNA detection --- p.37 / Chapter 2.2.4.1 --- MY09/MY11 PCR --- p.38 / Chapter 2.2.4.2 --- GP5+/GP6+ PCR --- p.38 / Chapter 2.2.4.3 --- Detection of PCR products --- p.38 / Chapter 2.2.5 --- HPV genotyping --- p.39 / Chapter 2.3 --- Sequence variation of HPV 16 E7 gene --- p.39 / Chapter 2.3.1 --- Study population --- p.39 / Chapter 2.3.2 --- Optimisation of HPV 16 E7 nested PCR --- p.40 / Chapter 2.3.3 --- HPV 16 E7 nested PCR --- p.41 / Chapter 2.3.3.1 --- Detection of PCR products --- p.42 / Chapter 2.3.4 --- Purification of nested PCR products --- p.42 / Chapter 2.3.5 --- Direct cycle sequencing --- p.42 / Chapter 2.3.5.1 --- Cycle sequencing reaction --- p.42 / Chapter 2.3.5.2 --- Purification of cycle sequencing products --- p.43 / Chapter 2.3.5.3 --- Electrophoresis on DNA sequencer --- p.43 / Chapter 2.3.6 --- Data analysis --- p.44 / Chapter 2.4 --- Statistical methods --- p.44 / Chapter CHAPTER 3 --- RESULTS --- p.45 / Chapter 3.1 --- Evaluation of HPV DNA extraction methods for paraffin-embedded tissues --- p.46 / Chapter 3.1.1 --- Optimised conditions for beta-globin PCRs --- p.46 / Chapter 3.1.2 --- Optimised conditions for HPV PCRs --- p.47 / Chapter 3.1.3 --- Analytical sensitivity of beta-globin and HPV PCRs --- p.48 / Chapter 3.1.4 --- PCR evaluation of DNA extraction methods --- p.48 / Chapter 3.1.4.1 --- PC03/PC07 PCRs --- p.48 / Chapter 3.1.4.2 --- Beta-GPl/Beta-GP2 PCRs --- p.49 / Chapter 3.1.4.3 --- HPV PCRs --- p.49 / Chapter 3.2 --- Prevalence and genotype distribution of HPV --- p.50 / Chapter 3.2.1 --- HPV detection --- p.50 / Chapter 3.2.2 --- HPV typing --- p.50 / Chapter 3.2.3 --- Women with normal cervices --- p.51 / Chapter 3.2.4 --- Women with abnormal cervical cytologies --- p.51 / Chapter 3.2.5 --- Women with cervical cancer --- p.53 / Chapter 3.3 --- Sequence variation of HPV 16 E7 gene --- p.54 / Chapter 3.3.1 --- Optimised conditions for HPV 16 E7 nested PCR --- p.54 / Chapter 3.3.2 --- HPV 16 E7 sequencing --- p.55 / Chapter 3.3.3 --- HPV 16 E7 variants --- p.55 / Chapter 3.3.4 --- Distribution of HPV 16 E7 variants --- p.56 / Chapter CHAPTER 4 --- DISCUSSION --- p.58 / Chapter 4.1 --- Evaluation of HPV DNA extraction methods for paraffin-embedded tissues --- p.59 / Chapter 4.1.1 --- PCR evaluation of DNA extraction methods --- p.59 / Chapter 4.2 --- Prevalence and genotype distribution of HPV --- p.61 / Chapter 4.2.1 --- Women with normal cervices --- p.61 / Chapter 4.2.2 --- Women with abnormal cervical cytologies --- p.62 / Chapter 4.2.3 --- Women with cervical cancer --- p.64 / Chapter 4.3 --- Sequence variation of HPV 16 E7 gene --- p.64 / Chapter CHAPTER 5 --- CONCLUSION --- p.69 / REFERENCES --- p.119

Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης είναι η τέταρτη συχνότερη κακοήθεια στους άνδρες και η δέκατη στις γυναίκες και η ετήσια επίπτωσή του αυξάνει συνεχώς στις ανεπτυγμένες χώρες. Oι προγνωστικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται σήμερα δεν μπορούν να προβλέψουν με βεβαιότητα την μακροπρόθεσμη έκβαση του ουροθηλιακού καρκίνου και έτσι προκύπτει η ανάγκη αναγνώρισης δεικτών με δυνατότητα πρόγνωσης της συμπεριφοράς των καρκινωμάτων. Επιπλέον, δεδομένων των περιορισμένων δυνατοτήτων των σημερινών θεραπευτικών επιλογών (χειρουργική αντιμετώπιση, χημειοθεραπεία ή ανοσοθεραπεία και ακτινοθεραπεία), απαιτούνται νέες θεραπευτικές στρατηγικές. Μία τέτοια στρατηγική είναι η στόχευση σε μεταγραφικούς παράγοντες όπως οι πυρηνικοί υποδοχείς και οι upstream ενεργοποιητές τους. Η διαταραχή αυτών των μεταγραφικών παραγόντων είναι κομβικό σημείο της έναρξης και διατήρησης του κακοήθους φαινοτύπου. O πυρηνικός υποδοχέας PPARγ εμπλέκεται στον έλεγχο του μεταβολισμού, την κυτταρική ανάπτυξη, την αγγειογένεση και την