Mesenchymal stromal cell (MSC) transplantation ameliorated hepatic lipid load; tissue inflammation; and fibrosis in rodent animal models of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) by as yet largely unknown mechanism(s). In a mouse model of NASH; we transplanted bone marrow-derived MSCs into the livers; which were analyzed one week thereafter. Combined metabolomic and proteomic data were applied to weighted gene correlation network analysis (WGCNA) and subsequent identification of key drivers. Livers were analyzed histologically and biochemically. The mechanisms of MSC action on hepatocyte lipid accumulation were studied in co-cultures of hepatocytes and MSCs by quantitative image analysis and immunocytochemistry. WGCNA and key driver analysis revealed that NASH caused the impairment of central carbon; amino acid; and lipid metabolism associated with mitochondrial and peroxisomal dysfunction; which was reversed by MSC treatment. MSC improved hepatic lipid metabolism and tissue homeostasis. In co-cultures of hepatocytes and MSCs; the decrease of lipid load was associated with the transfer of mitochondria from the MSCs to the hepatocytes via tunneling nanotubes (TNTs). Hence; MSCs may ameliorate lipid load and tissue perturbance by the donation of mitochondria to the hepatocytes. Thereby; they may provide oxidative capacity for lipid breakdown and thus promote recovery from NASH-induced metabolic impairment and tissue injury.

L'hépatite C pose un problème de santé publique majeur, dans la mesure où le risque de développer une infection chronique est relativement élevé (40 à 60%) et où la résistance au traitement de choix - l’interféron alpha pégylé et la ribavirine - touche près de la moitié des patients. Cette persistence virale repose avant tout sur de puissantes stratégies d’évasion du système immunitaire inné de l’hôte par le virus. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de la réponse antivirale dans des hépatocytes primaires humains normaux et chroniquement infectés avec le VHC, un domaine encore largement inconnu dû à la difficulté d’obtenir ce type de matériel primaire. Nous avons étudié la fonctionnalité de deux voies majeures de détection des pathogènes viraux suite à l’exposition d’hépatocytes primaires humains à de l’ARNdb intracellulaire, via le récepteur et adaptateur RIG-I/MDA5-CARDIF, et extracellulaire via TLR3-TRIF, mimant ainsi les étapes précoces de la détection d’un virus par la cellule hôte. Nous avons établi par RT-PCR quantitatif et analyse transcriptomique par microarray, que ces deux voies de stimulation sont fonctionnelles dans des hépatocytes primaires normaux et que leur activation entraîne à la fois l’expression de gènes antiviraux communs (ISG56, ISG15, CXCL10, …) mais aussi spécifiques avec les gènes IL28A, IL28B et IL29 qui sont une signature de l’activation de la voie de détection de l’ARNdb intracellulaire. La protéine virale NS3/4A joue un rôle majeur à la fois dans le clivage de la polyprotéine virale initiale, mais aussi en interférant avec les cascades de signalisation engagées suite à la détection par la cellule hôte de l’ARN du VHC. Plus particulièrement, nous avons démontré que l’expression ectopique de NS3/4A dans des hépatocytes primaires humains normaux entraîne une diminution significative de l’induction des gènes antiviraux dûe au clivage de CARDIF au cours de l’activation de la voie de signalisation médiée par RIG-I. Nous avons également démontré que l’expression de la NS3/4A entraîne des modifications de l’expression de gènes-clé impliqués dans la régulation de l’apoptose et du programme de mort cellulaire, en particulier lorsque la voie TLR3 est induite. L’ensemble de ces effets sont abolis en présence de BILN2061, inhibiteur spécifique de NS3/4A. Malgré les stratégies de subversion de l’immunité innée par le VHC, nous avons démontré l’induction significative de plusieurs ISGs et chemokines dans des hepatocytes primaires provenant de patients chroniquement infectés avec le VHC, sans toutefois détecter d’interférons de type I, III ou certains gènes antiviraux précoces comme CCL5. Ces observations, concomitantes avec une diminution de l’expression de CARDIF et une correlation inverse entre les niveaux d’ARNm des ISGs et l’ARN viral révèlent une réponse antivirale partielle dûe à des mécanismes interférents sous-jacents. Cette réponse antivirale détectable mais inefficace est à mettre en lien avec l’échec du traitement classique PEG-IFN-ribavirine chez la