Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TicianaMLA_TESE.pdf: 1476361 bytes, checksum: 7074b01e6eb22db7b4cacc005194c334 (MD5) Previous issue date: 2014-04-29 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Proteinases are enzymes distributed widely founded in several organisms and perform many different functions, from maintaining homeostasis to the worsening of some diseases such as cancer, autoimmune diseases and infections. The proteins responsible of controlling the action of these enzymes are the inhibitors, that are classified based on their target proteases and are founded since simple organisms, such as bacteria, to higher organisms, such as larger plants and mammals. Plant proteinase inhibitors act by reducing or inactivating the activity of target proteases, thus, these proteins have been studied as potential tools in the treatment of diseases related to protease activities. In this context, an inhibitor of chymotrypsin from Erythrina velutina, called EvCI was previously purified and it was observed that this protein plays in vitro anticoagulant activity and anti-inflammatory activity in in vivo model. Aiming to reduce the environmental impact caused by the purification EvCI in high amounts and to facilitate the process of obtaining this protein, the recombinant chymotrypsin inhibitor from Eryhrina velutina was produced after cloning and expression in Escherichia coli. The bacteria were grown in LB medium and after induction of the expression this material was subjected to procedures for cell lysis and the product was applied on Nickel-affinity column. The proteins adsorbed were digested by thrombin and applied on Chymotrypsin-Sepharose affinity column, obtaining the purified inhibitor, named recEvCI. After electrophoresis, the recombinant inhibitor showed an approximately molecular mass of 17 kDa, and reduced the chymotrypsin and elastase activities in vitro. The recombinant inhibitor was sequenced and was found similar amino acids residues when compared to other inhibitors deposited in the database, with some modifications. recEvCI showed high stability under pH variations and reducing conditions, maintaining its activity around 80%. This protein increased the blood coagulation time in vitro by acting on the intrinsic pathway and did not show cytotoxicity against strains of mouse 3T3 fibroblasts and RAW 264.7 macrophages. recEvCI showed microbicide activity related to release of nitric oxide and consequently the activation of macrophages, futhermore having proinflammatory effects assessed by increased release of TNF-α. These results indicate that recEvCI can be biotechnologically used as a new tool in the control of coagulation-related diseases as well as can be an activating agent of the immune system in immunosuppressed individuals / Proteinases s?o enzimas amplamente distribu?das em diferentes organismos e que desempenham as mais diversas fun??es, desde a manuten??o da homeostase at? o agravamento de algumas doen?as como c?ncer, doen?as autoimunes e infec??es. As prote?nas respons?veis pelo controle e atua??o destas enzimas s?o os inibidores, que s?o classificados de acordo com suas proteases alvo e s?o encontrados desde organismos mais simples, como bact?rias, aos mais complexos, como plantas de grande porte e mam?feros. Inibidores de proteinases de plantas agem reduzindo ou inativando a atividade de enzimas alvo, dessa forma, estas prote?nas v?m sendo estudadas como poss?veis ferramentas no tratamento de doen?as relacionadas ?s atividades prote?sicas. Neste contexto, um inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina, denominado EvCI, foi previamente purificado e foi observado que esta prote?na desempenha atividades anticoagulante in vitro a anti-inflamat?ria em modelo in vivo. Buscando reduzir o impacto ecol?gico causado pela purifica??o de EvCI em grandes quantidades e facilitar o processo de obten??o desta prote?na, o inibidor de quimotripsina recombinante de Erythrina velutina foi produzido ap?s clonagem e express?o em c?lulas de Escherichia coli. As bact?rias foram crescidas em meio LB e ap?s indu??o da express?o este material foi submetido a procedimentos de lise celular e o produto foi aplicado em uma coluna de afinidade de N?quel. As prote?nas