CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Lectinas de plantas podem ser definidas como proteÃnas de origem nÃo imune que possuem pelo menos um domÃnio nÃo catalÃtico que se liga reversivelmente de maneira especÃfica a um mono- ou oligossacarÃdeo. A famÃlia das lectinas de leguminosas representa o grupo destas proteÃnas mais bem estudadas, em especial destaque a subtribo Diocleinae, que possui o representante mais bem caracterizado, a ConA. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porÃm o mesmo nÃo ocorre quanto Ãs atividades biolÃgicas e especificidade a carboidratos variados, o que torna importante a investigaÃÃo em nÃveis estruturais e biolÃgicos dos seus diversos membros, dentre eles a Canavalia grandiflora Benth. A lectina de sementes de Canavalia grandiflora (ConGr) foi purificada de acordo com Ceccato (2001) e foi cristalizada pelo mÃtodo de difusÃo de vapor a 293 K. Cristais foram obtidos em uma condiÃÃo contendo 0,5 M de sulfato de cÃdmio hidratado, 0,1 M de HEPES pH 7.5 e 1,0 M de acetato de sÃdio triidratado. Os cristais apresentam o grupo espacial ortorrÃmbico I222, a cela unitÃria tem como dimensÃes a=67,70 Ã, b=55,90à e c=107,46 à e Ãngulos ?=?=?=90Â, sendo observado um monÃmero na unidade assimÃtrica e um conteÃdo de 42,53% de solvente no cristal. A estrutura foi resolvida a 2,19à e o problema de fase foi solucionado pelo mÃtodo de substituiÃÃo molecular utilizando as coordenadas da Canavalia gladiata como modelo (PDB: 2D7F). O refinamento satisfatÃrio apresentou âRfactorâ e âRfreeâ com 22,6 e 27,4 respectivamente e apenas um resÃduo de aminoÃcido em regiÃo nÃo permitida do Ramachandran. Apesar da alta similaridade estrutural, pequenas mudanÃas na orientaÃÃo de aminoÃcidos chaves, podem ser responsÃveis pela diversidade nos resultado de aplicaÃÃes biolÃgicas como os resÃduos do sÃtio de ligaÃÃo a carboidrato, que apesar de conservados possuem modificaÃÃes na orientaÃÃo espacial. A seqÃÃncia primÃria da lectina de C. grandiflora apresenta grande similaridade com lectinas do mesmo gÃnero, porÃm ela concentra o maior nÃmero de mutaÃÃes representativas do gÃnero Dioclea, caracterizando-o como o subgÃnero de Canavalia mais prÃximo de Dioclea, e dentre as canavalias à a mais primitiva. A ConGr apresentou atividade edamatogÃnica em modelo de edema de pata (s.c.) e efeito relaxante em mÃsculo liso de aortas de ratos endotelizadas, porÃm os efeitos mostram-se fracos frente a outras lectinas de Diocleinae. / Plant Lectins can be defined as non-immune origin proteins having at least one non-catalytic domain that binds reversibly in a specific fashion to a mono-or oligosaccharide. The legume lectin family group represents the best studied of these proteins, in particular highlighted the subtribe Diocleinae, which has the best characterized representative, ConA. Lectins Diocleinae show a high degree of structural similarity, but the same does not regarding biological activities and specificity to different carbohydrates, which makes it important to research in structural and biological levels of its various members, among them the Canavalia grandiflora Benth. The lectin from Canavalia grandiflora (Congr) was purified according to Ceccato (2001) and was crystallized by vapor diffusion method at 293 K. Crystals were obtained in a state containing 0.5 M of cadmium sulfate hydrate, 0.1 M HEPES pH 7.5 and 1.0 M sodium acetate trihydrate. The crystals have the orthorhombic space group I222, the unit cell has the dimensions a = 67.70 Ã, b = 55.90 à and c = 107.46 à and angles? =? =? = 90 Â, giving a monomer in the asymmetric unit and a content of 42.53% solvent in the crystal. The structure was solved to 2.19 à and phase problem was solved by the method of molecular replacement using the coordinates of Canavalia gladiata as a template (PDB: 2D7F). The refinement showed satisfactory "rfactor" and "Rfree" with 22.6 and 27.4 respectively and only one amino acid residue in a region of the Ramachandran disallowed. Despite the high structural similarity, small changes in the direction of key amino acids may