Abscisic acid (ABA) is a major plant hormone that plays an important role during plant growth and development. During vegetative growth ABA mediates (in part) responses to various environmental stresses such as cold, drought and high salinity. The response triggered by ABA includes changes in the transcript level of genes involved in stress tolerance. The aim of this project was the In silico identification of genes putatively regulated by ABA in A. thaliana. In silico predictions were combined with experimental data in order to evaluate the reliability of computational predictions.<br><br> Taking advantage of the genome sequence of <i>A. thaliana</i> publicly available since 2000, 1 kb upstream sequences were screened for combinations of cis-elements known to be involved in the regulation of ABA-responsive genes. It was found that around 10 to 20 percent of the genes of <i>A. thaliana</i> might be regulated by ABA.<br><br> Further analyses of the predictions revealed that certain combinations of cis-elements that confer ABA-responsiveness were significantly over-represented compared with results in random sequences and with random expectations. In addition, it was observed that other combinations that confer ABA-responsiveness in monocotyledonous species might not be functional in A. thaliana. It is proposed that ABA-responsive genes in <i>A. thaliana</i> show pairs of ABRE (abscisic acid responsive element) with MYB binding sites, DRE (dehydration responsive element) or with itself.<br><br> The analysis of the distances between pairs of cis-elements suggested that pairs of ABREs are bound by homodimers of ABRE binding proteins. In contrast, pairs between MYB binding sites and ABRE, or DRE and ABRE showed a distance between cis-elements that suggested that the binding proteins interact through protein complexes and not directly.<br><br> The comparison of computational predictions with experimental data confirmed that the regulatory mechanisms leading to the induction or repression of genes by ABA is very incompletely understood. It became evident that besides the cis-elements proposed in this study to be present in ABA-responsive genes, other known and unknown cis-elements might play an important role in the transcriptional regulation of ABA-responsive genes. For example, auxin-related cis elements, or the cis-elements recognized by the NAM-family of transcription factors (Non-Apical meristem).<br><br> This work documents the use of computational and experimental approaches to analyse possible interactions between cis-elements involved in the regulation of ABA-responsive genes. The computational predictions allowed the distinction between putatively relevant combinations of cis-elements from irrelevant combinations of cis-elements in ABA-responsive genes. The comparison with experimental data allowed to identify certain cis-elements that have not been previously associated to the ABA-mediated transcriptional regulation, but that might be present in ABA-responsive genes (e.g. auxin responsive elements). Moreover, the efforts to unravel the gene regulatory network associated with the ABA-signalling pathway revealed that NAM-transcription factors and their corresponding binding sequences are important components of this network. / Pflanzen reagieren auf aeußere Stresseinwirkung (z.B. Trockenheit oder Hitze) u.a. mit der Bildung bestimmter Hormone. Diese Hormone wiederum bewirken eine Vielzahl komplexer Reaktionen (z.B. im Stoffwechsel und in der Genexpression), die zum Ziel haben, die Pflanzen widerstandsfaehiger gegen die Stresssituation zu machen. Ein wichtiges Stresshormon ist die Abzisinsaeure (ABA, fuer engl. „abscisic acid“). Experimentell koennen Pflanzen durch die Gabe von ABA zu Reaktionen gezwungen werden, die normalerweise nur unter Stressbedingungen beobachtet werden. Hierzu zaehlen vor allem eine Reduktion der Spaltoeffnungen in den Blaettern, um den Wasserverlust infolge von Transpiration zu minimieren, und eine massive Umprogrammierung der Genexpression.<br><br> In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von ABA auf die Genexpression in der Modellpflanze <i>Arabidopsis thaliana</i> untersucht. Hierzu wurden bioinformatorische und experimentelle Ansaetze verknuepft. Die bioinformatorischen Ansaetze bedienten sich der bekannten Sequenz des Genoms von <i>A. thaliana</i>. Mit Hilfe verschiedener geeigneter Computerprogramme wurden im Genom Gene identifiziert, deren Expression potentiell durch ABA reguliert wird. Die so erhaltenen Vorhersagen der verschiedenen Programme wurden miteinander und mit eigenen als auch mit publizierten experimentellen Daten verglichen, um die Qualitaet der Vorhersagen zu beurteilen. <br><br> Die wichtigste Schlussfolgerung aus den Ergebnissen dieser Arbeit ist, dass gegenwaertig bioinformatorische Ansaetze allein nicht ausreichen, um biologische Prozesse zufriedenstellend zu analysieren. In der vorliegenden Arbeit ermoeglichte erst eine Kombination aus bioinformatorischen und experimentellen Ansaetzen die Generierung neuer, abgesicherter Hypothesen zur ABA-induzierten Umprogrammierung der Genexpression.

