Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La famille des Flexiviridae a été créée en 2004 et regroupe plusieurs genres viraux affectant particulièrement des espèces ligneuses dont des arbres fruitiers. Grâce à diverses approches plusieurs nouveaux Flexiviridae ont été partiellement caractérisés au cours de ces dernières années. En revanche la position taxonomique précise de certains d’entre eux et leur contribution à des pathologies particulières restent encore incertaines du fait de difficultés inhérentes à l’étude de ces agents. Dans le présent travail, nous avons obtenu les séquences génomiques complètes pour quatre agents proches de l’Apricot latent virus. Ceci a permis de préciser l’organisation génomique de ces virus et d’en déterminer la position taxonomique. Cette étude a également permis de montrer que la partie C-terminale de la capside et la protéine TGBp1 sont soumises à une pression sélective particulièrement forte. Dans un second volet de ce travail, plusieurs approches permettant l’obtention simple et rapide d’ADNc infectieux, sous forme clonée ou non ont été développées. Travaillant sur plusieurs Flexiviridae, dont le virus des taches foliaires chlorotiques du pommier (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV), nous avons mis au point l’amplification d’ADNc génomiques complets en une seule étape à partir d’extraits d’acides nucléiques totaux obtenus à partir de plantes infectées. Des amplifiats comportant l’ADNc viral sous le contrôle du promoteur 35S du CaMV ou du promoteur de la RNA polymérase du phage T7 ont été obtenus et utilisés pour infecter des plantes directement par biolistique (promoteur 35S) ou pour obtenir des ARN infectieux par transcription in vitro (promoteur T7). Ces données ont mis en évidence des différences importantes dans le comportement de deux hôtes de l’ACLSV, Chenopodium quinoa et Nicotiana occidentalis 37B. Nous avons également utilisé le système de recombinaison homologue de la levure Saccharomyces cerevisiae simplifier le clonage d’ADNc complets amplifiés par PCR ou pour réaliser en une seule étape la construction d’un vecteur navette ternaire levure-E. coli-A. tumefaciens et l’obtention d’un clone ADNc de l’ACLSV inoculable par agroinfiltration. Ces différentes stratégies devraient trouver une large application, en particulier pour tester plus rapidement des hypothèses d’étiologie pour les virus de plantes réputés "difficiles", tels que ceux infectant des hôtes ligneux. / The Flexiviridae family was created in 2004 and contains several viral genera affecting in particular woody hosts, including fruit trees. Using various strategies several new Flexiviridae have been partially characterized in the past few years. However, due to difficulties inherent in studying these agents, the precise taxonomic position of some of them and their contribution to particular diseases are still uncertain. In the present work, the complete genomic sequences of four Prunus-infecting Apricot latent virus (ApLV) like isolates have been determined. This has allowed to determine the genomic organization and the taxonomic position of these viruses. The results obtained also indicate that the C-terminal half of the coat protein and the TGBp1 are the genomic regions under the strongest purifying selection pressure. In the second part of this work, a set of approaches to simplify and streamline the construction of cloned or uncloned infectious full-length viral cDNAs were developed. working with several Flexiviridae and, in particular, with the Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), we have developed protocols allowing the one-step amplification from total nucleic acids extracts of full-length cDNAs. under the control of the CaMV 35S or phage T7 RNA polymerase promoters. Successful inoculation of plants with these uncloned amplification products was obtained by biolistic bombardment (35S promoter) or using in vitro synthesized RNA transcripts (T7 promoter). Results obtained showed significant differences in the behavior of the two ACLSV hosts, Chenopodium quinoa and Nicotiana occidentalis 37B. We also used the yeast homologous recombination system for the efficient cloning of full-length cDNAs and for the simultaneous one-step construction of a ternary yeast-E. coli-Agrobacterium tumefaciens shuttle vector and generation of an agroinfiltrable infectious ACLSV construct. These various strategies should find broad applications, in particular for the validation of etiological hypotheses in the case of “difficult” plant viruses, such as those infecting woody hosts.

