Abstract HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs) and HIF asparaginyl hydroxylase (FIH) are novel members of the 2-oxoglutarate dioxygenase family that play key roles in the regulation of the hypoxia-inducible transcription factor (HIF). They hydroxylate specific proline and asparagine residues in HIF-α, leading to its proteasomal degradation and inhibition of its transcriptional activity, respectively. These enzymes are inhibited in hypoxia, and as a consequence HIF-α becomes stabilized, forms a dimer with HIF-β, attains its maximal transcriptional activity and induces expression of many genes that are important for cell survival under hypoxic conditions. The three HIF-P4Hs and FIH were expressed here as recombinant proteins in insect cells and purified to near homogeneity. All these enzymes were found to require long peptide substrates. The three HIF-P4Hs and FIH acted differently on the various potential hydroxylation sites in the HIF-α isoforms. The HIF-P4Hs acted well on sequences with cores distinctly different from the core motif -Leu-X-X-Leu-Ala-Pro-, suggested based on sequence analysis studies, the alanine being the only relatively strict requirement in addition to the proline itself. Acidic residues around the hydroxylation site also played a distinct role. These results together with those of others provide evidence that there is no conserved core motif for the hydroxylation by HIF-P4Hs. The Km values of the HIF-P4Hs for O2 were slightly above its atmospheric concentration, while the Km of FIH was about one-third of these values but still 2.5 times that of the type I collagen P4H. The HIF-P4Hs are thus effective oxygen sensors, as even small decreases in the amount of O2 affect their activities, while a more severe decrease is required to inhibit FIH activity. Small molecule inhibitors of the collagen P4Hs also inhibited the HIF-P4Hs and FIH but with distinctly different Ki values, indicating that it should be possible to develop specific inhibitors for the HIF-P4Hs and FIH. The HIF-P4Hs were found to bind the iron cosubstrate more tightly than FIH and the collagen P4Hs, and the chelator desferrioxamine was an ineffective inhibitor of the HIF-P4Hs in vitro. Several metals were effective competitive inhibitors of FIH but they were ineffective inhibitors of the HIF-P4Hs. The well-known stabilization of HIF-1α by cobalt and nickel is thus not due to a simple competitive inhibition of the HIF-P4Hs, and is probably at least in part due to HIF-P4H-independent mechanisms. The effective inhibition of FIH by these metals nevertheless indicates that the stabilized HIF-1α is transcriptionally fully active.

Abstract Collagen prolyl 4-hydroxylase (C-P4H) plays a central role in the biosynthesis of collagens by hydroxylating proline residues. The enzyme has been a subject of intense interest as a target enzyme for drug development. The recombinant expression of human C-P4H in prokaryotes has not yet been described. This work reports on the development of an expression system for human C-P4H in E. coli. The vertebrate C-P4H enzymes are α2β2 tetramers, consisting of two β subunits which are identical to protein disulphide isomerase (PDI), aside from the two α subunits which have the catalytic activity. The function of PDI is to keep the α subunit in a soluble and active state. Therefore, the expression system should assure the expression of the β subunit in the cell before the α subunit by using two different promoters. An active C-P4H tetramer was obtained in the periplasm of E. coli. However, further optimization for production by stepwise regulated coexpression of its subunits in the cytoplasm of a thioredoxin reductase and glutathione reductase mutant E. coli strain resulted in large amounts of human C-P4H tetramer. The exchange of four rare E. coli codons of the pdi gene and the optimized distance between ribosome binding site and translation initiation, resulted in 50-fold P4H-activity and 25 mg/l purified enzyme. Comparison of the expression level of mRNA from the α and β subunits by Sandwich hybridization identified single induction with anhydrotetracycline in fed-batch fermentations as a limiting parameter. This caused an insufficient expression level of mRNA and thereby a low yield of C-P4H. A maximum yield was obtained by repeated addition of anhydrotetracycline that led to higher mRNA levels and increased productivity. A newly developed stochastic simulation model of translational ribosome traffic in bacteria assesses the effect of codon usage to ribosome traffic and to the overall translation rate and mRNA stability. Using human PDI, it was shown that substitution of four 5' codons of the human PDI sequence that are rare in E. coli sequences, by synonymous codons preferred in E. coli led to a 2-fold increase of total PDI amount and even to a 10-fold increase of soluble PDI amount.

