SOUZA, D. P. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos: atividade e mecanismo de ação. 2010. 82 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-27T19:51:27Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_dpsouza.pdf: 1334612 bytes, checksum: 821c6e352d0748426181f7445a3c5d3d (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-27T20:20:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_dpsouza.pdf: 1334612 bytes, checksum: 821c6e352d0748426181f7445a3c5d3d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T20:20:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_dpsouza.pdf: 1334612 bytes, checksum: 821c6e352d0748426181f7445a3c5d3d (MD5) Previous issue date: 2010 / Canal systems containing secretions, such as latex, are widely disseminated in the plant kingdom. These fluids are chemically complex and exhibit intense metabolism. Despite their origin, latex is the cytoplasm of specialized cells growing intrusively into organized tissues and organs, forming an interconnected network allowing latex exudation immediately after tissue damage. Insecticidal effects of latex proteins have been described, however minor studies were devoted to investigate antifungal activities in latex. In this study proteins extracted from latex of Calotropis procera (Ait.) R.Br (PLCp), Plumeria rubra L.(PLPr), Carica candamarcensis Hook F.(P1 G10), Cryptostegia grandiflora (PLCg), and Euphorbia tirucalli L. (PLEt) were tested for antifungal activity against six phytopathogens (Fusarium solani, F. oxysporium, Aspergilus niger, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. and Colletrotricum gloerosporioides). PLCp, PLCg and P1G10 exhibited antifungal activity and PLPr and PLEt were not efetive. Inhibitory activity of the protein fractions correlated with the cysteine-type proteolytic activity found in these fractions. The endogenous proteolytic activity and inhibitory activity on fungal growth were both increased when samples were first activated with DTT, a cysteine proteinase activator. Conversely, pre-treatment of samples with iodoacetamide, an inhibitor of these proteases rendered all samples deficient of both, proteolytic and antifungal activities. Antifungal of activity of cysteine proteinases of latex origin was also confirmed when papain, obtained from latex of Caryca papaya was tested while purified trypsin and chemotrysin, two serine-type proteases were not antifungal. A cysteine proteinase was thus, purified form PLCg by ion exchange chromatography on a Mono-S Sepharose matrix monitored by a FPLC system. The protein, named Cg24-I exhibited molecular mass of 26.118 KDa determined by MALDI spectrometry; maximum of proteolysis at pH 8.0 and inhibited by iodoacetamide and E-64 when assayed with azocazein or BANA as substrates. Cg24-I inhibited germination of F. solani and altered membrane permeability of spores at a minimum concentration of 90 ng/ml. Results present here suggest that cysteine proteinases of laticifer fluids are proteins with antifungal activity capable of damaging spore structure and inhibiting hyphae growth. Reports of antifungal activity of latex proteases are still scarce in literature and this work appears as an important contribution to this field. Furthermore, this work gives important evidence for the multiple defensive role of latex in plants. / Um relevante número de espécies vegetais é descrito como plantas produtoras de um fluido leitoso comumente denominado de látex. Nestas espécies, o látex é sintetizado e armazenado sob pressão em um sistema de canais formados por células altamente especializadas denominadas de laticíferas, em cujos citoplasmas estão presentes todas as estruturas eucariontes em meio à água, borracha e inúmeras moléculas, muitas das quais específicas deste conteúdo. Muitos estudos têm sugerido que moléculas produzidas nestes fluidos participam da defesa vegetal. Neste trabalho, o látex de 5 espécies foi coletado e processado em laboratório para obtenção de suas frações protéicas e estas foram avaliadas quanto a atividade sobre fungos fitopatogênicos através de ensaios de inibição da germinação de esporos e crescimento de hifas. Proteínas do látex de C. procera (PLCp), Cryptostegia grandiflora (PLCg) e Carica candamarcensis (P1 G10) apresentaram atividade antifúngica enquanto que Plumeria rubra (PLPr) e Euphorbia tirucalli (PLEt) não apresentaram atividade sobre qualquer dos fungos avaliados (Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. e Aspergillus niger). A atividade inibitória das frações protéicas se correlacionou diretamente com a presença de atividade proteolítica do tipo cisteínica presente nas amostras de PLCp, PLCg e P1G10. A atividade antifúngica foi aumentada na presença de DTT, um ativador destas proteases e foi diminuída ou eliminada quanto às amostras foram pré-tratadas com iodoacetamida (IAA), um inibidor específico de proteases cisteínicas. Além disso, a atividade antifúngica foi observada quando papaína, uma protease cisteínica purificada do látex de Carica papaya foi avaliada, mas tripsina e quimotripsina, duas proteases serínicas não apresentaram atividade. Através de cromatografia em coluna de Mono-S Sepharose acoplada ao sistema de FPLC, uma protease cisteínica foi isolada de PLCg. A proteína purificada (Cg24-I) apresentou massa molecular de 24,118 KDa. A Cg24-I apresentou atividade proteolítica máxima em pH 8,0 e foi inibida por IAA e E-64, utilizando azocaseína e BANA como substratos, respectivamente. Cg24-I inibiu a germinação de F. solani e foi capaz de alterar a permeabilidade das membranas dos esporos na concentração de 90 ng/ml. Esse conjunto de resultados sugere que proteinases cisteínicas de fluidos laticíferos participam da defesa das plantas contra fungos fitopatogênicos e que o provável mecanismo de ação destas proteínas seja a alteração da permeabilidade da membrana plasmática destes microrganismos. A descrição de atividade antifúngica de proteases cisteínicas oriundas de fluidos laticíferos não é ainda descrita em detalhes na literatura, sendo este um trabalho com caráter original.