Cette thèse s’inscrit dans le cadre du projet CRB-Anim (Centre de Ressources Biologiques d’Animaux Domestiques) dont le but est de constituer une cryobanque nationale et d’améliorer les techniques de cryoconservation. Aujourd’hui, les ressources biologiques de type reproductif (embryons, sperme, ovocytes) et de type somatique (fibroblastes et cellules souches pluripotentes) sont conservées dans des milieux contenant des produits d’origine animale (POA). L’utilisation actuelle des POA (sérums, lait, jaune d’œuf) pose des problématiques sanitaires (risque de contamination) et scientifiques (manque de reproductibilité liée à la variabilité de composition des POA). Cette étude a pour objectif d’évaluer l’effet d’un milieu de préservation synthétique, chimiquement défini, breveté pour la congélation de cellules de sang de cordon (STEMALPHA.CRYO3) sur la cryoconservation de sperme ovin et bovin, et de cellules souches pluripotentes de lapin. Pour cela, une approche biologique (étude in vitro et in vivo sur le terrain), alliée à une approche physique (étude des cinétiques de refroidissement et caractérisation des propriétés thermodynamiques des milieux de congélation) ont été mis en place.Nos résultats montrent l’intérêt de l’utilisation du STEMALPHA.CRYO3, en tant que substituant aux sérums, dans les solutions de cryoconservation des cellules souches pluripotentes. Néanmoins, notre étude indique que ce produit n’est pas efficace pour protéger le sperme lors de la congélation. Cette thèse confirme l’intérêt de standardiser les procédures de cryoconservation afin d’assurer la qualité des ressources biologiques pour les cryobanques et les échanges internationaux / Nowadays, reproductive (embryos, sperm, oocytes) and somatic (fibroblasts and pluripotent stem cells) resources are cryopreserved in media containing animal-derived products (serum, egg yolk, milk). Using these products raises sanitary (risk of contamination) as well as scientific concerns (reproducibility limits due to the variability of their composition). This study aims to replace animal derived-product in assessing the effect of a synthetic and chemically defined medium, STEMALPHA.CRY03® (Stem Alpha, France), on the cryopreservation of ovine and bovine sperm, and on rabbit pluripotent stem cells. First, a physical approach permitted to study the cooling rates and the characterization of thermodynamic properties of the freezing media. The differential scanning calorimetry allowed us to define their phase transition temperatures (crystallization temperature, melting temperature and enthalpy variation of crystallization, proportional to the amount of crystallized ice). Second, a biological approach was used for the cryopreservation of bovine and ovine sperm, as well as rabbit pluripotent stem cells. Flow cytometry and computer- assisted sperm analyses showed that STEMALPHA.CRY03® impaired bovine sperm, compared to a medium containing animal derived-product. These last results were confirmed in ovine species. Nevertheless, artificial insemination by laparoscopy (n = 270 ewes) counteracts this impairment and allowed an average pregnancy rate of 70 %. Moreover, without any additive in the freezing medium, a similar pregnancy rate was obtained. The study of pluripotent gene expression profile, and analyses of viability and growth rates for the cryopreservation of rabbit pluripotent stem cells confirmed that synthetic media, STEMALPHA.CRY03® (with 4, 5 or 10 % of cryoprotectant) and CryoStor® CS10 (containing 10 % of cryoprotectant) were more efficient than serum-based media. We demonstrate that it is possible to cryopreserve sperm cells and pluripotent stem cells in synthetic and chemically defined media. 0ur results confirmed the interest of a standardized approach for cryopreservation procedures of genetic resources in mammals. This work meets the needs of cryobanking activities (quality policy) and of the regulation development within the framework of international trade

Les milieux de cryopréservation d'embryons contiennent généralement des produits d'origine animale, qui présentent des inconvénients majeurs : une composition variable et insuffisamment définie, et un risque de transmission d'agents pathogènes. La substitution de ces produits par des composés synthétiques chimiquement définis pourrait contribuer à l’amélioration des procédures de cryopréservation d’embryons, en réduisant la variabilité de composition des milieux, et le risque de contamination des ressources conservées.L’objectif de ce travail était d’évaluer l’effet du remplacement de l’albumine sérique bovine utilisée dans les milieux de congélation lente ou de vitrification d’embryons cunicoles et ovins par un milieu synthétique formulé à base d’acide hyaluronique (STEM ALPHA.Cryo3 – « CRYO3 »). Dans un premier temps, les propriétés thermodynamiques des substituts potentiels ont été évaluées à l’aide de la calorimétrie différentielle à balayage. Parallèlement, nous avons optimisé les différents outils expérimentaux dont nous avions besoin pour cette étude. Nous avons adapté un protocole d’évaluation de l'activité mitochondriale (JC-1) pour complémenter l'évaluation morphologique in vitro des embryons de lapin, et nous avons évalué l’efficacité de différents protocoles de superovulation sur la production d’embryons chez la brebis. Dans un second temps, nous avons procédé à la substitution de l’albumine sérique bovine (BSA) utilisée dans des milieux de congélation lente et de vitrification d’embryons cunicoles et ovins par du CRYO3. Une approche in vitro a été utilisée pour les protocoles de congélation et de vitrification, puis complétée par une approche in vivo pour les protocoles de vitrification.Nos résultats confirment que la BSA peut être efficacement remplacée par le CRYO3 dans des protocoles de cryoconservation d‘embryons de lapin et d’embryons ovins, qu’il s’agisse de congélation lente ou de vitrification / Embryo cryopreservation media usually contain animal-derived products, such as bovine serum albumin (BSA). These products present two major disadvantages: an undefined variable composition and a risk of pathogen transmission. The substitution of animal products of embryo cryopreservation media by synthetical products may improve procedure standardization (by avoiding variability in media composition) and avoid sanitary concerns inherent to animal-derived products.We aimed to evaluate the effect of replacing BSA in rabbit and ovine embryo slow freezing and vitrification media with a synthetic animal products free medium composed of synthetic hyaluronic acid: STEM ALPHA.Cryo3 (« CRYO3 »).During the first part, we evaluated the substitution candidates through a thermodynamic approach, using differential scanning calorimetry. In paralel, we adapted a mitochondrial activity evaluation protocol (JC-1) to rabbit embryo, which allowed us to complement morphological in vitro evaluation, and evaluated ewe superovulation protocols.During the second part, we used a biological approach to evaluate the replacement of BSA with synthetical products (containing CRYO3) in rabbit and ovine embryo slow freezing and vitrification media, using in vitro (slow freezing and vitrification) and in vivo (vitrification) evaluation methods.Our results seem to demonstrate that the chemically defined substitute CRYO3 can successfully replace BSA during rabbit embryo and ovine embryo cryopreservation (slow-freezing and vitrification)

Plusieurs composés présents dans les solutions de cryoconservation pour embryons sontsource de préoccupations : soit du point de vue sanitaire à cause de leur origine animale, soitdu fait de leur rôle potentiellement mutagène, notamment pour certains cryoprotecteurspénétrants. Leur retrait ou leur substitution par des composés chimiquement définis pourraitdonc constituer une amélioration sensible des techniques de cryoconservation des embryons.C’est dans ce cadre de réflexion que s’inscrit notre travail.Souvent, la conception et la mise en oeuvre des protocoles de cryoconservation sontempiriques. Il en résulte de nombreuses variations entre les études qui rendent lacomparaison des résultats obtenus d’autant plus difficile. Dans notre démarche, deuxapproches complémentaires ont été associées :•La première, physique, s’appuie sur l’utilisation de la calorimétrie différentielle à balayage(DSC) pour standardiser la comparaison des différentes solutions de congélation lente.Ainsi, les propriétés thermodynamiques de solutions contenant un substituant défini ontété caractérisées et comparées à celles de solutions contenant des produits de référence(sérum de veau foetal ou albumine bovine sérique) ;• La seconde, biologique, a consisté à congeler des embryons de lapins produits in vivo etdes embryons bovins produits in vitro, puis à analyser les taux de survie après culture invitro et/ou transferts. Cette approche a permis d’objectiver les propriétés biologiques dessolutions ainsi définies.Nos résultats confirment qu’il est judicieux d’utiliser une approche thermodynamiquepour sélectionner des molécules chimiquement différentes des composés habituellementutilisés. / Several compounds in embryo cryopreservation solutions are a source of concern:products of animal origin because of the sanitary risks, and the permeating cryoprotectantsbecause of their potential mutagenic effect. Removing or substituting these compounds withchemically defined products might improve embryo cryopreservation technics.Conception and use of cryopreservation protocols are often empirical. This empiricismleads to many variations between the studies which make a comparison between results allthe more difficult. In our study, two complementary approaches were associated:• The first approach (physical) consisted of using the differential scanning calorimetry tostandardize the comparison between different slow-freezing solutions. So, thethermodynamic properties of solutions containing a potential substitute were characterizedand compared to those obtained with solutions containing reference products (fetal calfserum and bovine serum albumin) ;• The second approach (biological) consisted of using freezing of in vivo-produced rabbitembryos or freezing of in vitro-produced bovine embryos in order to evaluate survival