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The improving of our understanding of cancer development still depends on cancer research at the molecular level. In his project, bigenic vectors for animal models of breast and prostate cancer are created. Bigenic constructs are useful because they create animals expressing two genes of interest at a time, with one injection step and no need for crossings. In order to produce these vectors, previous animal models have been analyzed, and the elements that worked successfully in previous models were gathered in a new arrangement for the creation of an improved model. In order to create a bigenic vector, the viral internal ribosomal entry site was utilized, as a means of obtaining two protein products from one transcript. One vector, the MMTV-Neu1842-IRES-Cre was successful in generating a line of transgenic mice. Female founders of this line already express the expected phenotype, tumors of the mammary tissue. Once this line is established, it can be crossed with the Rosa26 line, to determine the pattern of Cre expression. Other vectors were created for models of prostate cancer, using the probasin promoter and the MT oncogene. While transgenic mice were attempted, there were no phenotype differences between wild type and transgenic mice. All created vectors were tested for expression ofthe two genes carried in tissue culture experiments. All the experiments were successful, indicating a working oncogene (by means of a focus assay) and Cre activity (by excission assay). The new breast cancer animal model carrying the MMTV-Neu1842-IRESCre construct is promising and can be used in combination with existing models to answer some of the remaining questions regarding breast cancer signaling pathways. / Thesis / Master of Science (MSc)

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer le plus commun chez les hommes de plus de 50 ans, représentant20% de l’incidence de tous les cancers en 2021. Après l’approche initiale par chirurgie, environ 30% des patients ont une récurrence et suivent une thérapie de déprivation androgénique, qui mène éventuellement à l'atteinte d'un état de résistance à la castration pour lequel aucun traitement curatif n’existe. De récentes études ont montré un intérêt pour l’activation de la AMP-activated kinase (AMPK) comme traitement pour les CaP résistants à la castration. Cette stratégie repose sur la capacité de la AMPK à inactiver la mechanistic target of rapamycin (mTOR), une protéine impliquée dans une voie de signalisation associée à la prolifération des cellules cancéreuses. Contrairement au dogme établi, nos résultats indiquent que la AMPK n’inhibe pas mTOR dans différents modèles cellulaires de CaP, suggérant que ses fonctions y seraient différentes. En effet, l'activation de la AMPK par le A-769662 a démontré que son activité est nécessaire pour le maintien des fonctions mitochondriales en réponse aux androgènes. Pour étudier plus en profondeur les fonctions de la AMPK, nous avons développé un modèle n’exprimant pas les sous-unités catalytiques de la AMPK, à partir de cellules de CaP 22Rv1. Ce modèle a confirmé que l’activité de la AMPK est essentielle pour maintenir la production d’ATP maximale via la respiration mitochondriale dans les cellules de CaP. En fait, des essais de flux extracellulaire sont montré que le knockout de l’activité de la AMPK nuit à la respiration mitochondriale, à l’intégrité des mitochondries, à la flexibilité métabolique ainsi qu’à la prolifération cellulaire. Ces découvertes mettent de l'avant des fonctions oncogéniques associées à la AMPK et indiquent que l’inhibition des fonctions de la AMPK serait requise, plutôt que son activation, pour le traitement du CaP.

Pancreatic and prostate cancer are both prevalent cancers in the United States with pancreatic being one of the most aggressive of all cancers and prostate cancer being one of the most common, ranking as the number one cancer in men. Treatment of both cancers can be quite challenging as the anatomy of the pancreas and prostate, as well as the development and diagnosis of the disease can greatly limit treatment options. Therefore, it is necessary to develop new cancer treatments to help manage and prevent these cancers. Irreversible electroporation is a new non-thermal focal ablation therapy utilizing short, pulsed electric fields to damage cell membranes leading to cell death. The therapy is minimally invasive, involving the insertion of needle electrodes into the region of interest and lasts less than two minutes. Heat sink effects that thermal therapies experience near large blood vessels do not affect irreversible electroporation. This allows the treatment to be used on tumors near vasculature as well as critical structures without harming these vital regions. While irreversible electroporation is a promising new cancer therapy, further developments are necessary to improve treatment planning models. This work aims to further understand the electric field thresholds necessary to kill different types of cancer cells with a focus on pancreatic and prostate cancer. The work is done using an in vitro tumor (hydrogel) model as this model is better than traditional cell suspension studies, with added benefits over the immediate use of tissue and animal models. / Master of Science

