A participação dos produtos de glicação avançada (AGEs) nas complicações crônicas relacionadas ao diabetes, têm sido muito investigadas. Entretanto, pouco se sabe sobre a participação direta dos AGEs em relação a homeostase glicêmica, na qual o transportador de glicose GLUT4 (proteína codificada pelo gene SLC2A4 ) desempenha um papel essencial. Portanto o objetivo do presente estudo é investigar o papel dos AGEs tanto in vivo quanto in vitro sobre a expressão do Slc2a4/GLUT4. Nos modelos in vivo e in vitro, os AGEs reduziram a expressão gênica/proteica do Slc2a4/GLUT4 e reduziram a sensibilidade insulínica no modelo in vivo, como também exarcebaram tanto a via inflamatória pelo NFKB quanto a via do estresse de retículo endoplasmático pelas chaperonas. Por fim, estes resultados sugerem os AGEs como um mecanismo repressor da expressão do Slc2a4/GLUT4 no músculo esquelético pelas vias de estresse de retículo e inflamatória. / The participation of advanced glycation end products (AGEs) in the diabetes-related chronic complications has been extensively investigated. However, little is known about AGEs participation in glycemic homeostasis, for which the glucose transporter GLUT4 (Slc2a4 gene) plays a key role. The aim of this study was indentify the effect of AGEs in an in vivo and in vitro models in Slc2a4/GLUT4 expression. In vivo and in vitro models showed decrease of Slc2a4/GLUT4 expression and insulin sensitivity (only on in vivo model). AGEs increase inflammatory and endoplasmic reticulum stress ways by NFKB and chaperones respectively. In sume, The results reveal that AGEs repress Slc2a4/GLUT4 expression in muscle, in a reticulum endoplasmic stress- and inflammatory-mediated way. This effect contributes to impair plasma glucose clearance, highlighting AGEs reduction/inhibition as a target to improve glycemic control in diabetes.

MARQUES, Samuel Pedro Dantas. Nova proposta para rápida formação/combate dos produtos de glicação avançada (AGES) e propriedades farmacológicas de Hancornia speciosa Gomes. 2017. 191f. Tese (Doutorado em Química)- Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Weslayne Nunes de Sales (weslaynesales@ufc.br) on 2017-09-04T11:04:28Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_spmarques.pdf: 10801669 bytes, checksum: a960953c891c563db1c4666105f96c56 (MD5) / Approved for entry into archive by Weslayne Nunes de Sales (weslaynesales@ufc.br) on 2017-09-04T11:05:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_spmarques.pdf: 10801669 bytes, checksum: a960953c891c563db1c4666105f96c56 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-04T11:05:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_spmarques.pdf: 10801669 bytes, checksum: a960953c891c563db1c4666105f96c56 (MD5) Previous issue date: 2017 / This study reports the development of methodologies for formation and combat possibilities to Advanced Glycation Products (AGEs), and evaluate the chemical constitution and pharmacological properties of Hancornia speciosa Gomes(HSG). Regarding the obtaining of the AGEs, considering in vitro procedures, the current methodologies need an incubation period of up to 4 weeks. The methods developed in this work allowed a significant reduction of the reaction time (48 hours-glucose and fructose tests) (3 hours-tests with glyoxal and methylglyoxal), due to the coupling to the free radical generation system called hypoxanthine/xanthine oxidase. Thus, the methodologies presented in this work consisted in promoting the reaction between sugar solutions (glucose, fructose), or dicarbonyl compounds (methylglyoxal, glyoxal), with bovine serum albumin (BSA) protein solution, using different reaction media. The enzyme xanthine oxidase (XO) was added to the system in order to promote the formation of AGEs in a reaction environment with excess hydroxyl free radicals (.OH). The presence of these radicals in excess during the glycation and glycooxidation of the protein indicate to have promoted the oxidation of the chain of amino acid residues thereof, as well as sugars, thus giving α-dicarbonyl derivatives (glyoxal and methylglyoxal) more rapidly, the which made possible the significant reduction of the time of formation of the AGEs. The higher reactivity of fructose to glucose, to producer AGEs, was present in all conditions evaluated. The ability of different chemical species to combat the glycation process, acting as capture agents of α-dicarbonyl species, was shown to be effective for aminoguanidine (standard indicated in the literature), methanolic extracts of HSG leaves and rutin. The rutin was more active for the capture of dicarbonyl species than the standard indicated by the literature, due to the formation