Subsidiary mother cell (SMC) divisions during stomatal complex formation in Zea mays are asymmetric generating a small subsidiary cell (SC) and a larger epidermal cell. Mutants with a high number of abnormally shaped subsidiary cells include the brick1 (brk1) and discordia1 (dcd1) mutants. BRK1 is homologous to HSPC300, an ARP2/3 complex activator, and is involved in actin nucleation while DCD1 is a regulatory subunit of the PP2A phosphatase needed for microtubule generation (Frank and Smith, 2002; Wright et al. 2009). Possible causes of the abnormal SCs in brk1 mutants include a failure of the SMC nucleus to polarize in advance of mitosis, no actin patch, and transverse and/or no PPBs (Gallagher and Smith, 2000; Panteris et al 2006). The abnormal subsidiary mother cell division in dcd1 is due to correctly localized, but disorganized preprophase bands (PPBs; Wright et al. 2009). The observation that brk1 has defects in PPB formation and that the dcd1 phenotype is enhanced by the application of actin inhibitors led us to examine the dcd1; brk1 double mutant (Gallagher and Smith, 1999). We found that dcd1; brk1 double mutants demonstrate a higher percentage of aberrant SCs than the single mutants combined suggesting that these two mutations have a synergistic and additive effect on SC formation. Our observations and results are intriguing and the future step will be to quantitate the abnormal PPBs and phragmoplasts in the double and single mutants using immunolocalization of tubulin and actin as well as observations of live cells expressing tubulin-YFP.

Les cellules végétales sont entourées d’une paroi pecto-cellulosique rigide, soudant les cellules les unes aux autres et empêchant toute migration. Lors de la mitose, le positionnement du plan de division est donc un processus fondamental dans l’organisation des tissus puisque les cellules nouvellement formées restent à leur position initiale après la cytokinèse. Chez les plantes terrestres, le plan de division est déterminé lors de la transition G2/M du cycle cellulaire par l’anneau de préprophase (PPB), une structure transitoire corticale de microtubules. Les mécanismes mis en jeu pour la formation de la PPB sont encore inconnus. L’équipe dans laquelle j’ai effectué ma thèse a identifié un complexe régulateur, le complexe TTP, composé de TON1, de la famille de protéines TON1-Recruiting-Motif (TRMs) et d’une phosphatase de type 2A où FASS est la sous-unité régulatrice. TON1 et FASS sont impliquées dans l’organisation des microtubules corticaux en interphase, et sont indispensables à la formation de la PPB. La famille des protéines TRMs, identifiée récemment, est composée de 34 membres, dont certains sont capables de se lier aux microtubules et de recruter TON1 et FASS au cytosquelette. Les profils d’expression des TRMs et les analyses génétiques préliminaires suggèrent que certaines auraient un rôle en interphase, alors que d’autres pourraient être impliquées dans la formation de la PPB. Mon projet était d’identifier et de caractériser, si elles existent, les TRMs impliquées spécifiquement dans la formation de la PPB. L’analyse des données de transcriptome a révélé qu’un des gènes de la famille TRM, le gène TRM7, présente un pic d’expression en mitose. Nous avons d'abord montré que TRM7 est spécifiquement exprimée dans les tissus en division. L’utilisation d’une fusion génomique TRM7-3xYpet indique d'autre part que la protéine TRM7 n’est exprimée qu’au stade G2/M. Elle est localisée à la PPB et disparaît en début de métaphase, peu après dépolymérisation de la PPB. TRM7 est ainsi le seul marqueur spécifique de la PPB identifié à ce jour chez les plantes, puisque toutes les autres protéines localisées à la PPB marquent également les autres structures mitotiques ou le cytosquelette d’interphase. TRM7 fait partie d’un sous-groupe de trois TRM partageant environ 74% de similarité de séquence. L’analyse phénotypique du mutant trm7, ainsi que celui du triple mutant trm6 trm7 trm8 a montré que ce sous-groupe de protéines joue un rôle majeur dans la formation de la PPB. Près de la moitié des cellules du mutant trm7 présentent un stade préprophase aberrant alors que 100% des cellules du triple mutant au stade G2/M sont affectées, la très grande majorité se divisant sans former de PPB. Étonnamment, la morphologie de ces mutants est peu perturbée et le phénotype n’est en rien comparable au syndrome développemental sévère des mutants ton1 ou fass dépourvus de PPB. De plus, les plans de division ne sont pas aléatoires comme c’est le cas pour les mutants ton1 et fass. Nos résultats permettent donc d'apporter une nouvelle lumière sur le rôle de la PPB dans la détermination du plan de division. Pour la première fois, grâce au triple mutant trm6 trm7 trm8, nous avons réussi à découpler les fonctions interphasiques de la fonction mitotique du complexe TTP, ce qui était jusqu’alors impossible chez les mutants ton1 ou fass où les défauts en interphase et les défauts dus à l’absence de PPB étaient indissociables. Tous les composants du complexe TTP partageant des similarités avec des protéines centrosomales animales faisant partie du même complexe, nous avons exploré dans un projet annexe, la conservation des interactions au sein du complexe animal. Nous avons pu mettre en évidence, grâce au système double-hybride chez la levure, des interactions entre protéines animales et protéines végétales. / Plant cells are embedded within a semi-rigid pecto-cellulosic cell wall that prevents cell migration. As a consequence, three-dimensional cellular organization of tissues mostly results from polarized cell division, since new cells remain in place after mitosis with no possibility for subsequent relocation. In land plants, the division plane is determined pre-mitotically, during the G2 to M phase transition by the preprophase band (PPB), a transient, premitotic microtubule array. The molecular pathways leading to preprophase band formation are still largely unknown. Our team has identified a regulatory complex, the TTP complex, composed of TON1, TRM and a Protein Phosphatase 2A complex with FASS as the regulatory subunit. Both TON1 and FASS have been shown to be involved in cortical microtubules