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Caractérisation de nifF une flavodoxine nif-spécifique chez la bactérie photosynthétique Rhodobacter capsulatusGennaro, Giuseppa 12 1900 (has links)
Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Pour le maintien d'une espèce, il est primordial que celle-ci soit capable, à partir des
nutriments présents dans le milieu environnant, d'effecmer la biosynthèse du matériel ceUiilaire
nécessaire à sa survie. Les micro-organismes par exemple, synthétisent les produits organiques
dont ils ont besoin, en uulisant divers processus métaboliques afin de trouver des sources
d'énergie alternatives. Cette diversité est observée chez les baaéries photosynthétiques, qui sont
capables de convertir la lumière en énergie chimique, favorisant ainsi le processus de fixation de
l'azote. Ce processus, qui pennet la biosynthèse de l'azote, est essentiel car l'azote diatomique
limite encore la production agricole. C'est pourquoi il est important de trouver différentes
méthodes permettant d'améliorer le processus de fixation de l'azote.
Afin de perfectionner ce mécanisme biologique, il est nécessaire d'étudier au préalable
les facteurs qui limitent et régulent l'activité de la nitrogénase (N2ase), qui est l'enzyme-clé du
processus de fixation de l'azote. La N2ase est une métalloenzyme sensible à l'oxygène et
constituée de deux composantes qui ont besoin de MgATP2 et nécessite un transporteur
d'électrons à bas potentiel rédox. Le transport d'électrons vers la N2ase a été fermement établi
chez Klebsiella pneumoniae et chez cette bactérie, le transporteur est une flavodoxine spécifique,
NifF. Le mécanisme met en jeu la NifF et une pyruvate flavodoxine oxydoréductase (NifJ), qui
résulte en une décarboxylation du pyruvate en CoA + COz (par NifJ) couplée à une réaction de
reduction de la NifF. Cependant, ce transport d'électrons ne se résume pas seulement au système
NifF/NifJ. En effet, ce système n'est pas utilisé chez tous les diazotrophes. Par exemple, chez
Clostridium pasteurianum, le transport d'électrons implique une ferrédoxme. De plus, certains
micro-organismes peuvent avoir plusieurs types de ferrédoxines ou des ferrédoxines et une
flavodoxine ou encore plusieurs tonnes de flavodoxines. Un exemple est donné par Rhodobacter
capsulatus qui possède de nombreux transporteurs d'électrons à bas potentiel rédox, mais dont
seulement une de type ferrédoxine, est capable d'acheminer des électrons vers la N2ase in vivo.
Le sujet de cette thèse de doctorat est l'identification d'une flavodoxine comme étant
un nouveau transporteur d'électrons à bas potentiel rédox, in vivo pour la N2ase chez Rhadsbacter
capsalatus. Une combinaison d'approches génétiques, biochimiques, physiologiques et d'études de
cinétique de type « stopped-flow », a permis de caractériser ce transporteur. Les études
biochimiques ont identifié celui-ci comme étant une flavodoxine (NifF) à longue chaîne
hautement homologue à des flavodoxines nif-spécifiques. L'observation de la complémentation d'un mutant nifF de Klebsiella pneumoniae et l'obtention de la séquence nucléotidique de ce dernier
ont mis en évidence la présence d'un promoteur de type spécifique. Les études sur la
régulation transcriptionnelle de nifF ont confirmé son implication en tant que transporteur
d'électrons dans le processus de fixation de l'azote. Par contre, il a été démontré que la
transcription du gène de nifF chez Rhodobacter capsalatus est régulée à la fois par le taux
intracellulaire d'azote ammoniacal et de fer, contrairement à la transcription de nifF chez Klebsiella
pneumoniae. De plus, la ferrédoxine (Fdl) semble jouer un rôle dans la régulation
transcriptionnelle de nifF, mais le mécanisme d'action reste encore à déterminer. Enfin, les
études de cinétiques de type « stopped-flow » permettent d'affirmer que NifF peut remplacer
Fdl (le transporteur d'électrons pour la N2ase chez Rhodobacter capsalatus in vivo) comme
transporteur d'électrons vers la N2ase. En effet, NifF présente non seulement une interaction
spécifique avec la FeP, mais cette interaction est plus forte que celle entre FdJ et FeP. Donc,
même si NifF est présente en quantité intracelullaire plus faible que Fdl, elle contribue de façon
importante au taux de fixation de l'azote de par sa grande réactivité avec la FeP.