of more stable mono and/or disubstituted adducts. The measurement of the formation/combat of AGEs was determined by spectrofluorimetry. The qualitative analysis by high performance liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (HPLC-DAD-ESI-MS) of HSG methanolic extracts showed a great variety of polyphenolic compounds (phenolic acids and flavonoids), confirming the potential as a source of bioactive compounds. In the leaves and bark, the greatest number of polyphenolic compounds were verified when compared to the fruits. The following species were identified for the first time in HSG: vanillic acid glucoside, 3,4-dihydroxybenzoic acid, para-hydroxybenzoic acid, vanillin, trans-para-coumaric acid; cis-para-coumaric acid, trans-ferulic acid quinate, trans-ferulic acid, cis-ferulic acid, cis-ethyl chlorogenic acid, trans-ethyl chlorogenic acid, quercetin, quercetin pentoside, quercetin glucoside, quercetin rhamnoside, quercetin galactoside, quercetin rhamnogalactoside, quercetin rhamnoglucocoumarate, quercetin rhamnogalactocoumarate, kaempferol rhamnoglucoside, kaempferol rhamnogalactoside, kaempferol rhamnoglucocoumarate, kaempferol rhamnogalactocoumarate, isorhamnmetin rhamnoglucoside, afzelechin-C-glucoside. For the values of the antioxidant potential and inhibition of angiotensin I (antihypertensive effect), leaves and bark extracts were more active, presenting promising IC50 values when compared to the synthetic form of vitamin E (Trolox). The capacity of HSG extracts to inhibit the action of the enzyme acetylcholinesterase, which is related to Alzeimer treatment, has been shown to be quite significant for the hexane bark extract (EHC). The fractionation of the same, led to obtaining a mixture as a more active fraction. Through the use of magnetic resonance and literature data, the presence of lupeol in this fraction was identified. / Este estudo relata o desenvolvimento de metodologias para formação e possibilidades de combate dos Produtos de Glicação Avançada (AGEs),assimcomo a avaliação da constituição química e propriedades farmacológicas de Hancornia speciosaGomes (HSG). No que se refere a obtenção dos AGEs, considerando procedimentos in vitro, as metodologias atuais nescessitam de um período de incubaçãode até 4 semanas. Os métodos desenvolvidos neste trabalho, possibilitaram a redução significativa do tempo de reação (48 horas-ensaios com glicose e frutose) (3 horas-ensaios com glioxal e metilglioxal), em virtude do acoplamento ao sistema de geração de radicais livres denominado hipoxantina/xantinaoxidase.Assim, as metodologias apresentadas neste trabalho, consistiram em promover a reação entre soluções de açúcares (glicose, frutose), ou compostos dicarbonílicos (metilglioxal, glioxal), com solução proteica de albumina de soro bovino (BSA), utilizando diferentes meios reacionais.A enzima xantinaoxidase (XO),foi adicionada ao sistema com o intuito de promover a formação dos AGEs em ambiente reacional com excesso de radicais livres hidroxila (.OH).A presença em excesso destes radicais durante a glicação e glicooxidação da proteína, parecem ter promovido a oxidação da cadeia de resíduos de aminoácidos da mesma, bem como dos açúcares,originandoassim derivados α-dicarbonílicos (glioxal e metilglioxal) de forma mais rápida, o que possibilitou a redução tão significativa do tempo de formação dos AGEs. A maior reatividade da frutose frente a glicose, para originar os AGEs, se apresentou em todas as condições avaliadas.A capacidade de diferentes espécies químicas em combater o processo de glicação, atuando como agentes capturadores de espécies α-dicarbonílicas, se mostrou efetivo para aminoguanidina (padrão indicado pela literatura), extratos metanólicos das folhas de HSG eo flavonóide rutina. A rutina, apresentou-se mais ativa para captura de espécies dicarbonílicas que o próprio padrão indicado pela literatura, em virtude da formação de adutos mono e/ou dissubstituídos mais estáveis.A mensuração da formação/combate dos AGEs, foi determinada através de espectrofluorimetria.A análise qualitativa por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrômetro de massa (HPLC-DAD-ESI-MS) dos extratos metanólicos de HSG,exibiram grande variedade de compostos polifenólicos (ácidos fenólicos e flavonóides), confirmando o potencial como fonte de compostos bioativos. Nas folhas e caule, observou-se maior número de compostos polifenólicos quando comparados aos frutos. Foram identificadas pela primeira vez em HSG as seguintes espécies: ácido vanílico glicosídeo, ácido 3,4-di-hidroxibenzóico, ácido para-hidroxibenzóico, vanilina, ácidotrans-para- cumárico, ácidocis-para-cumárico, ácidotrans-ferúlico