Protéines difficiles à exprimer: un goulot d'étranglement pour la plupart des biologistes. J'ai choisi d'utiliser comme modèle d’étude Acanthamoeba polyphaga Mimivirus. Ce virus géant à ADN possède des protéines subissant des modifications post-traductionnelles, des structures multi-protéiques ou encore des voies enzymatiques jamais identifiées auparavant dans un virus, ce qui en font un modèle idéal pour l’étude de protéines récalcitrantes. Le but ultime de cette thèse, était de produire les protéines de capsides de Mimivirus. Le rôle de la protéine de capside dans l’assemblage de la particule virale, son infectivité et ses caractéristiques moléculaires sont d’une grande importance. Pour aller du gène à la protéine, J’ai participé à la compréhension de ce qui gouverne la terminaison de la transcription de Mimivirus et également participé à l'analyse globale du transcriptome au cours du cycle d'infection des amibes par Mimivirus. Nous avons montré que les transcrits de Mimivirus sont systématiquement polyadénylés dans des régions formant une structure secondaire en tige-boucle, même s’il n’existe pas de signal de polyadénylation canonique en amont. Nous en avons conclu que la polyadénylation de Mimivirus suit exclusivement une règle «épingle à cheveux». De plus, l’étude du transcriptome a révélé 3 phases temporelles distinctes dans le cycle infectieux: précoce, intermédiaire et tardive. Les transcrits de capsides sont tous exprimés durant la phase tardive mais leur profil d’expression ne sont pas superposables dans le temps. Les données de transcriptomique ont révélées la présence de plusieurs glycosyltransférases chez Mimivirus, dans la phase tardive du cycle, concomitant avec la production de la protéine de capside. Les informations recueillies sur l'expression des gènes à différents temps post-infection ont contribué à la conception de protocoles pour la production des protéines de capsides (la protéine majeure de capside (MCP) et ses paralogues) dans de systèmes eucaryote. / Difficult to express proteins: a bottleneck for most biologists. I have chosen to use Acanthamoeba polyphaga Mimivirus as my study model. This giant dsDNA virus possesses post-translationally modified proteins, multi-protein structures and enzyme pathways never before seen in a virus, which makes it ideal for refractory studies. The ultimate goal of my thesis was to produce the capsid proteins of Mimivirus. The role of the capsid protein in the assembly of the viral particle, its infectivity, and molecular features are of great importance. To go from gene to protein, I participated in the comprehension of what governs the post-transcriptional termination in Mimivirus and equally participated in the global analysis of the transcriptome during the infectious cycle of Acanthamoeba by Mimivirus. We have shown that the Mimivirus transcripts are systematically polyadenylated in the regions forming a stem-loop secondary structure; even when a canonical poyadenylation signal is absent We concluded that Mimivirus polyadenylation obeys a strict “Hairpin rule”. Moreover, the transcriptomic study revealed three distinct temporal phases: early, intermediate and late. The capsid transcripts are all expressed during the late phase but their expression profiles are not superimposable. The transcriptomic data also revealed the presence of several Mimivirus glycosyltransferases in the late temporal phase, concomitant with the capsid proteins. The expression data gathered throughout my thesis has contributed to the rational design of a protein production experiment to produce the major capsid protein and its three paralogs in eukaryotic systems.

Le déclin de la production de pétrole, lié avec la diminution des matières premières carbonées pour la synthèse chimique ont mené les scientifiques à chercher de nouvelles sources de carbone pour l'industrie chimique. L'utilisation du dioxyde de carbone aiderait à réduire les émissions de gaz à effet de serre tout en fournissant une matière première renouvelable à base de bloc moléculaire en C1. En renversant les équilibres biologiques de trois déshydrogénases, nous avons effectué la biosynthèse multienzymatique en cascade du méthanol à partir de CO2 en utilisant la formiate déshydrogénase de Candida boidinii, la formaldéhyde déshydrogénase de Pseudomonas putida et l'alcool déshydrogénase de Saccacharomyces cerevisiae. Nous avons optimisé le système en ajustant les conditions catalytiques et la quantité relative de chaque déshydrogénase. La phosphite déshydrogénase de Pseudomonas stutzeri a été également choisi comme système de régénération du cofacteur nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH) parmi 4 systèmes de régénération étudiés. L'ensemble du système a été encapsulé dans des nanocapsules poreuses de silice qui a permis d'augmenter 15 fois les productivités en méthanol. Nous avons montré que les dernières limitations rencontrées, comme la disponibilité du CO2 et l'accumulation du méthanol, peuvent être dépassées en mettant en place un système catalytique en flux continu en phase gaz. / The decline of oil production, linked with the decrease of carbon feedstock for chemical synthesis leads scientist to find new sources of carbon for the chemical industry. Use of carbon dioxide would help to reduce the greenhouse gas emissions while providing a renewable feedstock of C1 molecular building blocks. By reversing the biological metabolic reaction pathway of three dehydrogenase, we carried out multistep multienzyme biosynthesis of methanol from CO2 using formate dehydrogenase from Candida Boidinii, formaldehyde dehydrogenase from Pseudomonas Putida and alcohol dehydrogenase from Saccacharomyces cerevisiae. We improved the system active by adjusting the catalytic conditions and the relative quantity of each dehydrogenase. Phosphite dehydrogenase from Pseudomonas stutzeri was also chosen among 4 different studied systems to be introduced into the catalysis as a cofactor regenerating system for reduced nicotinamide adenine dinucleotide. The enzymatic system was then immobilized by encapsulation into novel phospholipid templated silica nanocapsules, allowing an increase of the methanol productivity by a factor 15. We show that the last limitation of the process as substrate availability and product accumulation can be overcome by running continuous enzymatic flow conversion in a gas phase.