Katholische Univ., Diss.--Eichstädt-Ingolstadt, 2006.

In dieser Arbeit wurde die plastidäre Genexpression hinsichtlich zweier Aspekte untersucht: der Cytokinineinfluss auf die plastidäre Transkription und ihrer Komponenten sowie eine in vivo-Charakterisierung von PrpoB-345, des Promotors des rpoB-Operons im Tabak. Cytokinine beeinflussen die Chloroplastenbiogenese und –funktion. Um den Einfluss von Cytokinin auf die plastidäre Genexpression zu untersuchen, wurden run-on-Transkriptionsassays und quantitative real-time RT-PCR von BA-behandelten seneszenten Tabakblättern und sieben-Tage-alten Arabidopsis- und Tabakpflanzen durchgeführt. Zeitreihenanalysen zeigten eine Aktivierung der plastidären Transkription in jungen Pflanzen und im seneszenten Tabak 2 h bzw. 3 h nach BA-Applikation. Abgeschnittene Blätter von Tabakmutanten mit konstitutiv reduziertem Cytokiningehalt antworteten bereits nach 30 min der Hormonbehandlung. Es gibt jedoch keinen eindeutigen Hinweis für eine direkte Korrelation zwischen der Expression der nukleär kodierten Phagentyp-RNA-Polymerasen und der BA-induzierten transkriptionellen Aktivierung der Plastidengene. Zusammengefasst, scheint die Antwort auf exogenes Cytokinin vom physiologischen Status der Chloroplasten, die von der Pflanzenart sowie vom endogenen Cytokiningehalt beeinflusst werden, abzuhängen. Plastidäre Gene höherer Pflanzen werden von mindestens zwei RNA-Polymerasen transkribiert: die plastidär kodierte RNA-Polymerase vom Bakterientyp (PEP) und die kernkodierte Phagentyp-RNA-Polymerase (NEP). NEP transkribiert das rpoB-Operon, das drei von vier Untereinheiten der PEP kodiert. Transkriptions- und Transkriptanalysen von rpoB-Promotor-Deletionsmutanten ergaben Hinweise auf mögliche Regulationsstellen der Kontrolle der rpoB-Transkription. Neben PrpoB-345 konnten zwei weitere Promotoren kartiert werden. Einer von ihnen ist ein putativer PEP-Promotor, der auf autoregulatorische Rückkopplungsmechanismen bei der PEP-Expression hindeutet. / In this study, plastid gene expression was analyzed focusing on two aspects: the effect of cytokinin on plastid gene transcription and its components, and the in vivo characterization of PrpoB-345, the promoter of the rpoB operon in tobacco. Cytokinins are involved in the control of chloroplast biogenesis and function. To study cytokinin effects on plastid gene expression, chloroplast run-on transcription and quantitative real-time RT-PCR from senescent tobacco leaves as well as Arabidopsis and tobacco seedlings after BA treatment were performed. Analyses of time series revealed that BA-induced changes in plastid gene expression are seemingly under circadian and homeostatic control. After 2 h and 3 h of incubation with cytokinin, a stimulation of chloroplast transcription could be observed in seedlings and senescent leaves, respectively. Detached leaves of tobacco mutants with reduced endogenous cytokinin content responded even faster to BA (30 min). There is no indication of direct correlation of the expression of nuclear-encoded plastid phage-type RNA-polymerases and the BA-induced transcriptional activation of plastid genes. In summary, the responsiveness to exogenous cytokinin depends on the physiological status of chloroplasts influenced by plant species and endogenous cytokinin pool. Plastid genes of higher plants are transcribed by at least two RNA polymerases: the plastid-encoded eubacterial-type RNA polymerase (PEP) and the nucleus-encoded phage-type RNA polymerase (NEP). NEP transcribes the rpoB operon encoding three of four subunits of PEP. Transcription and transcript analyses from rpoB promoter deletion mutants indicated putative regulatory sites of control of rpoB transcription which may also interact with (cytokinin-regulated) specificity factors. Beside PrpoB-345, two additional rpoB promoters could be mapped. One of them is a putative PEP promoter which may imply autoregulatory loops of PEP expression.