The LNCaP cell line is a versatile and useful model that is suitable for the study of human prostate cancer in vitro. The elevation of LNCaP intracellular cAMP levels through the addition of membrane permeable cAMP analogues, phosphodiesterase inhibitors, adenylate cyclase activators, or components of the cAMP signal transduction pathway can induce reversible neuroendocrine differentiation. Elucidation of those genes that are differentially expressed between undifferentiated prostate cancer cells and prostate cancer cells that have been induced to differentiate may present new insights for the molecular mechanisms governing neuroendocrine differentiation, early detection of prostate cancer, and/or potential targets for gene therapy. In this study, differential display PCR was used to identify 226 differentially expressed PCR products. Twelve of the differential display PCR products were confirmed by Northern blot analysis and cloned. DNA sequencing and database comparisons were performed. Among the differentially expressed genes, the human ribosomal S3a gene was identified as down regulated in response to LNCaP differentiation. In order to better ascertain the mechanism by which HRS3a gene expression is decreased during differentiation, the promoter region for this gene was analyzed. Electrophoretic mobility shift assay, antibody supershift assays, site-directed mutagenesis, and luciferase reporter gene analysis were employed to authenticate the roles of several transcription factors in the regulation of the HRS3a gene. Two cyclic AMP response elements, a Sp1 element and a GA-binding protein element, were involved in the regulation of HRS3a gene expression. In order to ascertain the effect of HRS3a down regulation in LNCaP cells, antisense phosphorothioate oligonucleotides were designed to inhibit HRS3a gene expression. Treatment of LNCaP cells with antisense HRS3a oligonucleotides did not influence cAMP induced neuroendocrine differentiation but antisense treatment did result in a decrease in LNCaP cell growth. In addition, it was determined that morphological changes associated with cAMP induced differentiation of LNCaP cells from the epithelial to the neuroendocrine state may not require alterations in gene expression nor the expression of novel proteins. / Ph. D.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / La méthode clinique pour le calcul de dose lors des traitements de curiethérapie considère le patient comme un volume d'eau infini (formalisme TG43). Cette approximation s'avère incorrecte, en particulier pour les photons de faible énergie présents en curiethérapie par implant permanent de la prostate. Des études ont montré que des différences allant jusqu'à 25-30% sur les indices dosimétriques cliniques sont observées dans les cas de calcifications de la prostate lorsque l'anatomie du patient est prise en compte dans une simulation Monte Carlo (MC) (formalisme TG186). Compte tenu des différences constatées entre les dosimétries TG43 et TG186 pour la curiethérapie par implant permanent de la prostate, l'objectif de ce travail est de recalculer rétrospectivement les distributions de dose à partir du formalisme TG186 pour tous les patients ayant reçu un traitement au CHU de Québec. Pour ce faire, un pipeline automatisé de recalcul de dose basé sur les bonnes pratiques de gestion des données est construit, validé et appliqué sur une cohorte de 960 patients. Une base de données de 960 patients a été construite et les cas de calcifications ont été identifiés. Un pipeline automatisé a été conçu pour recalculer les distributions de doses par simulations MC propres à l'anatomie du patient (TG186). Le pipeline extrait et reproduit automatiquement le context du traitment, contenu dans les données cliniques, dans la simulation de Monte Carlo. Le pipeline de recalcul a été validé en reproduisant les calculs du TG43 et en évaluant la cohérence des simulations MC TG186 effectuées avec deux codes MC différents. Appliquées à l'ensemble de la cohorte de patients, les distributions MC produites ont pu reproduire les résultats observés dans des études antérieures, tel qu'une diminution de 2,57 % sur le D90 de la prostate pour chaque % du volume de prostate calcifiée. L'ensemble des données de dose MC produites constitue donc une ressource clé pour les futures études dosimétriques qui viseraient à corréler la dose précise délivrée au patient à l'efficacité du traitement de curiethérapie. / The current clinical method used to calculate the dose during brachytherapy treatments considers the patient as an infinite water volume (TG43 formalism). This approximation is mostly accurate when using high-energy photons. That is not the case for low-energy photons used in permanent implant prostate brachytherapy. Studies have shown that differences of up to 25-30% on clinical metrics can be observed in cases with prostate calcifications when taking into account the patient anatomy with Monte Carlo (MC) simulations (TG186 formalism). Considering the differences found between TG43 and TG186 dosimetry for permanent implant prostate brachytherapy, the objective of this work was to retrospectively recalculate the dose distributions using the TG186 formalism for all patients having received permanent implant prostate brachytherapy at CHU de Québec. To do so, an automated dose recalculation pipeline based on the best data management practices is built, validated, and applied to a 960-patient cohort. A curated database of 960 patients was built with calcification cases identified. An automated pipeline has been built to recalculate patient-specific dose distributions (TG186). The pipeline extracts and reproduces the treatment context within a MC simulation. The recalculation pipeline was validated by reproducing the TG43 calculations using MC simulation in the same conditions and the consistency of the patient-specific MC simulations was evaluated between simulations made with two different MC codes. When applied to the entire patient cohort, the produced MC distributions could reproduce the results seen in previous studies, such as a diminution of 2.57% on the D90 of the prostate for each % of the prostate volume being calcifications. The produced MC dose dataset constitutes a key resource for future dosimetric studies that would aim to correlate the accurate delivered dose to the patient to the efficiency of the brachytherapy treatment.