Abstract Oxygen deprivation (hypoxia) is related to many disease conditions, such as anemia, but is also a critical regulatory signal during normal development. Cellular responses to hypoxia are largely mediated through alterations in gene regulation brought about by the transcription factor known as hypoxia inducible facor (HIF). One of the most extensively studied systemic consequences of hypoxia is the induction of red blood cell production, erythropoiesis, which occurs through a HIF-dependent increase in erythropoietin (EPO) gene expression. The amount of HIF in cells is regulated by three HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs) while a fourth P4H possessing a transmembrane domain (P4H-TM) is able to act on HIF at least in vitro. The putative role of P4H-TM in regulating erythropoiesis is studied here by administering a HIF-P4H inhibitor, FG-4497, to P4h-tm null and wild-type mice. By comparing the observed effects with those seen in FG-4497 treated hypomorphic Hif-p4h-2 and Hif-p4h-3 null mice, it is demonstrated for the first time that P4H-TM is involved in the regulation of Epo production in the mammalian kidney, but not in the liver. Long bones are formed via endochondral ossification, in which a cartilaginous template, the growth plate, is first laid down and then replaced with bone. The growth plate is rich in extracellular matrix (ECM) and contains a hypoxic central region in which HIF has been shown to regulate chondrocyte function. Importantly, growth plate chondrocytes are highly active in collagen synthesis. Collagen prolyl 4-hydroxylases (C-P4Hs I-III) provide collagen molecules with thermal stability and are thus necessary for the formation of a proper ECM. Through an in vitro approach it is demonstrated that hypoxia increases the amount and activity of C-P4H in primary mouse epiphyseal growth plate chondrocytes in a HIF-1-dependent manner. Lastly, it was set out to characterize mouse lines with complete inactivation of C-P4H-II with or without partial inactivation of C-P4H-I. A significant reduction in the total amount of C-P4H and its activity was found to result in mild chondrodysplasia and altered bone properties. The above mouse models provided new information on the specific in vivo roles of the C-P4H isoenzymes I and II. / Tiivistelmä Kudosten alentunut happipitoisuus (hypoksia) liittyy osana moniin elimistön patologisiin tiloihin, kuten anemiaan. Lisäksi se on tärkeä säätelytekijä normaalin yksilönkehityksen aikana. Jotta solut havaitsisivat hypoksian ja reagoidakseen siihen, on niille kehittynyt säätelyjärjestelmä, jossa hypoksiassa indusoituva transkriptiotekijä, HIF, on tärkeässä asemassa. Yksi merkittävin HIF:n indusoima systeeminen vaikutus elimistössä on punasolujen tuotannon, erytropoieesin, kiihtyminen. Sitä tapahtuu erytropoietiinia koodittavan geenin (EPO) lisääntyneen ilmentymisen kautta. HIF-tekijän määrää soluissa säätelee kolme HIF-prolyyli-4-hydroksylaasientsyymiä (HIF-P4Ht 1-3). Transmembraanisen prolyyli-4-hydroksylaasin (P4H-TM) tiedetään myös vaikuttavan HIF-tekijän määrään soluissa in vitro, mutta sen vaikutusta nisäkkään erytropoieesiin ei ole aiemmin tutkittu. Käyttämällä hyväksi kolmea eri transgeenista hiirilinjaa (P4h-tm-/-, Hif-P4h-2gt/gt, Hif-p4h-3-/-) ja HIF-P4H entsyymeitä inhiboivaa lääkeainetta, FG-4497, tässä työssä osoitettiin ensimmäistä kertaa, että P4H-TM osallistuu nisäkkään Epo-hormonin tuoton säätelyyn. Pitkät luut muodostuvat endokondraalisen luutumisen kautta. Siinä ensin muodostuu rustoinen malli, kasvulevy, joka vähitellen korvaantuu luukudoksella. Kasvulevyn sisin kerros on sen soluille, kondrosyyteille, hypoksinen kasvuympäristö. HIF:illä on todettu olevan tärkeä rooli kondrosyyttien toiminnan säätelijänä. Kasvulevyn soluvälitila sisältää runsaasti kollageeneja. Kollageenin prolyyli-4-hydroksylaasit (C-P4Ht I-III) ovat avainasemassa kollageenien biosynteesissä ja siten niiden toiminta on välttämätöntä kestävän soluvälitilan muodostumiselle. Käyttämällä in vitro menetelmiä, tässä työssä osoitettiin, että hiiren epifyseaalisten kasvulevyjen kondrosyyteissä hypoksia lisää C-P4H:n määrää ja aktiivisuutta HIF-tekijästä riippuvalla mekanismilla. Eri C-P4H-isoentsyymeiden toiminnasta ja merkityksestä in vivo tiedetään vain vähän. Tässä työssä karakterisoitiin hiirilinja, jossa C-P4H-II on täysin inaktiivinen, ja hiirilinja, jossa lisäksi C-P4H-I on osittain inaktiivinen. Merkittävästi alentuneen C-P4H:n aktiivisuuden todettiin aiheuttavan hiirimallissa lievän kondrodysplasian sekä heikentyneet luun ominaisuudet.