moitié des patients traités, mais aussi en lien avec l’inflammation chronique et les dommages hépatiques qui mènent ultimement au développement d’une fibrose puis d’une cirrhose chez une grande proportion de patients chroniquement infectés. / Hepatitis C infection is a worldwide health problem since the risk to develop a persistent infection is relatively elevated (40 to 60%) and nearly half of the infected patients do not respond to the classical anti-HCV therapy based on a combination of PEG-IFNα and ribavirin. Viral persistence is based on powerful evasion strategies of the host’s innate immune system. In our study, we characterized antiviral response in primary human normal and chronically HCV-infected hepatocytes, a cutting-edge in our field due to the difficulty to isolate this particular cell type. In order to better define the antiviral response in freshly isolated human primary hepatocytes, we stimulated these cells with extracellular and intracellular dsRNA to trigger TLR3/TRIF and RIG-I-MDA5/CARDIF-mediated antiviral signaling pathways. By using qRT-PCR and microarray analysis, we report that both detection pathways are functional in normal human hepatocytes, their activation leading to the expression of both common (IFIT1, OASL, ISG15 and CXCL10) and specific genes (IL28A, IL28B and IL29), these last ones being a signature of the intracellular dsRNA-mediated pathway. HCV NS3/4A plays a key role in the viral polyprotein processing and upon viral RNA detection by interfering with the host’s antiviral signalling cascades. We report that major antiviral genes induction following activation of RIG-I mediated pathway are severely impaired in ectopically NS3/4A expressing normal hepatocytes due to CARDIF cleavage, but can be restored by specific NS3/4A inhibitor BILN2061. Our microarray analysis also revealed a role for NS3/4A following TRL3-mediated pathway activation on regulation of apoptosis and programmed cell death, which could be linked to strategies for the virus to persist in its host. Despite HCV strategies to circumvent the host’s immune defense system, we observed significant upregulation of ISGs and chemokines in liver biopsies and corresponding isolated hepatocytes from chronically HCV-infected patients. However, no type I and III interferon, neither key-antiviral genes (e.g., CCL5) were detected, underlying an ongoing –but inefficient- antiviral response unable to eradicate the virus. Moreover, we obtained significant inverse correlations between ISGs mRNAs and viral RNA in addition to CARDIF decrease, clearly unravelling efficient viral interfering strategies in a context of chronic HCV infection. This sustained -albeit incomplete- hepatic innate immune response is certainly associated to the failure of the classical IFN-based therapy in half of the infected patients and to the chronic inflammation causing liver damages and eventually leading to hepatocarcinoma which is often observed at late stage of the disease.

L'hépatite C pose un problème de santé publique majeur, dans la mesure où le risque de développer une infection chronique est relativement élevé (40 à 60%) et où la résistance au traitement de choix - l’interféron alpha pégylé et la ribavirine - touche près de la moitié des patients. Cette persistence virale repose avant tout sur de puissantes stratégies d’évasion du système immunitaire inné de l’hôte par le virus. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de la réponse antivirale dans des hépatocytes primaires humains normaux et chroniquement infectés avec le VHC, un domaine encore largement inconnu dû à la difficulté d’obtenir ce type de matériel primaire. Nous avons étudié la fonctionnalité de deux voies majeures de détection des pathogènes viraux suite à l’exposition d’hépatocytes primaires humains à de l’ARNdb intracellulaire, via le récepteur et adaptateur RIG-I/MDA5-CARDIF, et extracellulaire via TLR3-TRIF, mimant ainsi les étapes précoces de la détection d’un virus par la cellule hôte. Nous avons établi par RT-PCR quantitatif et analyse transcriptomique par microarray, que ces deux voies de stimulation sont fonctionnelles dans des hépatocytes primaires normaux et que leur activation entraîne à la fois l’expression de gènes antiviraux communs (ISG56, ISG15, CXCL10, …) mais aussi spécifiques avec les gènes IL28A, IL28B et IL29 qui sont une signature de l’activation de la voie de détection de l’ARNdb intracellulaire. La protéine virale NS3/4A joue un rôle majeur à la fois dans le clivage