ανοσολογική και φλεγμονώδη απάντηση. Επιπρόσθετα, υπάρχουν ενδείξεις ότι ρυθμίζει τους μηχανισμούς καταστολής αλλά και προαγωγής της καρκινογένεσης. Ο RXRα είναι επίσης μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων και ετεροδιμερίζεται με τον PPARγ προς σχηματισμό του συμπλόκου που αλληλεπιδρά με το DNA. Οι προσδέτες των RXR υποδοχέων έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί στη χημειοπρόληψη διαφόρων μορφών καρκίνου. Ο μεταγραφικός παράγoντας AP-1, απαρτίζεται από διμερή των Fos και Jun πρωτεϊνών και η δράση του σχετίζεται με την πρόοδο της καρκινογένεσης. Υπάρχουν πάντως και ενδείξεις για προ-αποπτωτική δράση του. Η CBP είναι ένας απ’ τους σημαντικότερους ολοκληρωτές σημάτων της μεταγραφής. Ο ανταγωνισμός μεταξύ των PPARγ και AP-1 για τη CBP είναι ένας απ’ τους μηχανισμούς που εξηγούν την αρνητική «συνομιλία» (cross-talk) μεταξύ των PPARγ και AP-1. Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε τόσο ξεχωριστά όσο και σε συνδυασμό μεταξύ τους, την έκφραση των πέντε μοριακών παραγόντων (PPARγ, RXRα, p-c-Jun, c-Fos, CBP) στο φυσιολογικό ουροθήλιο, τις προκαρκινικές αλλοιώσεις και τα ουροθηλιακά καρκινώματα (ΟΚ). Τα ιστικά δείγματα προήλθαν από 88 ασθενείς οι οποίοι υπέστησαν διαγνωστική βιοψία ή θεραπευτική κυστεκτομή, νεφρεκτομή ή ουρητηρεκτομή. Εφαρμόστηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος σε τομές παραφίνης και εκτιμήθηκε η σχετική έκφραση των μελετώμενων παραγόντων στα ενδοκυττάρια διαμερίσματα, τις ενδοεπιθηλιακές στιβάδες και τις φυσιολογικές ή παθολογικές ιστολογικές βαθμίδες. Όλοι οι παράγοντες παρουσίασαν κυρίως πυρηνική εντόπιση. Η έκφραση του p-c-Jun ελαττώνεται στους ασθενείς άνω των 70 ετών σε σχέση με τους νεώτερους, ενώ κανένα άλλο απ’ τα μελετώμενα μόρια δε φαίνεται να επηρεάζεται από την ηλικία. Η έκφραση των PPARγ, CBP, p-c-Jun και c-Fos σημειώνει αύξηση κατά την πορεία προς τον καρκίνο. Όσο αφορά στα ΟΚ, οι PPARγ και CBP παρουσιάζουν αρνητική συσχέτιση με την αποδιαφοροποίηση. Επιπλέον ο PPARγ συσχετίζεται αρνητικά με την απόκτηση χαρακτήρων διήθησης στα ΟΚ. Αντιθέτως, η έκφραση του RXRα δεν διακυμαίνεται στατιστικώς σημαντικά σε όλη την πορεία της καρκινογένεσης. Η ανάλυση της συνδυασμένης έκφρασης των πέντε παραγόντων έγινε με σκοπό την αποκάλυψη ενδεχόμενων αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους. Η προστατευτική δράση του PPARγ στο ουροθήλιο συνοδεύεται από ταυτόχρονη μέτρια ή ισχυρή έκφραση των RXRα, p-c-Jun και c-Fos. Αναλυτικά, η αυξανόμενη έκφραση του p-c-Jun συμπίπτει με ενίσχυση της θετικής συσχέτισης του PPARγ με καλύτερα διαφοροποιημένους, λιγότερο διηθητικούς όγκους, ενώ ο c-Fos φαίνεται να εξασθενίζει ήπια την ευνοϊκή δράση του PPARγ στη διαφοροποίηση του ουροθηλίου. Η αυξανόμενη έκφραση της CBP έδειξε να εξασθενίζει και τελικά να εκμηδενίζει τη στατιστικά σημαντική αύξηση του PPARγ στην πορεία προς τον καρκίνο και την επαγωγή του στους μη διηθητικούς όγκους σε σύγκριση με τους διηθητικούς. Ταυτόχρονα, η αρνητική σχέση της CBP με την αποδιαφοροποίηση και την αύξηση της κακοήθειας των ΟΚ επηρεάζεται από την παρουσία των PPARγ και AP-1, επιβεβαιώνοντας την υπόθεση της συνομιλίας αυτών των μοριακών παραγόντων. Ενδιαφέρουσα είναι η παρατήρηση ότι οι περισσότερες από τις αναφερθείσες πιο πάνω συσχτίσεις μεταξύ των μοριακών παραγόντων ίσχυαν για μεγαλύτερους των 70 ετών αλλά όχι πάντα για τους νεώτερους ασθενείς. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης μπορούν πιθανόν να οδηγήσουν σε συμπεράσματα με εφαρμογή σε χημειοπροληπτικές και θεραπευτικές στρατηγικές για τον ουροθηλιακό καρκίνο. / Bladder cancer is the fourth and tenth most common malignancy in men and women, respectively, and its incidence is increasing annually in the developed countries. Current prognostic parameters cannot predict with certainty the long-term outcome of bladder cancer and as a result there is a need to identify markers that may predict tumor behavior. Furthermore, given the limitations of current therapeutic options (surgery, chemotherapy or immunotherapy and radiotherapy), novel treatment strategies are very much needed. One such strategy targets transcription factors such as nuclear receptors and their upstream activators. Disruption of these transcription factors is a key element in the initiation and maintenance of a malignant phenotype. The nuclear receptor PPARγ is involved in controlling metabolism, cell growth, angiogenesis, and immune and inflammatory responses. In addition, it has also been suggested that it regulates tumor suppression as well as tumor promotion. RXRα is another member of the nuclear receptor superfamily, that partners PPARγ to form the DNA-binding complex. RXR ligands are already being used as chemopreventive agents in various types of cancer. The transcription factor AP-1 is formed by dimerization of Jun and Fos proteins and its activity is often associated with tumor progression. On the other hand, there is also evidence that AP-1 may enhance apoptosis. CBP is one of the most important transcriptional integrators. The competition of PPARγ and AP-1 for CBP is one of the multiple mechanisms that explain the negative PPARγ/AP-1 cross-talk. In the present study, we assessed separate and concurrent expression of the five factors (PPARγ, RXRα, p-c-Jun, c-Fos, CBP) in normal urothelium, precancerous lesions and urothelial carcinomas (UC). Clinical samples were derived from 88 patients who had undergone diagnostic biopsy or therapeutic excision of the bladder, the kidney or the ureter. Parafin section immunohistochemistry was utilized and relative expression was estimated in intracellular compartments, intraepithelial layers and histologic categories of urothelium. All five factors had mainly nuclear pattern of expression. P-c-jun was downregulated in patients older than 70 years old compared to younger ones, whereas age did not affect the expression of the rest four factors. PPARγ, CBP, p-c-Jun and c-Fos were upregulated towards tumorigenesis. PPARγ and CBP showed an inverse relationship with carcinoma level of differentiation. Moreover, PPARγ expression downregulated significantly in invasive tumors compared to non-invasive ones. On the contrary, RXRα expression did not vary significantly along the carcinogenesis course. The following correlations were based on coexpression analysis to reveal molecular interactions between the five factors. The established protective effect of PPARγ on urothelium was accompanied by concomitant RXRα, p-c-Jun and c-Fos moderate or strong expression. In detail, p-c-Jun’s increasing expression strengthened the positive relation of PPARγ with better differentiated, less invasive tumors, whereas c-Fos seemed to mildly lessen PPARγ’s favourable effect in urothelium differentiation. Statistically significant PPARγ upregulation in malignant tissues compared to normal urothelium and in non-invasive tumors compared to invasive ones is suppressed and finally cancelled by CBP’s increasing expression. PPARγ and AP-1 seemed to influence the negative relation of CBP with loss of differentiation and increase of malignant potential in UC, an observation that denotes a cross-talk between these molecular factors. Interestingly, most of the aforementioned correlations were noticed in patients older than 70 years old, but not all of them were plausible in younger patients. The results from the present study could lead to conclusions possibly applicable in chemoprevention and therapy strategies for urothelial carcinomas.