Abstract Prolyl hydroxylases catalyze the post-translational formation of 3- and 4-hydroxyprolines in polypeptides. To date, two prolyl 4-hydroxylase families are known to exist: collagen prolyl 4-hydroxylases (C-P4Hs) which reside in the endoplasmic reticulum, and hypoxia-inducible factor prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs) which reside in either the cytoplasm or nucleus. C-P4Hs and HIF-P4Hs belong to the 2-oxoglutarate dioxygenase family and require Fe2+, 2-oxoglutarate, O2 and ascorbate in their reaction. C-P4Hs are critical enzymes in collagen biosynthesis since the formation of 4-hydroxyproline residues stabilizes the collagen triple helix at body temperature. HIF-P4Hs regulate, through hypoxia-inducible factor HIF, the expression of genes that are essential for the survival of cells during hypoxia. This thesis reports the cloning and characterization of two novel P4Hs, from human and a plant, which show some distinct features when compared to previously characterized P4Hs. The human P4H was found to have a unique transmembrane domain, with its catalytic region residing inside the lumen of the endoplasmic reticulum, its subcellular localization thus being identical to that of the C-P4Hs. However, unlike C-P4Hs, it hydroxylated HIF-α both in vitro and in cellulo. Furthermore, its expression level was induced in hypoxic conditions in most of the cell lines studied. The Arabidopsis thaliana P4H had distinct differences in its substrate specificity when compared to another previously characterized A. thaliana P4H. Interestingly, the putative peptide binding regions of the two new P4Hs characterized in this study shared some homology. Three prolyl 3-hydroxylase (P3H) isoenzymes are known to exist in vertebrates and they also belong to the 2-oxoglutarate dioxygenases. It is known that 3-hydroxyprolines are found only in collagens, being most abundant in type IV collagen. The function of this modification is as yet poorly understood, but its absence in collagen I has recently been shown to lead to recessive lethal osteogenesis imperfecta. The human P3H isoenzymes were cloned during these thesis studies, and were expressed as recombinant proteins. The kinetic properties of one of them, P3H2, which was found to be expressed in structures rich with basement membranes, was studied in detail. / Tiivistelmä Prolyylihydroksylaasit ovat entsyymejä, jotka katalysoivat 3- ja 4-hydroksiproliinien muodostumisen valkuaisaineissa. Nykyisin tunnetaan ainakin kaksi prolyyli-4-hydroksylaasien (P4H) entsyymiperhettä: endoplasmakalvostossa sijaitsevat kollageeni prolyyli-4-hydroksylaasit (kollageeni-P4H:t) sekä vähähappisissa olosuhteissa aktivoituvaa transkriptiotekijää, hypoksiaindusoituvaa faktoria (HIF), hydroksyloivat prolyyli-4-hydroksylaasit (HIF-P4H:t). HIF-P4H:t sijaitsevat sytoplasmassa ja tumassa. Sekä kollageeni-P4H:t että HIF-P4H:t kuuluvat 2-oksoglutaraattidioksygenaasien laajaan entsyymiperheeseen. Nämä entsyymit tarvitsevat kosubstraateikseen rautaa, 2-oksoglutaraattia, happea sekä C-vitamiinia. Kollageeni-P4H:t hydroksyloivat kollageenien proliinitähteitä ja ovat avainasemassa kollageenisynteesissä, sillä muodostuneet 4-hydroksiproliinitähteet ovat ehdoton vaatimus stabiilille kollageenirakenteelle. HIF-P4H:t säätelevät puolestaan niiden geenien ilmenemistä, jotka ovat välttämättömiä elimistön selviytymiselle vähähappisissa olosuhteissa. HIF-P4H:t hydroksyloivat HIF-transkriptiotekijän α-alayksikön tiettyjä proliinitähteitä hapen läsnä ollessa, joka ohjaa α-alayksikön proteasomaaliseen hajotukseen eikä aktiivista HIF transkriptiotekijää siten muodostu. Alentuneessa happipitoisuudessa HIF-P4H entsyymien toiminta estyy, HIF stabiloituu ja aktivoi kohdegeeniensä toiminnan. Kollageeni-P4H entsyymejä pidetään erityisen sopivina lääkekehityksen kohteina fibroottisten ja HIF-P4H entsyymejä iskeemisten sairauksien hoitoon. Tässä väitöskirjatyössä on karakterisoitu aiemmin tuntematon ihmisen transmembraaninen P4H entsyymi (P4H-TM). Entsyymi osoittautui indusoituvan vähähappisissa olosuhteissa useissa solulinjoissa ja hydroksyloivan HIF-transkriptiotekijää muistuttaen siten HIF-P4H entsyymejä. Kuitenkin P4H-TM:n solulokalisaatio poikkesi HIF-P4H entsyymeistä, sillä sen havaittiin sijaitsevan endoplasmakalvostossa, katalyyttinen keskus kalvoston sisällä. Näiden tutkimustulosten valossa on oletettavaa, että tällä ihmisentsyymillä on HIF:n lisäksi toinen toistaiseksi tuntematon fysiologinen substraatti. Väitöskirjassa karakterisoitiin toinen lituruohon, Arabidopsis thalianan, P4H (At-P4H-2), joka poikkesi katalyyttisiltä ominaisuuksiltaan aiemmin karakterisoidusta lituruohon P4H:sta. Näiden kahden kasvientsyymin substraattivaatimusten poiketessa selvästi toisistaan, on niillä solussa todennäköisesti spesifiset tehtävät. At-P4H-2:n oletetulla substraatin sitomisalueella on jakso, joka on 37-prosenttisesti identtinen ihmisen P4H-TM:n kanssa, minkä vuoksi At-P4H-2:n karakterisoinnin uskottiin olevan tärkeä apuväline ihmisen P4H-TM:n tutkimuksissa. Selkärankaisilla prolyyli-3-hydroksylaaseja (P3H) tiedetään olevan kolme, ja myös ne kuuluvat 2-oksoglutaraattidioksygenaaseihin. 3-Hydroksiproliinia esiintyy ainoastaan kollageeneissa, erityisesti tyypin IV kollageenissa, joka on tyvikalvojen tärkeä rakennekomponentti. 3-Hydroksiproliinin merkitystä ei tunneta vielä tarkoin, mutta tyypin I kollageenissa 3-hydroksiproliinin puutoksen on osoitettu johtavan vaikeaan luustosairauteen, osteogenesis imperfectaan. Väitöskirjatyössä ihmisen P3H:t kloonattiin ja tuotettiin rekombinanttiproteiineina. Yhden isoentsyymin (P3H2) katalyyttiset ominaisuudet määritettiin ja sen osoitettiin ilmenevän erityisesti kudoksissa, joissa on paljon tyvikalvorakenteita.