quinato, ácidotrans-ferúlico, ácidocis-ferúlico, ácidocis-etil-clorogênico, ácidotrans-etil-clorogênico, quercetina, quercetina pentosídeo, quercetina glicosídeo, quercetina ramnosídeo, quercetina galactosídeo, quercetina ramnogalactosídeo, quercetina ramnoglicocumarato, quercetina ramnogalactocumarato, canferol ramnoglicosídeo, canferol ramnogalactosídeo, canferol ramnoglicocumarato, canferol ramnogalactocumarato, isoramnetina ramnoglicosídeo e afzelequina-C-glicosídeo. No que se refere aos valores do potencial antioxidante e inibição da angiotensina I (efeito anti-hipertensivo),os extratos das folhas e caule se mostraram mais ativos, apresentando valores de IC50 promissores, quando comparado a forma sintética da vitamina E (Trolox).A capacidade dos extratos de HSG em inibir a ação da enzima acetilcolinesterase, que está relacionada ao tratamento do Alzheimer se mostrou bastante significativa para o extrato hexânico do caule (EHC). O fracionamento do mesmo, levou a obtenção de uma mistura como fração mais ativa. Atravésda utilização de ressonância magnética e dados da literatura, foi identificada a presença de lupeolnesta fração.

Diabetes leads to vascular complications arising from biochemical changes generated by accumulation of advanced glycation end-products (AGEs). Aminoguanidine is an anti-AGE in clinical phase III studies, but its chronic use can lead to nephrotoxicity and hepatotoxicity. For this reason, structural changes were made in the aminoguanidine molecule, originating nineteen derivatives, with which were evaluated for their antidiabetic and/or antiglycation effects in diabetic rats. For this purpose, initially was performed the in vitro cytotoxicity assay using the colorimetric assay with MTT3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 difeniiterazolium) in the J774A.1 macrophage cell line. To evaluate the antiglycation activity, AGES were produced in vitro by combining glucose with bovine serum albumin (BSA). The derivatives with the best outcome in vitro were submitted to acute toxicity tests in vivo at concentrations of 2 mg/kg, 10 mg/kg and 100 mg/kg oral administration and, thereafter the antidiabetic and antiglycation potential were checked in Wistar rats with diabetes induced by streptozotocin (20 mg/kg, i.p.). After euthanasia, heart, kidney and liver were extracted from the animals and submitted to histopathotological examination and blood for hemogram and biochemical tests. The outcomes obtained from MTT assay indicated that seventeen out of the nineteen derivatives did not show any toxic effect at the concentration of 10 puM, which means they kept 80% or more of viable cells. In antiglycation assay for in vitro activity, thirteen of these nineteen derivatives got above 50% of inhibition in the formation of advanced glycation end products in a concentration of 2 mg/ml, and significant when compared to a minoguanidine at the same concentration. In a dose range from 0.5 to 2.5 mg/m, with the reading of inhibition percentage every seven days for 49 days, the derivative LOM 13 reached 94.6% of inhibition, while aminoguanidine inhibited up to 74% of AGES, at concentration of 1.0 mg/ml. In studies in vivo the derivatives LOM3, LOM 13 and LOM15 were non-toxic, that means that the rats did not lose weight, neither showed behavioral, biochemical nor histological changes that could have been related to the use of derivatives. In tests for antidiabetic and antiglycation activity, these three derivatives were able to reduce blood glucose levels by up to 65%, being significant when compared to glimepiride (2 mg/kg, oral administration), the standard drug used. Furthermore, the levels of fructosamine and glycated hemoglobin remained lower in the groups treated with the derivatives. Based on that, it was possible to conclude that the derivatives studied have low cytotoxicity, have the antiglycation potential to AGES-BSA, they were non-toxic at the concentrations used and can reduce blood glucose, fructosamine levels and glycated hemoglobin in diabetic rats. Thus, they represent promising prototype of drugs, enabling the possibility of having in the future a product capable of reducing glycemia and at the same time having antiglycation action, protecting individuals from macro and microvascular complications of diabetes. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O diabetes leva a complicações vasculares provenientes de alterações bioquímicas geradas a partir do acúmulo dos produtos finais da glicação avançada (AGEs). A aminoguanidina é um anti-AGE em estudos clínicos de fase III, porém seu uso crônico pode levar à nefrotoxicidade e hepatotoxicidade. Por isso, modificações estruturais foram realizadas na molécula da aminoguanidina, originando dezenove derivados, os quais foram avaliados para a sua ação antidiabética e/ou antiglicante em ratos diabéticos. Para tanto, realizou-se inicialmente o teste de citotoxicidade in vitro pelo ensaio colorimétrico com MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difenilterazolium), em macrófagos da linhagem J774A.1. Para avaliação da atividade antiglicante, os AGEs foram produzidos in vitro a partir da junção de glicose com albumina sérica bovina (BSA). Os derivados com melhor resposta in vitro foram submetidos a testes de toxicidade aguda in vivo com concentrações de 2 mg/Kg, 10 mg/Kg e 100 mg/Kg p.o, e, posteriormente, verificou-se o potencial antidiabético e antiglicante em ratos Wistar com diabetes induzida por estrepzotocina (20 mg /kg, i.p.). Após eutanásia, foram retirados coração, rim e fígado dos animais para exames histopatológicos e o sangue para realização do hemograma e dosagens bioquímicas. Os resultados obtidos com o ensaio MTT indicaram que, dezessete dos dezenove derivados, não mostraram qualquer efeito tóxico na concentração de 10 M, ou seja mantiveram 80% ou mais de células viáveis. No ensaio para atividade antiglicante in vitro, treze desses dezenove derivados conseguiram um percentual acima de 50% de inibição na formação de produtos finais da glicação avançada na concentração de 2 mg/mL, sendo significativos quando comparados a aminoguanidina, na mesma concentração. Numa escala de doses, de 0,5 a 2,5 mg/mL, com leitura dos percentuais de inibição a cada sete dias por 49 dias, o derivado LOM 13 atingiu até 94,6% de inibição, enquanto que a aminoguanidina inibiu até 74% de AGEs, na concentração de 1,0 mg/mL. Nos estudos in vivo os derivados LOM3, LOM 13 e LOM15 não foram tóxicos, ou seja, os animais não perderam peso, nem apresentaram alterações comportamentais, nem bioquímicas ou histológicas que pudessem ser atribuídas ao uso dos derivados. Nos testes para atividade antidiabética e antiglicante, esses três derivados conseguiram reduzir os valores de glicemia em até 65%, sendo significativos quando comparados com a glimepirida (2 mg/kg, p.o.), droga padrão utilizada. Além disso, os níveis de frutosamina e hemoglobina glicada se mantiveram baixos nos grupos tratados com os derivados. A partir disso, foi possível concluir que os derivados estudados apresentam baixa citotoxicidade, têm potencial antiglicante para AGES-BSA, não foram tóxicos nas concentrações utilizadas e podem reduzir a glicemia e os níveis de frutosamina e hemoglobina glicada em ratos diabéticos. Portanto, estes representam protótipos de fármacos promissores, para que no futuro seja possível ter um produto capaz de reduzir os índices glicêmicos e, ao mesmo tempo ter ação antiglicante, protegendo os indivíduos das complicações macro e microvasculares do diabetes.

The advanced glycation endproducts (AGEs) constitute a large variety of compounds formed from nonenzymatic amino-carbonyl interactions between reducing sugars or oxidized lipids and proteins, nucleic acids or aminophospholipids. The AGEs formation in foods and biological systems is a topic of increasing interest for the science, since they are involved in proinflammatory and pro-oxidative effects related to the pathogenesis of chronic degenerative diseases such as diabetes, Alzheimer's disease and renal failure. The Nε-carboxymethyllisine (CML) was the first AGE identified in foods and, since then, has been the compound of choice in studies on which a single product is used as an AGE marker. Immunochemical or instrumental methods are available for the AGEs determination, but they present limitations and there is not an ideal method yet. Thus, in order to compare and optimize different analytical methods, this study aimed to determine the CML content on enteral and parenteral nutrition formulas by ELISA and LC-MS/MS. So, in order to compare and optimize different analytical methods, this study aimed to determine the content of CML in nutritional enteral and parenteral formulas by ELISA and by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS / MS). Thus, 5 parenteral and 17 enteral commercially available formulations were investigated. All samples studied showed detectable levels of CML, regardless of the method of analysis used. The parenteral formulations presented CML contents measured by ELISA ranging from 529.9 ± 33.47 to 1948.88 ± 3.68 ng CML/mL of sample and showed positive linear correlations to their content in lipids (0.9259) and carbohydrates (0.9426), but they were not submitted to the LC-MS/MS analysis due to the impossibility of applying the established purification protocol for this group of samples. Enteral formulations analyzed by ELISA