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Imagerie dynamique des processus métaboliques transitoires à l'aide de la tomographie d'émission par positrons (TEP) animale dans l'évaluation de photosensibilisateurs pour la thérapie photodynamique du cancer (TPD)Bérard, Véronique January 2006 (has links)
La tomographie d'émission par positrons (TEP) est un outil d'imagerie moléculaire puissant et non invasif permettant d'étudier in vivo des processus physiologiques et moléculaires, tant au niveau cardiaque, cérébral qu'oncologique. En oncologie clinique, la TEP est surtout utilisée pour détecter des tumeurs cancéreuses et évaluer leur réponse à diverses thérapies. Au niveau de la recherche pré-clinique en oncologie, cette modalité d'imagerie moléculaire prometteuse est portée à jouer un rôle important dans le développement de nouveaux protocoles de traitement. Le radiotraceur le plus utilisé pour évaluer le métabolisme tumoral du glucose est le 2-deoxy-2-[[indice supérieur 18]F]-fluoro-D-glucose ([[indice supérieur 18]F]-FDG). La thérapie photodynamique (TPD) est de plus en plus employée dans le traitement de certains cancers.La TPD nécessite la présence combinée de photosensibilisateurs (PS) localisés dans les tumeurs, de lumière à une longueur d'onde appropriée et d'oxygène moléculaire afin d'induire des dommages oxydatifs aux tissus tumoraux.La thérapie photodynamique peut amener une régression tumorale selon deux mécanismes d'action différents. Elle peut engendrer la mort des cellules tumorales directement, alors qu'elle peut aussi endommager la vascularisation de la tumeur amenant une mort indirecte des cellules malignes.La contribution relative de ces deux principaux mécanismes d'action sur la réponse tumorale dépend de la distribution du photosensibilisateur au niveau des compartiments cellulaires ou vasculaires de la tumeur qui à son tour, dépend de la nature chimique de celui-ci. Les PS amphiphiles, comme la phtalocyanine ZnPcS[indice inférieur 2], sont préférentiellement transportés par des lipoprotéines qui pénètrent directement dans les cellules tumorales, alors que les PS hydrophiles tels que la phtalocyanine AlPcS[indice inférieur 4] sont principalement transportés par la protéine albumine et sont déposés dans le stroma vasculaire de la tumeur. Il s'ensuit que la TPD faite avec le ZnPCS[indice inférieur 2] induit plutôt une mort cellulaire directe, alors que l'emploi du AlPcS[indice inférieur 4] affectera en premier lieu le système vasculaire de la tumeur amenant une mort cellulaire indirecte par la suite. Étant donné que l'application de la thérapie photodynamique occasionne très rapidement des effets au niveau des tumeurs traitées, la tomographie d'émission par positrons pourrait certes être un outil idéal pour étudier les réponses biochimiques et physiologiques au niveau des tumeurs tôt suite à ce traitement. L'imagerie TEP avec le [[indice supérieur 18]F]-FDG s'est effectivement avérée être une méthode prometteuse dans l'étude des effets de la thérapie photodynamique du cancer in vivo, soit dans l'évaluation de l'efficacité d'un photosensibilisateur ou dans la détermination de son mécanisme d'action. Des travaux antérieurs en ont montré le potentiel en procédant à des scans à différents temps après la TPD pour mesurer la captation tumorale du [[indice supérieur 18]F]-FDG, injecté sous forme de bolus. Toutefois, cette approche conventionnelle ne donne pas d'informations sur les processus biologiques transitoires impliqués dans la destruction des cellules tumorales, c'est-à-dire les processus survenant durant et immédiatement après l'illumination. Ce mémoire illustre donc une nouvelle approche utilisant l'imagerie TEP, avec infusion continue du radiotraceur [[indice supérieur 18]F]-FDG, pour l'évaluation en temps réel de la réponse tumorale à la TPD chez le rat. De façon plus spécifique, le mécanisme d'action de différents photosensibilisateurs sera investigué en fonction des processus métaboliques transitoires observés durant et immédiatement après l'illumination. De plus, afin de mieux comprendre les processus physiologiques impliqués dans l'avènement de certains changements métaboliques, des études TEP en temps réel évaluant le flot sanguin tumoral durant la TPD ont aussi été amorcées avec les radiotraceurs [[indice supérieur 13]N]-NH[indice inférieur 3] et [[indice supérieur 64]Cu]-PTSM. En somme, nous avons réussi à démontrer la faisabilité d'utiliser l'imagerie TEP en temps réel avec des infusions continues de [[indice supérieur 18]F]-FDG afin d'étudier la réponse métabolique tumorale durant la thérapie photodynamique chez un modèle de rongeur. Cette méthode s'est avérée très pertinente dans l'étude des changements métaboliques transitoires survenant au niveau tumoral et systémique pendant et tout de suite après la TPD, particulièrement pour la caractérisation des mécanismes d'action de différents photosensibilisateurs. En effet, l'observation de différences significatives au niveau des profils de captation du [[indice supérieur 18]F]-FDG procure une façon rapide de distinguer entre un mécanisme de destruction directe ou indirecte des cellules tumorales et ce, en temps réel. En plus de visualiser la réponse métabolique tumorale à la thérapie photodynamique, cette procédure d'imagerie TEP en temps réel pourrait aussi être appliquée à l'étude des changements du flot sanguin tumoral pendant la TPD, ainsi qu'à l'étude de mécanismes de réponse spécifiques tels que les processus apoptotiques.
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