Abstract Oxygen homeostasis is critical to all animals, as both excess (hyperoxia) and reduced (hypoxia) levels of oxygen can result in pathological changes and ultimately in the loss of cellular and organismal viability. Complex systems have evolved to sense and adapt to changes in cellular oxygen availability, and the hypoxia-inducible factor HIF plays a pivotal role in this elaborate molecular network. In normoxic conditions the α-subunit of HIF becomes hydroxylated by HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs 1-3), earmarking HIF-α for proteasomal degradation. Additionally, in the presence of oxygen the hydroxylation of an asparagine residue by the HIF asparaginyl hydroxylase FIH inhibits the transactivation of HIF-target genes by blocking the interaction of HIF-α with a transcriptional coactivator. In addition to being a feature of an organism’s normal life, hypoxia is also characteristic of many common diseases such as severe anemia and myocardial infarction, and it notably decreases these hydroxylation reactions, as HIF-P4Hs and FIH have an absolute requirement for oxygen as a cosubstrate. HIF-α thus escapes degradation and translocates into the nucleus, where it dimerizes with HIF-β and recruits transcriptional coactivators to the hypoxia-response elements of target genes, inducing their transcription and triggering the hypoxia response aimed at restoring cellular oxygen homeostasis. In this study we generated a genetically modified HIF-P4H-2 hypomorphic mouse line that expresses only 8% of the wild-type HIF-P4H-2 mRNA in the heart. We showed that chronic cardiac HIF-P4H-2 deficiency leads to stabilization of HIF-1α and HIF-2α and protects the heart against acute ischemia-reperfusion injury without causing any adverse effects. Furthermore, we identified and cloned a novel human transmembrane prolyl 4-hydroxylase P4H-TM and showed that it regulates HIF-1α protein levels in cellulo and hydroxylates HIF-1α in vitro similarly to the HIF-P4Hs, but may also have other physiological substrates. Using forward genetic tools we showed that lack of P4H-TM during development leads to basement membrane defects and compromised kidney function in zebrafish embryos. Finally, we demonstrated that FIH displays substrate selectivity in terms of hydroxylation and binding of HIF-1α and novel substrates Notch1-3. We showed that FIH has higher affinity for oxygen with Notch1 than with HIF-1α as a substrate, implying that FIH-mediated hydroxylation of Notch can continue in oxygen concentrations where HIF-1α hydroxylation would be markedly reduced. / Tiivistelmä Happitasapainon ylläpito on edellytys elimistön normaalille toiminnalle, koska sekä liian korkea (hyperoksia) että liian matala (hypoksia) happipitoisuus ovat elimistölle stressitiloja ja johtavat pitkittyessään haitallisiin seurauksiin. Happipitoisuuden muutosten havaitsemiseksi ja niihin reagoimiseksi onkin elimistössä kehittynyt monimutkainen säätelyjärjestelmä, jossa avainasemassa on hypoksia-indusoituva tekijä HIF. Solun happipitoisuuden ollessa normaali yksi kolmesta HIF prolyyli 4-hydroksylaasi-isoentsyymistä (HIF-P4Ht 1-3) katalysoi kahden proliinitähteen hydroksylaation HIF-α-alayksikössä. 4-hydroksiproliini toimii signaalina HIF-α:n nopealle proteasomaaliselle hajotukselle. Lisäksi HIF asparaginyyli hydroksylaasi FIH:n katalysoima HIF-α:n asparagiinitähteen hydroksylaatio estää transaktivaatiovaikutuksen. Koska HIF-P4Ht ja FIH tarvitsevat kosubstraatikseen happea, nämä hydroksylaatioreaktiot vähenevät happipitoisuuden laskiessa, jolloin HIF-α stabiloituu ja siirtyy solun tumaan, jossa se muodostaa kompleksin HIF-β-alayksikön kanssa ja houkuttelee paikalle tarvittavat kofaktorit. HIF-kompleksi tehostaa hypoksiavasteessa tarvittavien geenien luentaa sitoutumalla tumassa niiden promoottoreihin ja pyrkii näin palauttamaan solun happipitoisuuden normaaliksi. Tässä työssä luotiin geneettisesti muunneltu HIF-P4H-2 hypomorfi-hiirilinja, jonka sydämissä tuottuu vain 8 % normaalista HIF-P4H-2 lähetti-RNA:n määrästä. HIF-P4H-2:n puutoksen havaittiin johtavan HIF-1α:n ja HIF-2α:n stabiloitumiseen sydämessä ja suojaavan sydäntä kudosvaurioilta iskemian ja reperfuusion aikana aiheuttamatta haitallisia vaikutuksia. Tässä väitöskirjassa karakterisoitiin aiemmin tuntematon ihmisen transmembraaninen prolyyli 4-hydroksylaasi, P4H-TM. Sen osoitettiin säätelevän HIF-1α:n määrää soluissa ja katalysoivan HIF-1α:n kahden proliinitähteen hydroksylaatiota in vitro-olosuhteissa HIF-P4H-entsyymien tavoin. Seeprakalamallin avulla näytettiin, että P4H-TM:n puutos kalan kehityksen aikana aiheuttaa tyvikalvopoikkeavuuksia ja johtaa vakavaan munuaisen toiminnan häiriintymiseen seeprakalan poikasissa. FIH:n katalysoiman hydroksylaatioreaktion kineettisiä ominaisuuksia verrattiin tässä tutkimuksessa ensimmäistä kertaa aiemmin tunnetun HIF-α substraatin ja uusien Notch substraattien kesken. Tulokset osoittivat, että substraatin sitomisessa ja hydroksylaatiossa on merkittäviä eroja eri substraattien välillä.

The HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4H) control hypoxia-inducible factor (HIF), a powerful mechanism regulating cellular adaptation to decreased oxygenation. The gastrointestinal epithelium subsists in “physiological hypoxia” and should therefore have an especially well-designed control over this adaptation. Thus, we assessed the absolute mRNA expression levels of the HIF pathway components, Hif1a, HIF2a, Hif-p4h-1, 2 and 3 and factor inhibiting HIF (Fih1) in murine jejunum, caecum and colon epithelium using droplet digital PCR.We found a higher expression of all these genes towards the distal end of the gastrointestinal tract. We detected mRNA for Hif-p4h-1, 2 and 3 in all parts of the gastrointestinal tract. Hif-p4h-2 had significantly higher expression levels compared to Hif-p4h-1 and 3 in colon and caecum epithelium. To test the roles each HIF-P4H isoform plays in the gut epithelium, we measured the gene expression of classical HIF target genes in Hif-p4h-1/, Hif-p4h-2 hypomorph and Hif-p4h-3/ mice. Only Hif-p4h-2 hypomorphism led to an upregulation of HIF target genes, confirming a predominant role of HIF-P4H-2. However, the abundance of Hif-p4h-1 and 3 expression in the gastrointestinal epithelium implies that these isoforms may have specific functions as well. Thus, the development of selective inhibitors might be useful for diverging therapeutic needs.

Infarction irreversibly damages the heart, with formation of an akinetic scar that may lead to heart failure. Endogenous cardiac stem cells (CSCs) are a promising candidate cell source for restoring lost tissue and thereby preventing heart failure. CSCs would be most beneficial if administered soon after infarction, thus the aim of this project was to optimize CSC culture conditions to enhance their therapeutic potential for myocardial infarction. CSCs were isolated and expanded in vitro via the formation of cardiospheres to give cardiosphere-derived cells (CDCs). Neonatal rat CDCs were found to be heterogenous, containing cells expressing the cardiac stem cell marker, c-Kit, pluripotent cell markers, Oct-4, Sox 2, Klf-4 and Nanog, and early cardiac specific differentiation markers, Nkx 2.5 and GATA 4. Administration of CDCs to the infarcted rat heart increased the cardiac ejection fraction by 9%, capillary density by 9% and reduced scar volume by 33%, compared to the non-treated group. The proliferation rates and the expression of c-Kit were significantly decreased in CSCs isolated from aged rats and after extended culture in vitro, so, CSC culture was optimized using hypoxic preconditioning. Under hypoxia, CDC proliferation rates were 1.7-fold greater, and larger cardiosphere clusters were formed. Hypoxic CDCs had an increased cardiac stem cell population, in that c-Kit was increased by 220% and CD90 and CD105 were decreased by 55% and 35%, respectively, compared to normoxic CDCs. Further, hypoxia induced the expression of CXCR-4 (~3.2-fold), EPO (~3.0-fold) and VEGF (~1.5-fold), indicating that hypoxic preconditioning may stimulate stem cell homing and neovascularization in the infarcted myocardium. Notably, hypoxic CDCs were able to switch to anaerobic glycolytic metabolism and had approximately 80% lower oxygen consumption, suggesting that they may be better adapted to survive within the hypoxic infarct scar, compared with normoxic CDCs. Culture of CDCs with hypoxia-mimicking prolyl-4-hydroxylase inhibitors (PHDIs) using DMOG, BIC and a novel compound, EDBA, induced similar effects to hypoxic culture by increasing c-Kit, EPO, VEGF, CXCR-4, decreasing CD90 and CD105 and increasing glycolytic metabolism. However, PHDI treatment for 24 hours did not alter CDC proliferation rates and cells died after 24 hours. In conclusion, CDCs are a potential cell source for therapy after myocardial infarction and their therapeutic potential can be enhanced using hypoxia or PHDI-preconditioning techniques.