presented CML contents ranging from 1076.91 ± 76.87 to 55950.71 ± 1891.29 ng CML/mL of sample and showed positive correlations to its contents in carbohydrate (0.6057), lipid (0.5264) and protein (0.6157). They showed a variation from 0.09 to 0.503 μg CML/mg of protein of the diets when analyzed by LC-MS/MS and there was no correlation between CML and the variables "lipid", "carbohydrate" or "protein" calculated for this group. The investigation conducted during the samples preparation prior to injection into the LC-MS/MS showed a significant loss of CML during the different stages of the protocol, compromising the reliability of the results obtained through this method of analysis, while the comparison between the results obtained through different methods applied to similar samples showed the reliability of the anti-CML ELISA test used in this experiments. The results of this study indicate the need for improvement of AGEs analysis protocols in food and should guide future research on this area. The determination of reliable methods of detection, which enable the measurement of AGEs structures in body fluids, tissues and also in food, in a sensitive, specific, fast and not too expensive way is a challenge that remains present on this field. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os produtos da glicação avançada (AGEs, do inglês Advanced Glycation Endproducts) constituem grande variedade de substâncias formadas a partir de interações amino-carbonilo, de natureza não-enzimática, entre açúcares redutores ou lipídeos oxidados e proteínas, aminofosfolipídeos ou ácidos nucléicos. A formação de AGEs nos alimentos e em sistemas biológicos constitui tema de crescente interesse, desde que estão associados a efeitos pró-oxidativos e pró-inflamatórios envolvidos na patogênese de diversas doenças crônico-degenerativas como o diabetes, o mal de Alzheimer, a insuficiência renal. A Nε-carboximetilisina (CML) foi o primeiro AGE a ser identificado em alimentos e tem sido o composto de escolha em estudos em que um único produto é usado como marcador de AGEs de um sistema. Métodos imunoquímicos ou instrumentais estão disponíveis para a determinação da CML, mas ambos apresentam limitações, não havendo ainda um método considerado ideal. Assim, a fim de comparar e otimizar diferentes métodos analíticos, o presente estudo teve como objetivo determinar o conteúdo em CML de fórmulas nutricionais enterais e parenterais através das técnicas de ELISA e de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS). Para tanto, foram investigadas 5 formulações parenterais e 17 enterais comercialmente disponíveis. Todas as amostras investigadas apresentaram níveis detectáveis de CML neste estudo, independentemente do método de análise utilizado. As fórmulas parenterais apresentaram conteúdos mensurados através de ELISA que variaram de 529,9 ± 33,47 a 1948,88 ± 3,68 ng de CML/mL de amostra e apresentaram correlações lineares positivas quanto aos seus conteúdos em lipídeos (0,9259) e em carboidratos (0,9426), mas não foram submetidas às análises através do LC-MS/MS devido à inviabilidade da aplicação para esse grupo de amostras do protocolo de purificação estabelecido nesta investigação. As formulações enterais apresentaram conteúdos em CML que variaram entre 1076,91 ± 76,87 e 55950,71 ± 1891,29 ng de CML/ mL de amostra e evidenciaram correlações positivas quanto aos seus conteúdos em carboidratos (0,6057), lipídeos (0,5264) e proteínas (0,6157), quando analisadas através de ELISA, e apresentaram uma variação de 0,09 e 0,503 μg CML/ mg de proteína das dietas quando analisadas através do LC-MS/MS, não havendo correlações entre a CML e as variáveis “lipídeos”, “carboidratos” ou “proteínas” para esse grupo. A investigação conduzida durante o processo de preparo das amostras, anterior à injeção no LC-MS/MS, evidenciou uma expressiva perda da CML durante as diferentes etapas do protocolo, comprometendo a confiabilidade dos resultados obtidos através desse método de análise, enquanto a comparação entre os resultados encontrados através dos diferentes métodos aplicados a amostras semelhantes em composição e preparo demonstrou a confiabilidade do teste de ELISA anti-CML utilizado nas condições deste experimento Os resultados do presente estudo apontam a necessidade de aperfeiçoamento dos protocolos de análise de AGEs em alimentos e deverão guiar futuras investigações nesta área. Dentre os desafios que permanecem presentes no campo de estudo dos AGEs está a definição de métodos de detecção confiáveis, que possibilitem a mensuração de estruturas nos fluidos ou tecidos corporais e nos alimentos, de maneira sensível, específica, rápida e não muito dispendiosa.