de la polyprotéine virale initiale, mais aussi en interférant avec les cascades de signalisation engagées suite à la détection par la cellule hôte de l’ARN du VHC. Plus particulièrement, nous avons démontré que l’expression ectopique de NS3/4A dans des hépatocytes primaires humains normaux entraîne une diminution significative de l’induction des gènes antiviraux dûe au clivage de CARDIF au cours de l’activation de la voie de signalisation médiée par RIG-I. Nous avons également démontré que l’expression de la NS3/4A entraîne des modifications de l’expression de gènes-clé impliqués dans la régulation de l’apoptose et du programme de mort cellulaire, en particulier lorsque la voie TLR3 est induite. L’ensemble de ces effets sont abolis en présence de BILN2061, inhibiteur spécifique de NS3/4A. Malgré les stratégies de subversion de l’immunité innée par le VHC, nous avons démontré l’induction significative de plusieurs ISGs et chemokines dans des hepatocytes primaires provenant de patients chroniquement infectés avec le VHC, sans toutefois détecter d’interférons de type I, III ou certains gènes antiviraux précoces comme CCL5. Ces observations, concomitantes avec une diminution de l’expression de CARDIF et une correlation inverse entre les niveaux d’ARNm des ISGs et l’ARN viral révèlent une réponse antivirale partielle dûe à des mécanismes interférents sous-jacents. Cette réponse antivirale détectable mais inefficace est à mettre en lien avec l’échec du traitement classique PEG-IFN-ribavirine chez la moitié des patients traités, mais aussi en lien avec l’inflammation chronique et les dommages hépatiques qui mènent ultimement au développement d’une fibrose puis d’une cirrhose chez une grande proportion de patients chroniquement infectés. / Hepatitis C infection is a worldwide health problem since the risk to develop a persistent infection is relatively elevated (40 to 60%) and nearly half of the infected patients do not respond to the classical anti-HCV therapy based on a combination of PEG-IFNα and ribavirin. Viral persistence is based on powerful evasion strategies of the host’s innate immune system. In our study, we characterized antiviral response in primary human normal and chronically HCV-infected hepatocytes, a cutting-edge in our field due to the difficulty to isolate this particular cell type. In order to better define the antiviral response in freshly isolated human primary hepatocytes, we stimulated these cells with extracellular and intracellular dsRNA to trigger TLR3/TRIF and RIG-I-MDA5/CARDIF-mediated antiviral signaling pathways. By using qRT-PCR and microarray analysis, we report that both detection pathways are functional in normal human hepatocytes, their activation leading to the expression of both common (IFIT1, OASL, ISG15 and CXCL10) and specific genes (IL28A, IL28B and IL29), these last ones being a signature of the intracellular dsRNA-mediated pathway. HCV NS3/4A plays a key role in the viral polyprotein processing and upon viral RNA detection by interfering with the host’s antiviral signalling cascades. We report that major antiviral genes induction following activation of RIG-I mediated pathway are severely impaired in ectopically NS3/4A expressing normal hepatocytes due to CARDIF cleavage, but can be restored by specific NS3/4A inhibitor BILN2061. Our microarray analysis also revealed a role for NS3/4A following TRL3-mediated pathway activation on regulation of apoptosis and programmed cell death, which could be linked to strategies for the virus to persist in its host. Despite HCV strategies to circumvent the host’s immune defense system, we observed significant upregulation of ISGs and chemokines in liver biopsies and corresponding isolated hepatocytes from chronically HCV-infected patients. However, no type I and III interferon, neither key-antiviral genes (e.g., CCL5) were detected, underlying an ongoing –but inefficient- antiviral response unable to eradicate the virus. Moreover, we obtained significant inverse correlations between ISGs mRNAs and viral RNA in addition to CARDIF decrease, clearly unravelling efficient viral interfering strategies in a context of chronic HCV infection. This sustained -albeit incomplete- hepatic innate immune response is certainly associated to the failure of the classical IFN-based therapy in half of the infected patients and to the chronic inflammation causing liver damages and eventually leading to hepatocarcinoma which is often observed at late stage of the disease.