Abstract Oxygen is vital for human survival. To ensure its sufficient supply, the body has an intricate system, which involves the circulatory, respiratory and neuroendocrine systems. When oxygen is lacking, a state of hypoxia occurs, and adaptive changes in gene expression increase oxygen delivery to promote survival. The key regulator of the transcriptional hypoxia response is hypoxia-inducible factor (HIF) which targets over 1000 genes. The HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs) govern the stability of HIF in an oxygen-dependent fashion. In our studies we investigated whether activation of the hypoxia response through inhibition of either of two distinct HIF-P4Hs, HIF-P4H-2 or P4H-TM would reduce atherosclerosis in mice. We found that inhibition of HIF-P4H-2 led to reductions in numbers of atherosclerotic plaques, and levels of serum cholesterol and inflammation in white adipose tissue and aortic plaques. In addition, HIF-P4H-2 deficient mice had elevated levels of modified LDL-targeting, atheroprotective circulating autoantibodies. The P4H-TM knockout mice also had reduced numbers of atherosclerotic plaques and increased levels of atheroprotective autoantibodies in their sera, but in contrast to the HIF-P4H-2 deficient mice, they also showed a reduction in serum triglyceride levels. To determine how hypoxia alters maternal glucose and lipid metabolism in pregnancy, we studied pregnant mice that were predisposed to a hypoxic condition (15% ambient O2). We found that they had enhanced glucose metabolism due to reduced insulin resistance and an increased flux of glucose to maternal tissues. The hypoxic dams also failed to gain weight and store adipose tissue in the anabolic phase to the same extent as normoxic control dams. These results implicate HIF-P4H inhibition as a novel therapeutic mechanism for atherosclerosis, and suggest that the small molecule HIF-P4H inhibitors currently in clinical trials for renal anemia may have further possible therapeutic applications. In addition, greater understanding of the changes in maternal metabolism that underly reduced fetal growth in hypoxic conditions, and the development of targeted interventions may allow the preservation of fetal growth in cases of maternal hypoxia. / Tiivistelmä Happi on ihmiselle elintärkeää. Tämän vuoksi meille on kehittynyt pitkälle jalostunut verenkierto-, hengitys- ja neuroendokriininen järjestelmä sekä sellaisten geenien ilmentymisen muutoksia, jotka joko lisäävät hapen kuljetusta tai auttavat selviytymään hypoksisissa oloissa, jotta taataan riittävä hapen saanti. Hapen puutteessa hypoksiavaste, jonka tärkein säätelijä on hypoksiassa indusoituva transkriptiotekijä (HIF), aktivoituu. HIF:lla on yli 1000 kohdegeeniä joiden kautta sen vaikutukset välittyvät. HIF-prolyyli-4-hydroksylaasit (HIF-P4H:t) säätelevät HIF:n stabiilisuutta hapesta riippuvaisesti. Tutkimuksessamme selvitimme, vähentääkö hypoksiavasteen aktivointi HIF-P4H-2:n tai P4H-TM:n inhibition kautta ateroskleroosia hiirillä. Tuloksena oli, että HIF-P4H-2:n inhibitio vähensi ateroskleroottisia plakkeja, seerumin kolesterolia ja inflammaatiota valkoisessa rasvakudoksessa sekä plakeissa. Lisäksi hiirillä, joilta puuttui HIF-P4H-2, oli lisääntynyt määrä ateroskleroosilta suojaavia muokattua LDL:ää sitovia autovasta-aineita seerumissa. P4H-TM-poistogeenisillä hiirillä todettiin vastaavasti vähemmän ateroskleroottisia plakkeja ja lisääntynyt määrä ateroskleroosilta suojaavia autovasta-aineita seerumissa. Poiketen HIF-P4H-2-puutteisista hiiristä, niillä oli matalammat seerumin triglyseridi-tasot. Tutkimme raskaina olevia hiiriä, jotka altistimme hypoksisille olosuhteille (15% O2), jotta pystyisimme määrittämään, kuinka hypoksia vaikuttaa äidin sokeri- ja rasva-aineenvaihduntaan. Hypoksiassa raskaana olevilla hiirillä todettiin tehostunut sokeriaineenvaihdunta, joka oli seurausta alentuneesta insuliiniresistenssistä sekä lisääntyneestä sokerin sisäänotosta äidin kudoksiin. Hypoksiassa eivät raskaana olevien hiirten paino eivätkä rasvavarastot lisääntyneet samassa suhteessa normoksiassa raskaana olevien hiirten kanssa. Nämä tulokset tarjoavat uusia mahdollisuuksia HIF-P4H-inhibition käyttämiseen terapeuttisena vaihtoehtona ateroskleroosin hoidossa ja ehkäisemisessä. Kliinisissä kokeissa munuaisperäisen anemian hoidossa olevat HIF-P4H-estäjät voisivat näin ollen saada lisää indikaatioita. Lisäksi korkean ilmanalan aiheuttaman pienipainoisuuden takana olevien aineenvaihdunnan muutoksien ymmärtäminen voi mahdollistaa sikiön kasvun turvaamisen spesifein interventioin.