Les produits de réaction de Maillard apportent des caractéristiques organoleptiques souhaitables aux aliments (couleur, odeur et le goût), contribuant ainsi à leur acceptabilité par le consommateur. Toutefois, plusieurs effets délétères physiopathologiques (vieillissement, diabètes) ont été attribués aux produits de glycation avancés (AGE). Le but de ce travail a concerné la détermination simultanée par LC-MS/ESI (Q-ToF) des carboxyméthyllysine (CML), pentosidine (Pen) et pyrraline (Pyr) dans des échantillons de lait chauffés ou non, après purification et concentration en phase solide (SPE) par échange d'ions. Les échantillons de lait en suite ont été soumis à une hydrolyse acide avec HCl à 37%, une précipitation des protéines avec un mélange méthanol/acétone et une digestion enzymatique des protéines pendant 30 heures à 37°C. Après l'étape d'extraction, les échantillons ont été concentrés/purifiés par SPE avec cartouches échangeuses d'ions puis analysés par LC-MS/ESI (Q-ToF). Les cartouches d'échange d'ions ont permis d'obtenir une excellente récupération des AGEs (89%, 95% et 117% pour la CML, Pen et Pyr, respectivement), valeurs bien plus élevées que celles qui ont pu être obtenues avec des cartouches de type C18. La concentration/purification par SPE est une étape qui mérite une attention particulière pour la détermination et quantification des AGEs. Parmi les AGEs analysés, seule la Pyr a pu être retrouvée dans des échantillons de lait et celà à des valeurs comprises 0,021 ng/mg de protéines (lait écrémé) et 8,367 ng/mg (lait stérilisé). / Maillard reaction products provide desirable organoleptic characteristics to foods (color, odor and taste), thus contributing to their acceptability by the consumer. However, several deleterious pathophysiological effects (aging, diabetes) have been attributed to advanced glycation products (AGEs). The aim of this work was to determine the simultaneous determination by LC-MS/ESI (Q-ToF) of carboxymethyllysine (CML), pentosidine (Pen) and pyrraline (Pyr) in milk samples heated or non-heated after purification and solid phase concentration (SPE) by ion exchange. Subsequent the milk samples were subjected to acid hydrolysis with 37% HCl, protein precipitation with a methanol / acetone mixture and enzymatic protein digestion for 30 hours at 37°C. Après l'étape d'extraction, les échantillons ont été concentrés/purifiés par SPE avec cartouches échangeuses d'ions puis analysés par LC-MS/ESI (Q-ToF). Ion exchange cartridges have resulted in excellent recovery of AGEs (89%, 95% and 117% for the CML, Pen and Pyr, respectively), much higher than those obtained with C18 cartridges. The concentration/purification by SPE is a step that deserves special attention for the determination and quantification of AGEs. Between the AGEs analyzed, only Pyr could be found in milk samples and the values were 0.021 ng/mg protein (skimmed milk) and 8.367 ng/mg (sterilized milk). / Os produtos da reação de Maillard fornecem propriedades organolépticas desejáveis para alimentos (cor, cheiro e sabor), contribuindo assim para a sua aceitação pelos consumidores. No entanto, vários efeitos deletérios fisiopatológicos (envelhecimento, diabetes) são atribuídos aos produtos da glicação avançada (AGEs). O objetivo deste trabalho foi à determinação simultânea por LC-MS/ESI (Q-ToF) de carboximetillisine (CML), a pentosidina (PEN) e pirralina (Pyr) em amostras de leite aquecido ou não, após purificação e concentração fase sólida (SPE) por troca iônica. As amostras de leite foram subsequentemente submetidas a uma hidrólise ácida com HCl a 37%, a uma precipitação da proteína com uma mistura de metanol/acetona e uma digestão enzimática durante 30 horas a 37°C. Após a etapa de extração, as amostras foram concentradas/purificado por SPE, com cartuchos de troca iônica e analisadas por LC-MS/ESI (Q-ToF). Os cartuchos de troca iônica permitiram obter uma excelente recuperação dos AGEs (89%, 95% e 117% para CML, Pen e Pyr, respectivamente), sendo valores bem mais elevados do que os que podem ser obtidos com cartuchos de C18. A concentração/purificação por SPE é um etapa que merece uma atenção especial para a determinação e quantificação de AGEs. Entre os AGEs analisados, apenas Pyr foi encontrado nas amostras de leite, sendo observado valores para Pyr entre 0,021 ng/mg de proteína (leite desnatado) e 8367 ng/mg (leite esterilizado).