La stéatose hépatique affecte 20 à 40% de la population et progresse de façon constante. Il s’agit d’une pathologie chronique fortement associée au syndrome métabolique. Sa pathogenèse est mal comprise. Une altération du métabolisme des lipides dans le foie entraînant une accumulation intra-hépatique de lipides est probablement la cause majeure de la stéatose hépatique. A ce jour, il n’existe pas de traitement spécifique de la stéatose hépatique. La protéine kinase activée par l’AMP (AMPK) est un régulateur clé du métabolisme énergétique. Notamment, l’AMPK contrôle le métabolisme des lipides en inhibant la synthèse des acides gras et du cholestérol, et en stimulant l'oxydation des acides gras. Plusieurs études ont montré l’existence d’une association entre l’accumulation intracellulaire de lipides et une perte d’activité de l’AMPK dans le foie. Ces observations suggèrent que l’AMPK pourrait être un facteur impliqué dans la physiopathologie de la stéatose hépatique. Pour étudier cette hypothèse, nous avons généré un nouveau modèle de souris knockout dépourvu des sous-unités catalytiques α1 et α2 de l’AMPK spécifiquement dans le foie. Nous avons analysé les conséquences de cette délétion sur le métabolisme lipidique dans différentes situations nutritionnelles. La délétion de l’AMPK dans le foie ne modifie pas le contenu hépatique en triglycérides et en cholestérol au cours d’un jeûne ou après une réalimentation riche en glucides. Egalement, l’expression des gènes de la lipogenèse n’est pas modifiée dans le foie de ces animaux. De plus, l’oxydation des acides gras n’est pas altérée même après un jeûne de 24h. Etonnamment, l’absence de l’AMPK dans le foie n’amplifie pas la stéatose hépatique, ni l’hyperglycémie ou l’intolérance au glucose lorsque les souris sont nourries avec un régime riche en lipides. Cependant, l’activation de l’AMPK in vivo avec l'activateur direct, A-769662, normalise la stéatose hépatique chez des souris lipodystrophiques aP2-SREBP-1c et chez des souris obèses nourries avec un régime riche en lipides. Cet effet est dépendant de l’AMPK car il est totalement perdu chez des souris dépourvues d’AMPK dans le foie. Dans des hépatocytes de souris en culture primaire, l’activation de l'AMPK par un activateur direct (A-769662) ou par des activateurs indirects (metformine et AICAR) réduit le flux lipogénique et augmente l’oxydation des acides gras. Ces effets sont totalement abolis dans des hépatocytes AMPK KO, démontrant l’action spécifique de l'AMPK sur le métabolisme lipidique en réponse à ces composés. Ces résultats obtenus chez la souris sont extrapolables à l'homme puisque nous avons montré que l'activation de l'AMPK dans des hépatocytes humains en culture primaire inhibe de manière efficace la synthèse des acides gras et du cholestérol. En conclusion, nos résultats démontrent que l’inactivation de l’AMPK dans le foie n’est pas un facteur déclenchant ou aggravant dans la physiopathologie de la stéatose hépatique. En revanche, l’activation pharmacologique de l’AMPK améliore efficacement la stéatose hépatique. Ainsi, l’AMPK est une cible potentielle pour le développement d'activateurs dans le but de traiter la stéatose hépatique chez l’homme. / Fatty liver disease affects between 20-40% of the population. This pathology is usually associated with metabolic disease. Its pathogenesis is poorly understood. Altered lipids metabolism in the liver resulting on hepatic fat accumulation is probably due to fatty liver. There is no specific treatment for fatty liver disease. AMP-activated protein kinase (AMPK) is a key regulator of energy metabolism. In particular, AMPK regulates lipid metabolism by inhibiting fatty acids and cholesterol synthesis, and stimulating fatty acids oxidation. Several studies have shown an association between intracellular lipid accumulation and loss of AMPK activity in the liver. These observations suggest that AMPK may be a factor involved in the pathogenesis of hepatic steatosis. To investigate this hypothesis, we generated a new model of knockout mice lacking the catalytic subunits of AMPK α1 and α2 specifically in the liver. We analyzed the consequences of this deletion on lipid metabolism in different nutritional conditions. Deletion of AMPK in the liver does not affect hepatic triglyceride and cholesterol content in fasted or in refed conditions with a high carbohydrate diet. Also, lipogenic genes expression is not altered in the liver of these animals. Moreover, the oxidation of fatty acids is not impaired after 24 hour of fasting. Surprisingly, lacking AMPK specifically in the liver does not aggraving fatty liver, hyperglycemia, or impaired glucose tolerance when the mice are on high fat diet condition. However, the activation of AMPK in vivo with a direct activator, A-769662, normalizes hepatic steatosis in lipodystrophyc aP2-SREBP-1c mice and in obese mice placed on high-fat diet. This effect is AMPK dependent because it is completely abolished in mice lacking AMPK specifically in liver. In primary mice hepatocytes, AMPK activation by a direct activator (A-769662) or by indirect activators (metformin and AICAR) reduces lipogenesis rates and increases fatty acids oxidation rates. These effects were completely abolished in hepatocytes lacking AMPK, showing the specific action of AMPK on lipid metabolism in response to these compounds. These results obtained in mice can be extrapolated to humans. Indeed, we have shown that AMPK activation in primary humain hepatocytes inhibits effectively fatty acid and cholesterol synthesis rates. In conclusion, our results showed that inactivation of AMPK in the liver is not a triggering or an aggraving factor in the pathogenesis of hepatic steatosis. Nevertheless, AMPK re-activation has a therapeutic benefit for the treatment of fatty liver disease. Thus, AMPK is a potential target to treat fatty liver disease in human.