Abstract Collagens are subject to extensive post-translational modifications, including the formation of 4-hydroxyproline, 3-hydroxyproline and hydroxylysine. These reactions are catalyzed by collagen prolyl 4-hydroxylases (C-P4Hs), prolyl 3-hydroxylases (P3Hs) and lysine hydroxylases (LHs), which belong to the 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase family and require oxygen for their reaction. 4-Hydroxyproline residues have for a long time been known to be required for the stability of the collagen triple helix, but the role of prolyl 3-hydroxylation was revealed only a few years ago when mutations in P3H1 and the consequent loss of a single 3-hydroxyproline in collagen I was shown to cause recessive osteogenesis imperfecta. In this thesis the human P3H isoenzymes were expressed as recombinant enzymes, and analyses of their tissue expression and kinetic properties revealed that P3H2 is located in tissues rich in basement membranes and that it hydroxylates collagen IV, the major basement membrane collagen. The roles of the collagen hydroxylases and collagen IV in basement membrane formation were further studied using Madin-Darby canine kidney (MDCK) epithelial cells as an in vitro model for cell polarization. 4-Hydroxyproline also has a pivotal role in the system of cellular response to reduced oxygen levels (hypoxia). At a normal oxygen concentration, two proline residues in the α subunit of the hypoxia-inducible factor (HIF) are 4-hydroxylated by the HIF-P4Hs, which target HIF-α for proteasomal degradation. In hypoxia, the HIF-P4Hs are inactive, and the α subunit thus escapes degradation, dimerizes with a β subunit and after recruiting transcriptional coactivators induces the transcription of hypoxia-responsive genes in order to adapt the cell to hypoxia. Three human HIF-α subunits have been characterized to date, of which the third is known to be subject to extensive alternative splicing, with one of the splicing variants acting as a negative regulator of the hypoxia responsive system. Four novel splicing variants generated from the human HIF-3α locus are characterized here, and the expression of HIF-3α variants has been shown to be upregulated by hypoxia in a HIF-1 dependent manner. Further studies on the binding partners and transcriptional activity of HIF-3α revealed that this subunit has a more complex role in the adaptation of cells to hypoxia than had been expected. / Tiivistelmä Kollageenit ovat valkuaisaineita, joihin kohdistuu useita synteesin jälkeisiä muokkauksia kuten 4-hydroksiproliinin, 3-hydroksiproliinin ja hydroksilysiinin muodostuminen. Näitä reaktioita katalysoivat kollageeniprolyyli-4-hydroksylaasit (C-P4H:t), prolyyli-3-hydroksylaasit (P3H:t) ja lysyylihydroksylaasit (LH:t), jotka kuuluvat 2-oksoglutaraattidioksygenaasien entsyymiperheeseen ja tarvitsevat happea reaktioonsa. 4-hydroksiproliinitähteiden on kauan tiedetty stabiloivan kollageeninrakenteen, kun taas 3-hydroksiproliinitähteiden merkitys on selvinnyt vasta viime vuosina. Mutaatiot P3H1-isoentsyymiä koodittavassa geenissä ja sen seurauksena yhden ainoan 3-hydroksiproliinitähteen puuttuminen kollageenissa I johtavat vaikeaan luustosairauteen, osteogenesis imperfectaan. Tässä väitöskirjassa ihmisen P3H:t tuotettiin rekombinanttiproteiineina. Tulokset paljastivat, että P3H2 ilmentyy erityisesti kudoksissa, joissa on paljon tyvikalvorakenteita ja että P3H2 hydroksyloi tehokkaasti kollageeni IV:n kaltaisia synteettisiä peptidejä. Lisäksi koiran munuaisten epiteelisoluihin pohjautuvaa in vitro-mallia käytettiin apuna tutkiessamme kollageeneja hydroksyloivien entsyymien ja kollageenin IV roolia tyvikalvon muodostumisessa sekä solujen polarisaatiossa. Kollageenia stabiloivan tehtävänsä lisäksi 4-hydroksiproliinilla on myös merkittävä rooli solujen vasteessa vähähappisille olosuhteille (hypoksia). Normaalissa happiosapaineessa (normoksia), hypoksiaindusoituvan tekijän (HIF) α-alayksikköön muodostuu HIF-P4H entsyymien katalysoimana kaksi 4-hydroksiproliinitähdettä, jotka kohdistavat α-alayksikön proteasomaaliseen hajotukseen. Hypoksiassa HIF-P4H:t eivät kykene toimimaan, jolloin α-alayksikkö säästyy hajotukselta, muodostaa kompleksin β-alayksikön kanssa ja sitoo transkriptiokofaktoreita. HIF-kompleksi kykenee tällöin lisäämään hypoksiassa tarvittavien geenien luentaa. Tänä päivänä tunnetaan kolme HIF α-alayksikköä, joista HIF-3α:sta tiedetään esiintyvän useita erilaisia silmukointimuotoja ja yhden näistä muodoista tiedetään toimivan negatiivisena säätelijänä hypoksiavasteessa. Tässä väitöskirjatyössä on tunnistettu neljä uutta HIF-3α:n silmukointimuotoa ja osoitettu että HIF-3α:n määrä kasvaa hypoksiassa HIF-1:n säätelemänä. Lisäksi sitoutumis- ja transkriptiokokeet paljastivat, että HIF-3α:n rooli hypoksiavasteessa on monimutkaisempi kuin aikaisemmin kuviteltiin.