Durch ihren Einfluß auf die Genexpression reguliert die zirkadiane Uhr physiologische Funktionen vieler Organe. Obwohl der zugrundeliegende allgemeine Uhrmechanismus gut untersucht ist, bestehen noch viele Unklarheiten über die gewebespezifische Regulation zirkadianer Gene. Neben ihrer gemeinsamen 24-h-Periode im Expressionsmuster unterscheiden diese sich darin, zu welcher Tageszeit sie am höchsten exprimiert sind und in welchem Gewebe sie oszillieren. Mittels Überrepräsentationsanalyse lassen sich Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren identifizieren, die an der Regulation ähnlich exprimierter Gene beteiligt sind. Um diese Methode auf zirkadiane Gene anzuwenden, ist es nötig, Untergruppen ähnlich exprimierter Gene genau zu definieren und Vergleichsgene passend auszuwählen. Eine hierarchische Methode zur Kontrolle der FDR hilft, aus der daraus entstehenden Menge vieler Untergruppenvergleiche signifikante Ergebnisse zu filtern. Basierend auf mit Microarrays gemessenen Zeitreihen wurde durch Promotoranalyse die gewebespezifische Regulation von zirkadianen Genen zweier Zelltypen in Mäusen untersucht. Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren CLOCK:BMAL1, NF-Y und CREB fanden sich in beiden überrepräsentiert. Diesen verwandte Transkriptionsfaktoren mit spezifischen Komplexierungsdomänen binden mit unterschiedlicher Stärke an Motivvarianten und arrangieren dabei Interaktionen mit gewebespezifischeren Regulatoren (z.B. HOX, GATA, FORKHEAD, REL, IRF, ETS Regulatoren und nukleare Rezeptoren). Vermutlich beeinflußt dies den Zeitablauf der Komplexbildung am Promotor zum Transkriptionsstart und daher auch gewebespezifische Transkriptionsmuster. In dieser Hinsicht sind der Gehalt an Guanin (G) und Cytosin (C) sowie deren CpG-Dinukleotiden wichtige Promotoreigenschaften, welche die Interaktionswahrscheinlichkeit von Transkriptionsfaktoren steuern. Grund ist, daß die Affinitäten, mit denen Regulatoren zu Promotoren hingezogen werden, von diesen Sequenzeigenschaften abhängen. / A circadian clock in peripheral tissues regulates physiological functions through gene expression timing. However, despite the common and well studied core clock mechanism, understanding of tissue-specific regulation of circadian genes is marginal. Overrepresentation analysis is a tool to detect transcription factor binding sites that might play a role in the regulation of co-expressed genes. To apply it to circadian genes that do share a period of about 24 hours, but differ otherwise in peak phase timing and tissue-specificity of their oscillation, clear definition of co-expressed gene subgroups as well as the appropriate choice of background genes are important prerequisites. In this setting of multiple subgroup comparisons, a hierarchical method for false discovery control reveals significant findings. Based on two microarray time series in mouse macrophages and liver cells, tissue-specific regulation of circadian genes in these cell types is investigated by promoter analysis. Binding sites for CLOCK:BMAL1, NF-Y and CREB transcription factors are among the common top candidates of overrepresented motifs. Related transcription factors of BHLH and BZIP families with specific complexation domains bind to motif variants with differing strengths, thereby arranging interactions with more tissue-specific regulators (e.g. HOX, GATA, FORKHEAD, REL, IRF, ETS regulators and nuclear receptors). Presumably, this influences the timing of pre-initiation complexes and hence tissue-specific transcription patterns. In this respect, the content of guanine (G) and cytosine (C) bases as well as CpG dinucleotides are important promoter properties directing the interaction probability of regulators, because affinities with which transcription factors are attracted to promoters depend on these sequence characteristics.