Le développement de méthodes in vitro fiables et prédictives représente à l’heure actuelle un véritable défi. En effet, la demande en méthodes alternatives à l’expérimentation animale n’a cessé de croître ces dernières années du fait de la mise en place de législations limitant par considérations éthiques l’utilisation de ces modèles in vivo. De plus, ce besoin a été renforcé par le règlement européen REACH (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals) imposant aux industriels de valider l’innocuité de nombreuses substances déjà commercialisées. Toutefois, les modèles in vitro classiques consistant en la culture simple de cellules en monocouche dans des boîtes de Petri ne permettent pas de conserver les propriétés initiales de ces cellules et de retranscrire les conditions et l’environnement cellulaire des organes in vivo. Le développement de méthodes alternatives in vitro prédictives s’avèrent donc crucial en particulier pour mimer le fonctionnement de deux organes : l’intestin et le foie. En effet, ces deux organes sont largement impliqués dans les processus d’Absorption, Distribution, Métabolisme et Excrétion (ADME) de la plupart des xénobiotiques ingérés. C’est pour ces raisons que nous avons testé la faisabilité de l’une de ces méthodes in vitro alternative permettant d’associer une barrière intestinale à la culture dynamique de cellules hépatiques au sein de microsystèmes dans le cadre de ce doctorat. Cette coculture est effectuée au sein du dispositif appelé IIDMP (Integrated Insert in a Dynamic Microfluidic Platform). Nous avons décidé de tester d’une part l’influence de la culture dynamique et d’autre part d’éventuelles interactions entre les cellules intestinales et hépatiques sur la fonctionnalité et l’activité métabolique de ces deux types cellulaires. Les résultats obtenus durant ce doctorat ont permis d’atteindre 4 objectifs :- Développer un dispositif fiable en termes de fonctionnalité (fluidique, robustesse…).- Mettre en évidence l’innocuité du dispositif lorsque des cellules de lignée et primaires y étaient cultivées.- Démontrer les avantages de l’utilisation de ce dispositif comparativement à l’utilisation de modèles classiques in vitro, en particulier avec des cellules de lignée.- Démontrer que l’utilisation de ce dispositif permettait de mettre en évidence des phénomènes d’interactions entre cellules intestinales et hépatiques notamment sur l’activité du CYP1A2 des hépatocytes qu’ils soient issus d’une lignée ou de cultures primaires. / The development of reliable and predictive in vitro methods is a real challenge. Indeed, the demand for alternative methods to animal experimentation has been growing in recent years due to the introduction of legislation limiting the use of these models in vivo by ethical considerations. Moreover, this need was amplified by regulations such as the European REACH (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals) requiring the safety validation of many substances. However, the conventional in vitro model consisting in a simple cell culture monolayer in Petri dishes does not preserve the initial properties of these cells and does not mimic the conditions of the cellular environment and organs in vivo. The development of alternative in vitro predictive methods is crucial especially to mimic the working of two organs: the intestine and liver. Indeed, these two organs are involved in the process of Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion (ADME) of most xenobiotics ingested.We propose in this thesis to test the feasibility of one of these in vitro alternative methods allowing the association between an intestinal barrier and the dynamic culture of hepatic cells in microsystems in a device called IIDMP (Integrated Dynamic Insert in a Microfluidic Platform). We tested the influence of the flow of culture and possible interactions between intestinal and liver cells on the function and metabolic activity of these two cell types.Then, we demonstrated that : - This device is reliable in terms of global functionality (fluid, robustness ...).- This device did not injury the integrity of the cell line and primary cells.- The use of this device has many advantages when compared with the use of conventional in vitro models, especially with cells line.- The use of this device highlights phenomena of interaction between hepatic and intestinal cells as an increase of the CYP1A2 activity of HepG2 C3A and human primary hepatocytes.

