Cancer is essentially a genetic disease of uncontrolled cell survival and proliferation. Medical therapy has traditionally involved chemotherapy and radiation which inhibit the replication of actively dividing cells in a fairly non-selective manner. Research into the molecular pathogenesis of cancer has enabled the recent development of therapy targeted to receptors or signaling pathways crucial to the development and progression of specific cancers and revealed molecular markers that can be used to predict prognosis and treatment response. The work presented in this thesis examines the expression of two potential molecular markers of malignancy, the R1alpha regulatory subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase A (PRKAR1A) and insulin-like growth factor 2 (IGF2) retrospectively in a population of canine osteosarcoma patients. Furthermore, it describes the derivation and preliminary characterization of canine osteosarcoma primary cell cultures and the use of these cells to assess the effects of PRKAR1A expression on sensitivity to chemotherapeutic drug treatment in vitro. Post-chemotherapy overall survival was significantly longer in canine osteosarcoma patients with tumours expressing low levels of PRKAR1A, and PRKAR1A expression did not correlate with mitotic index. IGF2 expression was generally high in the small numbers of cases examined, did not differ between axial and appendicular sites and did not correlate with either mitotic index or survival. PRKAR1A expression varied between cell cultures, but did not appear to be related to expression levels of phosphorylated cAMP response element-binding (phospho- CREB), a downstream target of cyclic AMP (cAMP)-dependent protein kinase A (PKA). In vitro chemosensitivity did not correlate with PRKAR1A expression, but faster growing cells with shorter doubling times and higher rates of BrdU incorporation tended to be more chemosensitive. In summary, this work identifies an association between low tumour PRKAR1A expression and prolonged post-chemotherapy survival in dogs with osteosarcoma and provides preliminary evidence suggesting that this survival advantage may not be associated with downstream phosphorylation of CREB or sensitivity of the tumour cells to chemotherapeutic agents.

L’acrodysostose est une chondrodysplasie associant une petite taille et des anomalies des extrémités et de la face. Les mécanismes moléculaires sous-jacents ont récemment été identifiés, et deux types d’acrodysostose sont individualisés : 1) l’acrodysostose avec résistance hormonale (acroR1a), en lien avec des mutations du gène PRKAR1A, codant pour une sous-unité régulatrice de la PKA et 2) l’acrodysostose « sans » résistance hormonale (acroPDE), en lien avec des mutations du gène PDE4D, codant pour la phosphodiestérase 4D. Dans les deux cas, il existe une altération de la voie de signalisation de l’AMPc entraînant une résistance au PTHrp à l’origine du phénotype osseux des patients, similaire à celui observé dans la PHP 1a due à des mutations inactivatrices du gène GNAS, codant pour la protéine Gsα. Je me suis intéressée dans ce travail aux mécanismes cellulaires à l’origine du phénotype de l’acroPDE et pouvant expliquer ses différences phénotypiques avec l’acroR1a et la PHP1a. Ces trois pathologies offrent un outil précieux pour l’étude de la voie de signalisation des RCPG puisqu’elles sont toutes dues à un défaut génétique altérant cette voie, mais s’exprimant cliniquement de façon différente bien que proche, notamment en ce qui concerne les résistances hormonales autres que celle du PTHrp dans les chondrocytes. Dans la première partie, afin de mettre en évidence une spécificité tissulaire pouvant expliquer les différences d’expression phénotypique de ces mutations, j’ai utilisé deux modèles cellulaires humains, des fibroblastes et la lignée HEK293, et observé les effets de l’inhibition sélective de la PDE4 par du rolipram à différentes étapes de la voie de signalisation, après stimulation par deux agonistes, la PTH et la PGE2. Les résultats indiquent que l’impact du rolipram est d’autant plus important que la stimulation par l’agoniste est faible. La modulation du signal par la PDE4 dépend donc à la fois du type cellulaire et de l’intensité initiale du stimulus par l’agoniste. Dans la seconde partie, pour comparer plus directement l’effet des mutations de ces trois gènes au niveau cellulaire, j’ai réalisé une étude détaillée du phénotype des fibroblastes de témoins et de patients atteints de PHP1a, d’acroR1a et d’acroPDE, à différentes étapes de la voie de signalisation, après stimulation par la PTH et la PGE2, et en présence ou non d’inhibiteur des PDE. Il n’existe pas de différence significative dans l’expression des transcrits ou la traduction des protéines impliquées dans la voie de signalisation dans les différents groupes de fibroblastes. En revanche, l’effet de l’inhibition des PDE4 sur la quantité d’AMPc intracellulaire est plus important dans les fibroblastes mutés PDE4D, allant dans le sens de mutations activatrices. Nous n’avons pas pu mettre en évidence de différence significative dans la phosphorylation de CREB dans ce modèle. Et enfin, dans la 3ème partie, je présente la mise au point d’une technique de BRET permettant l’étude fonctionnelle des différentes mutations de PDE4D connues pour être responsables d’acroPDE. Les résultats sont en faveur d’un caractère activateur des mutations de PDE4D à l’origine d’une dégradation plus rapide d’AMPc aboutissant à une diminution de l’activité PKA. En conclusion, ces résultats concordent à montrer que les mutations de PDE4D sont activatrices, augmentant ainsi la dégradation de l’AMPc ce qui serait à l’origine des résistances hormonales. Ce phénomène est d’autant plus important dans les situations où l’augmentation d’AMPc est modeste, expliquant probablement l’absence de résistance hormonale dans certains tissus. Bien sûr, ces résultats sont à pondérer par le fait qu’il existe de nombreuses autres phosphodiestérases pouvant compenser ces phénomènes, qu’il existe une troisième voie d’utilisation de l’AMPc (Epac), et qu’il faudrait poursuivre les investigations notamment en étudiant les phénomènes de compartimentalisation de la cellule pour élucider ces mécanismes. / No abstract

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