be responsible for the diversity in the biological applications as a result of the residues of the carbohydrate binding site which are retained despite changes in spatial orientation. The primary sequence of the lectin from C. grandiflora has great similarity with lectins of the same genus, but it has the largest number of mutations representative of the genus Dioclea, characterizing it as the subgenus Canavalia nearest Dioclea and canavalias is among the most primitive. The Congregation edamatogÃnica showed activity in a model of paw edema (sc) and relaxing effect on smooth muscle of rat aorta endothelial, but the effects appear to be weak compared to other lectins Diocleinae.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / As sementes de Bauhinia bauhinioides Mart, uma espÃcie pertencente à FamÃlia Leguminosae, SubfamÃlia Caesalpinoideae, Tribo Cercideae, possuem uma lectina Galactose/Lactose especÃfica, que aglutina eritrÃcitos de coelho e humanos nativos ou tratados com enzimas proteolÃticas. A lectina de sementes de B. bauhinioides foi purificada por precipitaÃÃo com sulfato de amÃnio seguida por cromatografias de trocas iÃnica em DEAE-Sephacel e em HiTrap SP, essa Ãltima acoplada a HPLC. Esse procedimento resultou na lectina purificada, nomeada BBL. O processo de purificaÃÃo da BBL foi monitorado por SDS-PAGE e observou-se que a lectina purificada à caracterizada por um perfil eletroforÃtico composto por uma banda Ãnica, com massa molecular aparente de aproximadamente 31 kDa, tanto na presenÃa quanto na ausÃncia de um agente redutor. A anÃlise por espectrometria de massas indicou que BBL possui massa molecular de 28310 Da e, por cromatografia de exclusÃo molecular, observou-se que a lectina, na sua forma nativa, parece assumir uma estrutura tetramÃrica. A lectina de sementes de B. bauhinioides nÃo à uma glicoproteÃna e demonstra elevada estabilidade, sendo capaz de manter sua atividade hemaglutinante em uma ampla faixa de pH, apÃs exposiÃÃo a temperaturas de atà 60 C por 1 hora e apÃs diÃlise contra EDTA. BBL foi testada quanto a atividade prÃ-inflamatÃria utilizando o modelo de edema de pata em ratos, tendo sido observada uma induÃÃo significativa de edema nos animais tratados com BBL na dose de 1,0 mg/kg sendo esta atividade prÃ-inflamatÃria inibida pela incubaÃÃo prÃvia da lectina com 0,1 M de D-galactose. Foi avaliado tambÃm o efeito prÃ-inflamatÃrio da BBL em presenÃa de bloqueadores farmacolÃgicos de dois importantes mediadores inflamatÃrios e observou-se que o L-NAME, um inibidor nÃo-seletivo da enzima Ãxido NÃtrico Sintase, inibiu significativamente o edema causado pela lectina, sugerindo que a atividade prÃ-inflamatÃria causada por BBL envolve a participaÃÃo do oxido nÃtrico. Esses resultados reforÃam a idÃia da utilizaÃÃo de lectinas vegetais como ferramentas biotecnolÃgicas em estudos sobre os mecanismos implicados na resposta inflamatÃria. / A new galactose-specific lectin, named BBL, was purified from seeds of the Caesalpinoideae plant, Bauhinia bauhinioides, by precipitation with solid ammonium sulfate followed by two steps of ion exchange chromatography, and its pro-inflammatory activity was evaluated. The lectin haemagglutinated rabbit and humans erythrocytes (native and treated with proteolytic enzymes), which occurred independent on presence of divalent cations, was stable at 60 ÂC for 60 min, had an optimum pH between pH 8.0 and 9.0 and was inhibited after incubation with D-galactose and its derivatives, especially α-methyl-D-galactopyranoside. The pure protein was found to have a molecular mass of 31 kDa by SDSâPAGE and 28,305 Da by electrospray ionization mass spectrometry. The s.c. injection of BBL induced dose-dependent paw edema at all doses tested, an effect that occurred via carbohydrate site interaction and that was significantly reduced by L-NAME, indicating the important participation of nitric oxide in the late phase of the edema induced by BBL. These findings indicate that this lectin can be used as a tool to better understand the mechanisms involved in inflammatory responses.