Abstract Adequate oxygen supply is necessary for aerobic cell survival. Cellular oxygen deprivation, also known as hypoxia, leads to various responses that aim to increase cellular oxygen delivery and reduce oxygen consumption. Oxygen homeostasis is mainly regulated by the hypoxia-inducible factor (HIF), which regulates the expression of over 300 genes in response to hypoxia. The stability of HIF is regulated by the HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs), enzymes that catalyze the hydroxylation of proline residues in HIFα subunits and target them towards proteasomal degradation. HIF-P4Hs require oxygen as a cosubstrate for the reaction, allowing for hypoxic HIF stabilization and target gene induction at low oxygen concentrations. In this study we investigated the role of HIF-P4H-2 in the regulation of red blood cell production, erythropoiesis. We showed that Tibetans living at high altitude have genetically adapted to their hypoxic environment via mutations in the gene encoding for HIF-P4H-2. The Tibetan HIF-P4H-2 D4E,C127S variant showed enhanced hydroxylation of HIFα at low oxygen concentrations, resulting in reduced HIFα protein stabilization under hypoxia. In other studies we used a genetically modified HIF-P4H-2 hypomorphic mouse line which expresses a reduced amount of wild-type Hif-p4h-2 mRNA in tissues. We showed that these mice develop mild age-dependent erythrocytosis due to splenic extramedullary erythropoiesis, which is independent of serum erythropoietin concentration. In addition, these mice were protected against inflammation-induced anemia, a condition commonly seen in patients with inflammatory diseases. The HIF-P4H-2 hypomorphic mice also had altered basal metabolism in their skeletal muscles, which, together with an increase in mean capillary area, reduced their infarct size after skeletal muscle ischemia-reperfusion injury. These studies suggest that pharmacological HIF-P4H-2 inhibition may provide a novel treatment for EPO-resistant anemias and peripheral artery disease. / Tiivistelmä Riittävä hapensaanti on välttämätöntä aerobisten solujen selviytymiselle. Solun alentunut hapen määrä, toiselta nimeltään hypoksia, johtaa useisiin vasteisiin joiden tarkoituksena on turvata solun hapensaanti ja vähentää hapenkulutusta. Happitasapainoa säätelee hypoksiassa indusoituva tekijä (HIF), joka aktivoi yli 300 geenin luentaa hypoksisissa oloissa. HIFα:n määrää soluissa säätelevät HIF prolyyli-4-hydroksylaasientsyymit (HIF-P4H:t), jotka hydroksyloivat proliini-aminohappotähteitä HIFα-alayksiköissä ja ohjaavat ne proteasomaaliseen hajotukseen. HIF-P4H:t tarvitsevat reaktiossa happea mahdollistaen HIF:n stabilisaation ja kohdegeenien lisääntyneen luennan matalassa hapen osapaineessa. Tässä tutkimuksessa selvitimme HIF-P4H-2-entsyymin roolia punasolujen muodostuksen eli erytropoieesin säätelyssä. Osoitimme, että korkealla vuoristossa asuvat tiibetiläiset ovat geneettisesti sopeutuneet hypoksiseen elinympäristöönsä johtuen HIF-P4H-2-entsyymiä tuottavan geenin mutaatiosta. Tiibetiläisiltä löytynyt HIF-P4H-2D4E,C127S variantti hydroksyloi tehokkaammin HIFα-alayksiköitä matalassa hapen osapaineessa johtaen vähäisempään HIFα-alayksiköiden stabiloitumiseen hypoksiassa. Muissa tutkimuksissamme käytimme geneettisesti muunneltua HIF-P4H-2-hiirikantaa, joka tuottaa alentunutta määrää villityypin Hif-p4h-2 lähetti-RNA:ta kudoksissaan. Näille hiirille kehittyi ikäriippuvaisesti lievä punasoluylimäärä eli erytrosytoosi johtuen pernan kiihtyneestä punasolutuotannosta riippumatta seerumin erytropoietiinikonsentraatiosta. Lisäksi nämä hiiret olivat suojassa tulehduksen aiheuttamalta anemialta, joka on yleinen ilmiö tulehduksellisista sairauksista kärsivillä potilailla. HIF-P4H-2-muuntogeenisten hiirten lihasten energia-aineenvaihdunta oli muuttunut siten, että se yhdessä suurentuneen keskimääräisen kapillaaripinta-alan kanssa pienensi vaurioituneen kudoksen pinta-alaa alaraajaiskemia-altistuksen jälkeen. Nämä tutkimukset osoittavat, että lääkkeellinen HIF-P4H-2-entsyymin estäminen on mahdollinen uusi hoitomuoto erytropoietiinille resistenteissä anemioissa sekä alaraajojen valtimoahtaumataudissa.