Acinetobacter baumannii est un pathogène opportuniste qui prend une importance clinique croissante du fait de l’acquisition de multi-résistance. Nous avons étudié chez A. baumannii les caractéristiques et la régulation des intégrons de classe 1 (IM1) qui sont des systèmes génétiques favorisant l’acquisition, l’expression et la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques. Nous avons montré qu’il existe une prédominance des promoteurs des cassettes Pc fort in vivo dans une collection d’isolats cliniques et d’environnement hospitalier et in silico dans les IM1 chez A. baumannii. Nous avons aussi montré que l’expression des Pc chez A. baumannii est 4 fois plus faible que chez E. coli, quel que soit le variant de Pc. Deux explications sont possibles pour la sélection des Pc forts chez A. baumannii : (i) la nécessité d’avoir un niveau d’expression suffisant en clinique pour survivre à la pression de sélection antibiotique et (ii) la nécessité d’une régulation de l’expression de l’intégrase, représentant un coût biologique important. En effet, A. baumannii ne possède pas le système de répression par LexA existant chez E. coli. Nos résultats ouvrent le champ de l’étude de la régulation des IM1 chez A. baumannii et ainsi l’identification de nouvelles voies d’action pour lutter contre l’antibio-résistance / Acinetobacter baumannii is an opportunistic pathogen of increasing clinical importance due to the acquisition of multi-resistance. We studied in A. baumannii the characteristics and regulation of class 1 integrons (IM1), which are genetic systems that favor the acquisition, expression and dissemination of antibiotic resistance genes. We have shown that there is a predominance of strong Pc cassette promoters, in vivo, in a collection of clinical and hospital environment isolates, and in silico, from A. baumannii IM1 published in NCBI. We have also shown that the expression of Pc in A. baumannii is 4-fold lower than in E. coli, regardless of the Pc variant. Explanations that can be raised for the selection of strong Pc in A. baumannii are: (i) the need for a sufficient level of antibiotic resistance expression to survive the selection pressure in clinical environment; and (ii) the need for regulation of the integrase expression, which is of significant biological cost. Indeed A. baumannii does not have the LexA repression system existing in E. coli. Our results open the field of the study of IM1 regulation in A. baumannii and thus the identification of new pathways to fight antibiotic resistance.

Les viroïdes sont de petits ARN circulaires simple brin qui infectent les plantes supérieures, causant ainsi d'importantes pertes économiques dans les domaines agro-alimentaire et horticole. Ces ARN ne sont pas encapsidés, ne possèdent pas de région codante et se répliquent de façon presque autonome par un mécanisme en cercle roulant. La seule étape du cycle de vie des viroïdes qui requiert la machinerie de l'hôte est la polymérisation de l'ARN. Par ailleurs, cette étape est certainement la moins bien connue, particulièrement chez le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd). Le but de ce travail est de découvrir des séquences importantes pour l'initiation de la réplication d'une molécule modèle d'ARN inspirée du PLMVd. Un protocole de sélection de promoteur en ARN a d'abord été mis au point. Dans ce type de protocole, des étapes pertinemment désignées s'enchaînent sous forme de cycles afin de sélectionner une molécule d'intérêt. Toutes les étapes constituant le complexe protocole ont été testées avec un témoin positif, basé sur une région minimale du PLMVd connue pour initier la réplication in vitro. Cette molécule a servi à la vérification et à l'optimisation individuelles des nombreuses étapes. Ce protocole amélioré a ensuite été utilisé pour sélectionner des molécules reconnues par l'ARNP d' E. coli à partir d'une population aléatoire d'ARN. Cette sélection a permis l'isolement de plusieurs variants qui ont rapidement montré des ressemblances en terme de séquence primaire au cours des cycles de sélection. En effet, sur trente positions aléatoires, une boite de six nucléotides (CAGACG) se retrouvant à divers endroits est apparue au quatrième cycle puis a été retrouvée presque intégralement dans toutes les séquences à partir du cinquième cycle. Une investigation sur cette boîte a mis en évidence une analogie avec une séquence retrouvée près du site d'initiation in vivo du PLMVd ainsi qu'avec des produits de sélection pour un promoteur ADN simple brin. Ceci semble pointer vers des éléments impliqués dans la réplication dépendante de l'ARN polymérase d'E. coli . L'effet de la boîte conservée CAGACG sur la réplication a été étudié. Le patron de réplication de molécules dont la boite a été modifiée (délétion ou modification) est distinct de celui de la molécule originale. Aussi, l'analyse de la séquence des petits ARN (pARN) produits lors de la réplication révèle l'implication des 6 nt pour fixer l'initiation de la polymérisation. En conclusion, ces résultats s'ajoutent aux évidences qui mèneront vers la découverte des séquences nécessaires à la réplication d'une molécule modèle d'ARN, autant in vitro (reconstitution d'un monde ARN) que in vivo (dans les viroïdes).