BARROSO NETO, Ito Liberato. Resolução da estrutura tridimensional de uma lectina de sementes de Canavalia grandiflora Benth. com efeitos sobre mecanismos inflamatórios. 2010. 103 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2010. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-25T12:16:49Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_ilbarrosoneto.pdf: 2893401 bytes, checksum: 790650a62ad9b6de91f47b92f3115778 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-05T19:29:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_ilbarrosoneto.pdf: 2893401 bytes, checksum: 790650a62ad9b6de91f47b92f3115778 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T19:29:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_ilbarrosoneto.pdf: 2893401 bytes, checksum: 790650a62ad9b6de91f47b92f3115778 (MD5) Previous issue date: 2010 / Plant Lectins can be defined as non-immune origin proteins having at least one non-catalytic domain that binds reversibly in a specific fashion to a mono-or oligosaccharide. The legume lectin family group represents the best studied of these proteins, in particular highlighted the subtribe Diocleinae, which has the best characterized representative, ConA. Lectins Diocleinae show a high degree of structural similarity, but the same does not regarding biological activities and specificity to different carbohydrates, which makes it important to research in structural and biological levels of its various members, among them the Canavalia grandiflora Benth. The lectin from Canavalia grandiflora (Congr) was purified according to Ceccato (2001) and was crystallized by vapor diffusion method at 293 K. Crystals were obtained in a state containing 0.5 M of cadmium sulfate hydrate, 0.1 M HEPES pH 7.5 and 1.0 M sodium acetate trihydrate. The crystals have the orthorhombic space group I222, the unit cell has the dimensions a = 67.70 Å, b = 55.90 Å and c = 107.46 Å and angles? =? =? = 90 °, giving a monomer in the asymmetric unit and a content of 42.53% solvent in the crystal. The structure was solved to 2.19 Å and phase problem was solved by the method of molecular replacement using the coordinates of Canavalia gladiata as a template (PDB: 2D7F). The refinement showed satisfactory "rfactor" and "Rfree" with 22.6 and 27.4 respectively and only one amino acid residue in a region of the Ramachandran disallowed. Despite the high structural similarity, small changes in the direction of key amino acids may be responsible for the diversity in the biological applications as a result of the residues of the carbohydrate binding site which are retained despite changes in spatial orientation. The primary sequence of the lectin from C. grandiflora has great similarity with lectins of the same genus, but it has the largest number of mutations representative of the genus Dioclea, characterizing it as the subgenus Canavalia nearest Dioclea and canavalias is among the most primitive. The Congregation edamatogênica showed activity in a model of paw edema (sc) and relaxing effect on smooth muscle of rat aorta endothelial, but the effects appear to be weak compared to other lectins Diocleinae. / Lectinas de plantas podem ser definidas como proteínas de origem não imune que possuem pelo menos um domínio não catalítico que se liga reversivelmente de maneira específica a um mono- ou oligossacarídeo. A família das lectinas de leguminosas representa o grupo destas proteínas mais bem estudadas, em especial destaque a subtribo Diocleinae, que possui o representante mais bem caracterizado, a ConA. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porém o mesmo não ocorre quanto às atividades biológicas e especificidade a carboidratos variados, o que torna importante a investigação em níveis estruturais e biológicos dos seus diversos membros, dentre eles a Canavalia grandiflora Benth. A lectina de sementes de Canavalia grandiflora (ConGr) foi purificada de acordo com Ceccato (2001) e foi cristalizada pelo método de difusão de vapor a 293 K. Cristais foram obtidos em uma condição contendo 0,5 M de sulfato de cádmio hidratado, 0,1 M de HEPES pH 7.5 e 1,0 M de acetato de sódio triidratado. Os cristais apresentam o grupo espacial ortorrômbico I222, a cela unitária tem como dimensões a=67,70 Å, b=55,90Å e c=107,46 Å e ângulos ?=?=?=90º, sendo observado um monômero na unidade assimétrica e um conteúdo de 42,53% de solvente no cristal. A estrutura foi resolvida a 2,19Å e o problema de fase foi solucionado pelo método de substituição molecular utilizando as coordenadas da Canavalia gladiata como modelo (PDB: 2D7F). O refinamento satisfatório apresentou “Rfactor” e “Rfree” com 22,6 e 27,4 respectivamente e apenas um resíduo de aminoácido em região não permitida do Ramachandran. Apesar da alta similaridade estrutural, pequenas mudanças na orientação de aminoácidos chaves, podem ser responsáveis pela diversidade nos resultado de aplicações biológicas como os resíduos do sítio de ligação a carboidrato, que apesar de conservados possuem modificações na orientação espacial. A seqüência primária da lectina de C. grandiflora apresenta grande similaridade com lectinas do mesmo gênero, porém ela concentra o maior número de mutações representativas do gênero Dioclea, caracterizando-o como o subgênero de Canavalia mais próximo de Dioclea, e dentre as canavalias é a mais primitiva. A ConGr apresentou atividade edamatogênica em modelo de edema de pata (s.c.) e efeito relaxante em músculo liso de aortas de ratos endotelizadas, porém os efeitos mostram-se fracos frente a outras lectinas de Diocleinae.