Androgen-induced bZIP (AlbZIP) a été identifié au début des années 2000 dans le cadre d'une étude visant à identifier des gènes régulés par les androgènes. Chez l'homme, ce facteur est très abondant au niveau de la prostate et présente une expression beaucoup plus importante au niveau des cellules cancéreuses prostatiques. L'analyse de la structure d'AIbZIP a révélé la présence d'un domaine bZIP. Ce domaine constitue la signature de la famille ATF/CREB, d'où l'appartenance d'AIbZIP à cette famille. Durant la dernière décennie, 4 autres membres de la famille ATF/CREB ont été découverts et, avec AlbZIP, ils constituent la sous-famille de CREB3. Au-delà de l'homologie observée entre leurs domaines bZIP, les membres de cette sous-famille sont impliqués dans le stress du reticulum endoplasmique (RE). AlbZIP est une protéine transmembranaire de type II localisée au RE sous sa forme inactive. En effet, la protéine AlbZIP pleine longueur est ancrée à la membrane du reticulum endoplasmique via son domaine transmembranaire et orientée de sorte que son domaine C-terminal se trouve dans la lumière du RE alors que son domaine N-terminal est projeté dans le cytoplasme. Des expériences réalisées par notre équipe ont montré qu'AlbZIP est régulée par le mécanisme RIP. En effet, suite à l'altération des concentrations calciques, nous observons la migration de la forme pleine longueur d'AIbZIP vers l'appareil de golgi où elle va subir un clivage protéolytique par les proteases SIP et S2P. La forme active libérée migre au noyau où elle va réguler l'expression de ses gènes cible via les éléments de réponse UPRE et ERSEII. Lors de mes études doctorales, j'ai tenté de déterminer comment AlbZIP est impliquée dans le stress du RE des cellules prostatiques cancéreuses et quels sont les mécanismes impliqués dans son activation et dans la régulation de ses gènes cibles. Dans un premier temps, j'ai tenté d'inhiber l'activité transcriptionnelle d'AIbZIP. Pour ce faire, j'ai généré et caractérisé un dominant négatif en utilisant l'algorithme développé par Mason et collaborateurs. Ce dominant négatif est capable de lier la forme nucléaire d'AIbZIP de type sauvage, de l'empêcher de lier les éléments de réponse et par conséquent d'inhiber son activité transcriptionnelle. J'ai tenté, dans un deuxième temps, d'identifier les partenaires de la forme pleine longueur d'AIbZIP, quand celle-ci se trouve au RE. Dans le but de mieux comprendre le mécanisme d'action impliqué dans l'activation d'AIbZIP, il était nécessaire de connaître les partenaires d'AIbZIP au RE. Grâce à cette étude, plusieurs protéines ont été identifiées. Ces protéines sont localisées au RE ou à l'appareil de golgi. Elles sont transmembranaires ou solubles et peuvent être impliquées dans la rétention d'AIbZIP au RE ou dans son transport vers les autres organites. Dans un troisième temps, j'ai tenté d'identifier les partenaires de la forme nucléaire d'AIbZIP. WD repeat domain 5 (WDR5) est une des partenaires d'AIbZIP au noyau. WDR5 présente 7 répétitions WD40 formant une structure rigide nécessaire pour les interactions protéine-protéine. De plus, elle est impliquée dans la tri-méthylation de l'histone H3. En réponse au stress du RE déclenché par une depletion des concentrations calciques, AlbZIP est activée par le mécanisme RIP. Une fois au noyau, la forme active d'AIbZIP, sous forme de dimères, recrute WDR5 au niveau de l'ADN. Ce recrutement est nécessaire pour modifier la chromatine, la rendre accessible à la machinerie de la transcription et par conséquent activer l'expression des gènes cibles d'AIbZIP. Ensemble, toutes ces données permetteront de mieux comprendre la régulation d'AIbZIP et la régulation de ses gènes cibles et ainsi cerner son rôle dans la réponse au stress du RE dans les cellules cancéreuses prostatiques humaines.