Résumé : Le cadre de compétence CanMEDS définit les rôles attendus des médecins canadiens, mais fait l’objet de certaines critiques. Par exemple, la définition et l’adoption du rôle de promoteur de la santé semblent problématiques, entre autres en ce qui a trait à une dualité implicite entre des actions de type individuel et collectif. Cette étude visait à identifier les facteurs qui influencent l’intention d’adopter des comportements associés au rôle de promoteur de la santé et à en comparer les variables prédictives selon le type d’action. Une étude transversale descriptive a été réalisée utilisant un questionnaire web élaboré selon les principes de la Théorie du comportement planifié d’Ajzen. Le questionnaire a été envoyé par courriel en 2013 à tous les résidents en médecine de famille des universités francophones du Québec. Soixante-huit résidents (7%) ont complété le questionnaire. L’importance du rôle pour les participants et la pression sociale perçue étaient particulièrement significatives dans la prédiction de l’intention d’adopter des comportements associés au rôle de promoteur de la santé (variance expliquée de 26%, p<0.001; et 48%, p<0.001; respectivement). Les résidents participants avaient également une attitude plus positive envers les actions de type individuel (moyenne =72,8% vs 58,3%, p<.05), et percevaient plus de pression à adopter celles-ci (moyenne = 82.7% vs 74.3%, p<.05). Ils ressentaient moins de contrôle quant à l’adoption d’action de type collectif (moyenne = 79.8% vs 84.6%, p<.05). Étant donné que différents types d’action sont associés au rôle de promoteur de la santé, l’intention d’adopter ce rôle peut être influencée par différents facteurs. Une redéfinition éventuelle du rôle devrait prendre en compte cette dualité et les interventions pédagogiques devraient être modulées en conséquence. // Abstract : The CanMEDS framework defines the roles and competencies for all Canadian physicians. It is widely used but fraught with challenges, particularly concerning the understanding and adoption of the health advocate role, which includes both individual and collective type actions. This study aimed to identify the factors that influence the intention to adopt this role by family medicine residents and to compare their intention related to individual versus collective type actions. A cross sectional descriptive study was designed using a web questionnaire based on the theory of planned behaviour elaborated by Ajzen. The questionnaire was sent by email in 2013 to all family medicine residents from francophone programs in Quebec. Sixty-eight residents (7%) completed the questionnaire. The importance of the role for participants and social pressure were particularly influential factors regarding the intention to adopt behaviours associated with the health advocate role (26% variance explained p < 0.001 and 48% p < 0.001 respectively). Residents also had a more favourable attitude towards individual type actions (mean =72,8% vs 58,3%, p<.05), and perceived more pressure to adopt them (mean = 82.7% vs 74.3%, p<.05). They perceived less control towards collective-type actions (mean = 79.8% vs 84.6%, p<.05). Since different types of action are associated with the health advocate role, intention to adopt the role can be influenced by different factors. Future revisions of the role should take into account the implicit duality of the role focusing on both individual and collective type actions and pedagogical interventions should be tailored accordingly.