SILVA, Helton Colares da. Purificação e caracterização parcial de uma lectina pró-inflamatória de sementes de Bauhinia bauhinioides MART. 76 f. : Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Fortaleza-CE, 2010. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-23T12:09:43Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_hcsilva.pdf: 28291568 bytes, checksum: fac7f934eb20708cddd436062f250c54 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-05T18:38:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_hcsilva.pdf: 28291568 bytes, checksum: fac7f934eb20708cddd436062f250c54 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T18:38:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_hcsilva.pdf: 28291568 bytes, checksum: fac7f934eb20708cddd436062f250c54 (MD5) Previous issue date: 2010 / A new galactose-specific lectin, named BBL, was purified from seeds of the Caesalpinoideae plant, Bauhinia bauhinioides, by precipitation with solid ammonium sulfate followed by two steps of ion exchange chromatography, and its pro-inflammatory activity was evaluated. The lectin haemagglutinated rabbit and humans erythrocytes (native and treated with proteolytic enzymes), which occurred independent on presence of divalent cations, was stable at 60 °C for 60 min, had an optimum pH between pH 8.0 and 9.0 and was inhibited after incubation with D-galactose and its derivatives, especially α-methyl-D-galactopyranoside. The pure protein was found to have a molecular mass of 31 kDa by SDS–PAGE and 28,305 Da by electrospray ionization mass spectrometry. The s.c. injection of BBL induced dose-dependent paw edema at all doses tested, an effect that occurred via carbohydrate site interaction and that was significantly reduced by L-NAME, indicating the important participation of nitric oxide in the late phase of the edema induced by BBL. These findings indicate that this lectin can be used as a tool to better understand the mechanisms involved in inflammatory responses. / As sementes de Bauhinia bauhinioides Mart, uma espécie pertencente à Família Leguminosae, Subfamília Caesalpinoideae, Tribo Cercideae, possuem uma lectina Galactose/Lactose específica, que aglutina eritrócitos de coelho e humanos nativos ou tratados com enzimas proteolíticas. A lectina de sementes de B. bauhinioides foi purificada por precipitação com sulfato de amônio seguida por cromatografias de trocas iônica em DEAE-Sephacel e em HiTrap SP, essa última acoplada a HPLC. Esse procedimento resultou na lectina purificada, nomeada BBL. O processo de purificação da BBL foi monitorado por SDS-PAGE e observou-se que a lectina purificada é caracterizada por um perfil eletroforético composto por uma banda única, com massa molecular aparente de aproximadamente 31 kDa, tanto na presença quanto na ausência de um agente redutor. A análise por espectrometria de massas indicou que BBL possui massa molecular de 28310 Da e, por cromatografia de exclusão molecular, observou-se que a lectina, na sua forma nativa, parece assumir uma estrutura tetramérica. A lectina de sementes de B. bauhinioides não é uma glicoproteína e demonstra elevada estabilidade, sendo capaz de manter sua atividade hemaglutinante em uma ampla faixa de pH, após exposição a temperaturas de até 60º C por 1 hora e após diálise contra EDTA. BBL foi testada quanto a atividade pró-inflamatória utilizando o modelo de edema de pata em ratos, tendo sido observada uma indução significativa de edema nos animais tratados com BBL na dose de 1,0 mg/kg sendo esta atividade pró-inflamatória inibida pela incubação prévia da lectina com 0,1 M de D-galactose. Foi avaliado também o efeito pró-inflamatório da BBL em presença de bloqueadores farmacológicos de dois importantes mediadores inflamatórios e observou-se que o L-NAME, um inibidor não-seletivo da enzima Óxido Nítrico Sintase, inibiu significativamente o edema causado pela lectina, sugerindo que a atividade pró-inflamatória causada por BBL envolve a participação do oxido nítrico. Esses resultados reforçam a idéia da utilização de lectinas vegetais como ferramentas biotecnológicas em estudos sobre os mecanismos implicados na resposta inflamatória.