(Oberflächen-) Gewässer weltweit sind mit geringen Mengen (ng/L bis wenige µg/L) humaner Pharmazeutika belastet. Diclofenac (DCF; nicht-steroidal, entzündungshemmend) und Metoprolol (MTP; ß-Blocker) gehören entsprechend ihres hohen Verbrauchs zu den am häufigsten gefundenen Substanzen. Deren biologische Aktivität ist nicht auf den Menschen beschränkt. Gut konservierte Enzyme innerhalb der Vertebraten legen Auswirkungen auf Nicht-Zielorganismen wie Fische nahe, die bisher in Langzeituntersuchungen mit umweltrelevanten Konzentrationen unzureichend untersucht wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die physiologischen Effekte von DCF und MTP auf die Nil-Tilapie (Oreochromis niloticus), einem der wichtigsten Aquakulturfische weltweit, untersucht. In vitro konnte anhand primärer Hepatozyten gezeigt werden, dass bereits umweltrelevante Konzentrationen von DCF zu einer erhöhten Genexpression verschiedener Schlüsselenzyme der Detoxifizierung führten. Nach MTP-Exposition waren die Veränderungen weniger eindeutig. Beide Substanzen induzierten die Vitellogenin Genexpression, nur DCF jedoch bereits in umweltrelevanter Konzentration. In vivo wurden in zwei Langzeit-Expositionsversuchen die physiologischen Effekte vom befruchteten Ei bis 80 Tage nach Schlupf in O. niloticus untersucht. Beide Substanzen hatte keinen Einfluss auf Schlupferfolg und Überleben, das Wachstum war nach 80 Tagen nach Schlupf leicht reduziert. Die deutlichsten Auswirkungen waren histopathologische Veränderungen der Kiemen, veränderte Genexpressionen der Gonadotropine und eine erhöhte Expression von Vitellogenin. Die Ergebnisse legen eine stärkere östrogene Aktivität von DCF im Vergleich zu MTP nahe. Zusammenfassend sind die Bedenken gegenüber den Einzelsubstanzen eher gering, negative Auswirkungen auf die Reproduktion und sich verstärkende Effekte bei zeitgleicher Exposition gegenüber DCF und MTP lassen sich jedoch nicht ausschließen und sollten im Weiteren untersucht werden. / Surface waters worldwide are contaminated with low levels (ng/L up to few µg/L) of human pharmaceuticals. Diclofenac (DCF; non-steroidal, anti-inflammatory) and metoprolol (MTP; ß-blocker) are highly consumed and therefore commonly detected. Their biological activity is not restricted to humans. Well conserved enzymes within the vertebrates suggest effects on non-target organisms such as fish, poorly studied in long-term exposure experiments using environmentally relevant concentrations. In the presented work, physiological effects of DCF and MTP on the Nile tilapia (Oreochromis niloticus), an important aquaculture fish species, were studied. Using primary hepatocytes, it was shown in vitro that environmentally relevant concentrations of DCF increased the gene expression of different key enzymes of the detoxification, while MTP exposure had a less clear effect. Both substances induced vitellogenin gene expression, but only after DCF exposure this was significantly elevated already at the environmentally relevant concentration. In vivo, two long-term exposure studies on the physiological effects from the fertilized egg until 80 days post-hatch were evaluated. Both substances did not affect hatching success and survival, while growth was slightly reduced after 80 days post-hatch. Histopathological alterations of the gills, changed gene expression patterns of the gonadotropins and induced vitellogenin gene expression were the most dominant findings. The results indicate a stronger estrogenic mode of action of DCF compared to MTP. Overall, the risk due to a single substance exposure seems to be relatively low but adverse effects on reproduction and additive effects during simultaneous exposure to DCF and MTP cannot be excluded and should be investigated further.