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les Glioblastomes représentent les tumeurs cérébrales primaires les plus fréquentes chez l'adulte. Nous avons mis en évidence le rôle du récepteur PPARß/delta dans le caractère tumoral des glioblastomes. Nous avons montré que l'activation de ce récepteur stimule la prolifération et la migration des cellules de glioblastome T98G. Nous avons également montré que l'activation de PPARß/delta induit l'expression du gène Siah-1L et que la surexpression de ce gène stimule la prolifération et la migration cellulaire des glioblastomes. Nous avons ensuite étudié la régulation du gène Siah-1L humain et montré que son expression est induite par PPARß/delta. Le clonage du promoteur de ce gène et l'étude de sa régulation a permis de montrer que son induction par PPARß/delta est médiée par un élément de réponse situé au niveau du promoteur / Glioblastoma represent the most frequent primary brain tumor in adults. We highlighted the role of PPARß/delta in glioblastoma tumorigenesis. We have shown that activation of this receptor stimulates proliferation and migration of glioblastoma cells T98G. We also showed that activation of PPARß/delta induces the expression of Siah-1L gene and that overexpression of Siah-1L stimulates cell proliferation and migration of glioblastoma cells. We also studied the regulation of Siah-1L gene and showed that its expression is induced by PPARß/delta. Cloning of Siah-1L gene promoter sequence and the study of its regulation showed that the induction of the expression of Siah-1L by PPARß/delta is mediated by a response element located at the promoter sequence

Les sites de fixation des facteurs de transcription ou éléments régulateurs sont impliqués dans la régulation de l'expression des gènes. Une meilleure connaissance de l'architecture des promoteurs est aujourd'hui accessible via l'annotation des génomes et les données transcriptomiques. Certains éléments régulateurs sont conservés à une position préférentielle dans les promoteurs. Chez A. thaliana, nous avons mis au point une approche pour caractériser de tels motifs. Ce travail a permis de proposer une cartographie des promoteurs en identifiant 5105 motifs caractérisés par une sur-représentation locale dans les promoteurs proximaux. L'étude du promoteur central où est observée la boîte TATA, élément régulateur conservé entre eucaryotes, a été approfondie. Une liste de 15 variants fonctionnels de la boîte TATA a été identifiée, ainsi qu'une nouvelle classe d'éléments régulateurs qui sont caractérisés par des mêmes contraintes topologiques que la boîte TATA : les motifs-TC. Ils sont conservés chez A. thaliana et le riz, Oryza sativa, mais absents chez les mammifères. Les 18% de gènes d'A. thaliana contenant un motif-TC ont tendance à être exprimés dans des conditions expérimentales spécifiques. Ces éléments pourraient participer à la régulation de l'expression des gènes. L'étude de l'élément initiateur YR chez A. thaliana a mis en évidence une extension de ces 4 dinucléotides dans l'UTR 5'. Des associations entre ces éléments régulateurs peuvent montrer une collaboration fonctionnelle. La recherche de caractéristiques fonctionnelles communes aux gènes possédant une même organisation d'éléments régulateurs pourra permettre de contribuer à l'annotation fonctionnelle de ces éléments.