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectinas sÃo proteÃnas que possuem no mÃnimo um domÃnio nÃo catalÃtico capaz de se ligar reversivelmente a mono ou oligossacarÃdeos especÃficos. As lectinas sÃo amplamente distribuÃdas em muitas plantas, bem como em animais e outros organismos. Geralmente, as lectinas sÃo muito abundantes em sementes de plantas, especialmente na famÃlia Leguminosae. Centenas de lectinas jà foram isoladas e caracterizadas de plantas pertencentes a diferentes famÃlias dessa divisÃo. A famÃlia das lectinas de leguminosas representa o grupo desta classe proteica mais bem estudada, em especial destaque a subtribo Diocleinae. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porÃm o mesmo nÃo se observa quanto Ãs atividades biolÃgicas. Esta variabilidade reside em detalhes que podem ser analisados em estudos baseados em estruturas. Neste contexto, o presente trabalho descreve a caracterizaÃÃo estrutural parcial e biolÃgica de uma lectina presente em sementes de Dioclea reflexa Hook F., pertencente à famÃlia Leguminosae, subfamÃlia Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Diocleinae. A lectina de sementes de Dioclea reflexa (DrfL) foi purificada em uma Ãnica etapa atravÃs de cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-50. A lectina aglutinou fortemente eritrÃcitos de coelho e foi inibida por D-manose e α-metil-D-manosÃdeo. A atividade hemaglutinante da DrfL à Ãtima nos pH 5,0;6,0 e 7,0, e estÃvel a uma temperatura de 50 ÂC. Semelhante a outras lectinas da subtribo Diocleinae, a anÃlise por espectrometria de massas indicou que a lectina de D. reflexa possui possui trÃs cadeias (α, β e γ) com massas de 25.562, 12.874 e 12.706 Da, respectivamente, e nÃo possui ligaÃÃes dissulfeto ou glicosilaÃÃes. A sequÃncia primÃria da DrfL apresenta grande similaridade com outras lectinas de espÃcies do mesmo gÃnero. A proteÃna foi cristalizada pelo mÃtodo de difusÃo de vapor na presenÃa do ligante X-man e foi resolvida a uma resoluÃÃo de 1,76 Ã. DrfL apresentou efeito relaxante em mÃsculo liso de aortas endotelizadas de rato e apresentou atividade inflamatÃria no modelo de edema de pata de rato. A lectina de D. reflexa exibiu baixa citotoxicidade contra nÃuplios de Artemia sp. / Lectins are proteins that have at least one non-catalytic domain capable of reversibly bind to specific mono-or oligosaccharides. Lectins are widely distributed in many plants as well as animals and other organisms. In general, lectins are very abundant in plant seeds, especially in the Leguminosae family. Hundreds of lectins have been isolated and characterized from plants belonging to different families of this division. The legume lectin family is the group of this protein class further studied, in particular highlighted the subtribe Diocleinae. Lectins Diocleinae have a high degree of structural similarity, but the same was not true about the biological activities. This variability lies in details that can be analyzed in studies based structures. In this context, this paper describes the partial structural and biological characterization of a lectin present in seeds Dioclea reflexa Hook F. belonging to the family Leguminosae, subfamily Papilionoideae, tribe Phaseoleae, subtribe Diocleinae. The seed lectin Dioclea reflexa (DrfL) was purified in a single step by affinity chromatography on Sephadex G-50 column. The lectin strongly agglutinated rabbit erythrocytes and was inhibited by D-mannose and methyl-α-D-manoside. The hemagglutinating activity of the DrfL is optimum pH 5.0, 6.0 and 7.0, stable at a temperature of 50  C. Similar to other lectins of the subtribe Diocleinae, analysis by mass spectrometry indicated that the lectin D. reflex has three chains (α, β and γ) with masses of 25,562; 12,874 and 12,706 Da, respectively, and has no disulfide bonds or glycosylation. The primary sequence of DrfL shows great similarity with other lectins from species of the same genus. The protein was crystallized by vapor diffusion bonding method in the presence of X-man and was determined to a resolution of 1.76 Ã. DrfL presented relaxing effect on smooth muscle and endothelial aortas rat and showed inflammatory activity in the rat paw edema model. The lectin D. reflexa exhibited low cytotoxicity against Artemia sp.