ligadas ? coluna foram digeridas por trombina, aplicadas em uma coluna de afinidade de Quimotripsina-Sepharose obtendo-se o inibidor purificado, denominado recEvCI. Ap?s eletroforese, o inibidor recombinante apresentou uma massa molecular de, aproximadamente, 17 kDA e reduziu a atividade de quimotripsina e elastase in vitro. O inibidor recombinante foi sequenciado e foi detectada a presen?a de amino?cidos iguais a outros inibidores depositados em banco de dados, com algumas modifica??es. recEvCI demonstrou alta estabilidade quando submetido a varia??es de pH e sob condi??es redutoras, mantendo sua atividade inibit?ria em torno de 80%. Esta prote?na aumentou o tempo de coagula??o sangu?nea in vitro por atua??o sobre a via intr?nseca e n?o demostrou citotoxicidade contra as linhagens de fibroblasto de camundongo 3T3 e de macr?fagos RAW 264.7. recEvCI apresentou atividade microbicida relacionada ? libera??o de ?xido n?trico e consequente ativa??o de macr?fagos, al?m de possuir efeito pr?-inflamat?rio avaliado pelo aumento da libera??o de TNF-α. Estes resultados indicam que recEvCI pode ser utilizado biotecnologicamente como uma nova ferramenta no controle de doen?as relacionadas ? coagula??o assim como pode vir a ser um agente ativador do sistema imune em indiv?duos imunossuprimidos

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A glycosylated lectin (CTL) with specificity for mannose and glucose has been detected and purified from seeds of Centrolobium tomentosum, a legume plant from the Dalbergieae tribe. CTL was isolated by mannose-Sepharose affinity chromatography. The primary structure was determined by tandem mass spectrometry and consists of 245 amino acids and one N-glycosylation site, possessing high similarity with the lectin Platypodium elegans (PELa) and Pterocarpus angolensis (PAL) derived from the same tribe. Two crystal structures of CTL, with monoclinic and tetragonal forms, both complexed with methyl dimanosÃdeo has been solved at 2.25 and 1.9 Ã, respectively, with high similarity. The lectin adopts a typical canonical dimeric organization of legume lectins. The carbohydrate recognition domain (CRD), metal binding site, and glycosylation site have been characterized and the structural basis for interaction with carbohydrate been elucidated. CTL showed acute inflammatory effect in a paw edema model. The protein structure was subjected to ligand screening (dimannosides and trimannoside) by molecular docking, revealing a higher affinity for trimannosides and their interactions were compared with similar lectins, which have the same binding specificity. This is the first report of a crystal structure of a native mannose lectin / specific glucose Dalbergieae tribe with pro-inflammatory activity / Uma lectina glicosilada (CTL) com especificidade a manose e glucose foi detectada e purificada a partir de sementes de Centrolobium Tomentosum, uma leguminosa pertencente à tribo Dalbergieae. CTL foi isolada por cromatografia de afinidade de Sepharose-Manose. A estrutura primÃria foi determinada por espectrometria de massas e consiste em 245 aminoÃcidos e um sitio de ÂNÂ-glicosilaÃÃo, demonstrando similaridade com a lectina de Platypodium elegans (PELa), Pterocarpus angolensis (PAL), dentre outras, oriundas da mesma tribo. Duas estruturas cristalinas de CTL, de formas monoclÃnica e tetragonal, ambas complexadas com metil-dimanosÃdeo, foram resolvidas a 2,25 e 1,9 Ã, respectivamente, apresentando alta similaridade entre si. A lectina mostrou adotar uma organizaÃÃo dimÃrica canÃnica tÃpica de lectinas de leguminosas. O domÃnio de reconhecimento de carboidratos (CRD), local de ligaÃÃo do metal e local de glicosilaÃÃo foram caracterizados e a base estrutural para a interaÃÃo com carboidratos foi elucidado. CTL mostrou efeito inflamatÃrio agudo em um modelo de edema de pata. A estrutura da proteÃna foi submetida a uma anÃlise de interaÃÃes com dimanosÃdeos e trimanosÃdeos por Docking Molecular, revelando sua maior afinidade por trimanosÃdeos e suas interaÃÃes foram comparadas com lectinas similares que possuam a mesma especificidade de ligaÃÃo. Esse à o primeiro relato de estrutura cristalina de uma lectina nativa manose/glucose especÃfica da tribo Dalbergieae com atividade prÃ-inflamatÃria