c-fos est un proto-oncogène et un gène de réponse précoce. Son activation transcriptionnelle est très rapide et transitoire, ce qui suggère un contrôle très strict.<br />Au cours de ma thèse, nous avons abordé deux aspects de la régulation transcriptionnelle de c-fos par des séquences intragéniques. Le premier consiste en un blocage de l'allongement des transcrits dans le premier intron, dont nous avons montré qu'il intervient dans les fibroblastes Ltk-, comme cela avait été découvert dans les macrophages. Ce blocage est levé par l'augmentation de la concentration en calcium intracellulaire, et nous avons montré que ce phénomène est indépendant des CaM-Kinases et de la calcineurine, mais implique la calmoduline dans une nouvelle voie de signalisation.<br />Dans la seconde partie de mon travail de thèse, nous avons identifié, en aval de la région décrite ci-dessus, une nouvelle séquence intronique très fortement conservée qui possède les caractéristiques d'un promoteur. Nous avons montré que ce promoteur est fonctionnel en transfection transitoire, ce qui nous a encouragé à recourir aux souris transgéniques pour explorer ses territoires d'expression au cours du développement. Nos résultats préliminaires montrent que cette expression semble être limitée au système nerveux et aux glandes mammaires en développement.<br />Nous avons donc étudié deux régions régulatrices de la transcription de c-fos qui sont proches dans le gène, ce qui suggère un dialogue entre ces différentes fonctions.

Le récepteur nucléaire FXR (NR1H4) possède quatre isoformes exprimés principalement dans le foie (FXR[alpha]1 et FXR[alpha]2) et dans l'intestin (FXR[alpha]3 et FXR[alpha]4). Le rôle de FXR dans l'homéostasie des acides biliaires au sein du système digestif est bien documenté. Récemment, de nouvelles fonctions ont été attribuées à FXR dans l'intestin et une étude de ChIP-seq montre que les sites de liaison de FXR dans le génome diffèrent entre le foie et l'intestin. Notre hypothèse de recherche est que FXR contribue au maintien d'un épithélium intestinal intègre et fonctionnel en influençant des processus biologiques autres que la régulation de l'absorption des acides biliaires, et ce, par l'activation de la transcription de nouveaux gènes cibles dans l'intestin. Notre premier objectif consistait en l'identification de nouvelles cibles transcriptionnelles de FXR. Le modèle cellulaire Caco-2/15 est utilisé comme modèle d'entérocytes différenciés et l'expression de FXR augmente lors de la différenciation de ces cellules pour atteindre un niveau maximal vers 20 jours post-confluence. Dans ces cellules bien différenciées, une expérience de micro-puce à ADN révèle que l'activation de FXR par son agoniste synthétique le GW 4064 module significativement l'expression de gènes associés à différents processus biologiques tels l'organisation du cytosquelette et l'adhésion biologique. Nous avons confirmé que l'expression des gènes des protéines structurales MYO1A, MYO7A et DST est régulée positivement par l'activation de FXR, sans doute de manière indirecte puisque nous n'avons pas observé par ChIP que FXR se liait au promoteur de ces gènes. Pour identifier de nouvelles cibles directes de FXR, un criblage par qPCR selon divers critères a été réalisé. Ainsi, nous avons confirmé que le gène de SLC20A1, un transporteur de phosphore, est régulé positivement par l'activation de FXR. De plus, selon nos essais de ChIP, FXR se lie au promoteur de SLC20A1 suggérant une activation directe de la transcription. Ces résultats ouvrent la voie à un rôle auparavant insoupçonné de FXR dans des processus liés à l'absorption du phosphore. Notre deuxième objectif qui était d'étudier la régulation de l'expression différentielle des isoforme de FXR a été réalisé par des essais luciférase et nous amène à croire que le promoteur des isoformes intestinaux est régulé par la présence du facteur de transcription Cdx2. En effet, le promoteur FXR[alpha]3/[alpha]4 présente un site de liaison à Cdx2 contrairement au promoteur FXR[alpha]1/[alpha]2. De plus, en contexte où les facteurs hépatiques et intestinaux HNF1[alpha] et HNF4[alpha] sont présents, Cdx2 rétablit un fort niveau d'activité au promoteur FXR[alpha]3/[alpha]4 et non au promoteur FXR[alpha]1/[alpha]2. Pour conclure, ce projet de recherche montre bien que FXR dans un modèle mimant un contexte physiologique est capable d'activer des gènes cibles jusqu'ici inconnus et que l'expression des isoformes intestinaux est régulée de façon distincte par Cdx2 dans ce tissu.