organization during both interphase and PPB formation. The TRM super family is a newly identified protein family composed of 34 members, some of which are microtubule-associated proteins able to recruit TON1 and FASS to the microtubules. Based on TRM expression profiles and preliminary genetic analysis, we hypothesized that some TRMs could have a role in interphase, while others could be involved in PPB formation. My project was to identify and characterize TRMs specifically involved in PPB formation, if any. Transcriptomic analysis using the Genevestigator tool revealed that one TRM gene, TRM7, has a peak of expression at mitosis. TRM7 promoter GUS fusion analysis confirmed that TRM7 is expressed in all dividing tissues and in situ hybridizations of shoot apical meristems revealed a patchy pattern of expression, typical of cell cycle-regulated genes. Remarkably, the genomic TRM7-3xYFP fusion is only expressed at the G2/M transition where it localizes to the PPB, persists beyond PPB degradation until the beginning of metaphase and then disappears. To our knowledge, this makes TRM7 the only PPB-specific marker identified in plants so far, since all other PPB-associated markers label others structures as well, both interphasic or mitotic. TRM7 is part of the TRM6-7-8 sub-family, which share 74% of similarity. Phenotypic analysis of the trm7 and trm6 trm7 trm8 triple mutant revealed a major role of this sub-group in PPB formation. Almost half trm7 cells and all trm6 trm7 trm8 cells displayed an abnormal preprophase stage, the vast majority of the triple mutant cells dividing without PPB. Surprisingly, the triple mutant phenotype is rather mild compare to the severe developmental syndrome of PPB-lacking ton1 or fass plants. Moreover, although often shifted, division plane positioning is far from being fully randomized as in ton1 and fass mutants. Our results show that, for the first time, we have fully uncoupled the mitotic function of the TTP complex from its interphasic function, contrarily to other TTP mutants analyzed so far, where division and interphase defects are indistinguishable. Moreover, these findings question the central role of the PPB in division plane positioning. All TTP components share similarities with animal proteins assembled within a complex at the centrosome. In a side project, we studied the conservation of protein interactions within the animal complex and were able to find cross-interactions between animal and plant proteins in yeast two-hybrid experiments.

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La morphogenèse des plantes repose sur deux mécanismes cellulaires : la division et l'élongation. Par ailleurs, la croissance est source de contraintes mécaniques qui affectent les cellules et guident la morphogenèse. Si les contraintes mécaniques influencent l'orientation du plan de division dans les cellules animales, rien n'est prouvé pour les cellules végétales. À l'heure actuelle, la forme de la cellule est proposée comme le facteur principal gouvernant l'orientation du plan dans les divisions symétriques : les cellules se divisent selon un des plans les plus courts. Cette règle géométrique a été validée dans des tissus à croissance ou courbure isotropes, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents demeurent inconnus. Dans cette thèse, un pipeline a été mis au point pour analyser les divisions cellulaires dans les différents domaines du méristème apical caulinaire d'Arabidopsis thaliana et questionner l'application de la règle géométrique dans ce tissu. La zone frontière du méristème présente une proportion anormalement basse de plans de division très courts. Des simulations de tissus en croissance, dans lesquelles une règle de division mécanique a été implémentée, ont montrées le même biais sur les orientation des plans, comparé à la règle géométrique. Des ablations laser de quelques cellules de l'épiderme ont également été effectuées afin de perturber localement le patron de contraintes mécaniques. Les résultats montrent que l'orientation du plan des divisions postérieures à cette perturbation suit le nouveau patron de contraintes. Enfin, une nouvelle méthode quantitative, basée sur l'utilisation d'un micro-indenteur, a été mise au point pour quantifier la réponse du cytosquelette, et en particulier des microtubules, aux contraintes mécaniques. Le protocole de compression a été testé et validé sur les mutants katanin et spiral2, dans lesquels la réponse aux contraintes est respectivement faible ou amplifiée. / Morphogenesis during primary plant growth is driven by cell division and elongation. In turn, growth generates mechanical stress, which impacts cellular events and channels morphogenesis. Mechanical stress impacts the orientation of division plane in single animal cells; this remains to be fully demonstrated in plants. Currently, cell geometry is proposed to be the main factor determining plane orientation in symmetric divisions: cell divide along one the shortest paths. This geometrical rule was tested on tissues with rather isotropic shapes or growth and the corresponding molecular mechanism remains unknown, although it could involve tension within the cytoskeleton. To address these shortcomings, we developed a pipeline to analyze cell divisions in the different domains of the shoot apical meristem of Arabidopsis thaliana. We computed the probability of each possible planes according to cell geometry and compared the output to observed orientations. A quarter of the cells did not follow the geometrical rule. Boundary domain was enriched in long planes aligned with supracellular maximal tension lines. Computer simulations of a growing tissue following a division rule that relies on tension gave the most realistic outputs. Mechanical perturbations of local stress pattern, by laser ablations, further confirmed the importance of mechanical stress in cell division. To explore the role of microtubules in this process, we developed a microindenter-based protocol to quantify the cytoskeletal response to mechanical stress. This protocol was tested and validated in the katanin and spiral2 mutants, in which the response to stress is delayed or promoted respectively.