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer dont l’incidence augmente le plus vite parmi les hommes. Selon la Société Canadienne du Cancer, en 2015, 24 000 nouveaux cas de cancer de la prostate seront diagnostiqués et 4 100 patients en décèderont. Bien que des techniques cliniques pour la détection, le diagnostique et le traitement du CaP soient disponibles et importantes dans le traitement actuel de la maladie, elles sont cependant limitées. L’exploitation de plusieurs promoteurs dont l’activité est altérée au cours du développement du cancer est un moyen pour surmonter ces limitations. L’ARN non codant PCA3 est un biomarqueur unique du CaP qui a été largement étudié et dont l’expression est 60 fois plus forte dans les cellules de CaP que dans les cellules bégnines de prostate. Le gène de l’APS (PSEBC) est un marqueur important en clinique, il reflète la réponse au traitement par privation androgénique. Ces études ont pour objectif de développer des systèmes d’amplification transcriptionnel avec les promoteurs PCA3 et PSEBC pour non seulement cibler mais aussi caractériser les cellules cancéreuses de prostate lors de la progression de la maladie. Nous avons générés plusieurs systèmes dans des adénovirus contenant différentes constructions avec le promoteur proximal PCA3 de 152 pb, le système d’amplification TSTA et le gène rapporteur de la luciférase. Nous avons testé leur spécificité pour les cellules du CaP par infection transitoire. Nous avons amélioré le système TSTA et généré le PCA3-3STA. Nous avons ensuite intégré le promoteur PCA3 avec le promoteur PSA pour générer un autre nouveau système d’amplification transcriptionnelle qui se nomme le système «Multiple Promoter Integrated Transcriptional Amplification (MP-ITSTA)». Ces systèmes ont ensuite été exploités avec un microscope à bioluminescence pour cibler des cellules de CaP provenant de biopsies liquides de patients. Dans le chapitre deux, nous avons montré que l’activité de PCA3-3STA était hautement spécifique pour les cellules de CaP. Son activité était de 98,7 à 108 fois plus fortes dans les cellules de CaP que dans les cellules primaires bégnines de prostate ou dans les cellules cancéreuses nonprostatiques. Dans des modèles murins de xénogreffes de lignées cellulaires de CaP, nous avons montré que PCA3-3STA pouvait imager de manière très sensible l’activité du promoteur PCA3. De plus, sur des modèles de cultures primaires de biopsies, nous avons montré que le système PCA3-3STA ciblait spécifiquement les cellules épithéliales de CaP sans affecter les cellules stromales. Dans le chapitre trois, nous avons ensuite développé une technique en combinat la microscopie à bioluminescence avec le système TSTA et le promoteur PSA pour cibler les cellules de CaP purifiées de sang de patients et évaluer, cellule par cellule, l’hétérogénéité de leur réponse aux anti-androgènes. Cette technique a aussi montré que la microscopie à bioluminescence est hautement quantitative et a la capacité de détecter les changements moléculaires à l’échelle de la cellule. Le quatrième chapitre présente le système MP-ITSTA. Le système intègre l’activation combinée de deux promoteurs qui contrôlent l’expression d’un seul gène rapporteur. La combinaison du promoteur PCA3 avec celui de l’APS permet d’évaluer, cellule par cellule, la réponse aux anti-androgènes de cellules de CaP prélevés à partir d’urine de patients. C’est pourquoi, les systèmes PCA3-3STA et MP-ITSTA sont des systèmes d’expression spécifiques au cancer de la prostate avec le potentiel de cibler et détecter avec précision les cellules épithéliales de CaP ainsi que leur réponse aux traitements thérapeutiques in vivo et ex vivo. Ces systèmes peuvent jouer un rôle important pour l’imagerie moléculaire, l’immunothérapie et la thérapie génique. / Development Of Transcriptional Amplification Systems To Target and Interrogate Cancer Cells Based On Gene Expression Altered During Cancer Development and Treatment Prostate cancer (PCa) is the fastest rising cancer among the males. According to the Canadian Cancer Society in 2015 it was estimated that 24 000 new cases will be diagnosed with prostate cancer and 4100 patients will die from the disease. Although already available clinical techniques for the detection, prognosis and treatment of PCa play an important role in decision making, they are limited in terms of the ability of detecting PCa cells, prognosis and increasing over all survival of patients. Exploitation of several gene promoters altered during cancer development act as important tool to overcome these limitations. PCA3 noncoding long RNA is a unique PCa biomarker that has been widely studied for its sixty-fold overexpression in PCa cells, compared to benign prostate cells. PSA (PSEBC) gene is of high clinical significance as it can give an account of response to androgen deprivation treatments. These studies aim to develop Transcriptional Amplification Systems that can target as well as characterise cancer cells during disease progression using PCA3 and PSA gene promoters. Various adenovirus constructs incorporating the proximal 152 bp PCA3 promoter, the TSTA system and the Firefly luciferase reporter gene were generated and the specificity of the promoter was tested in PCa cells by transient infection. We have improved the TSTA system and generated the (PCA3-3STA). We further integrated the PCA3 promoter along with the PSA promoter to generate a new transcriptional amplification system that we named the Multiple Promoter Integrated Transcriptional Amplification (MP-ITSTA) system. These systems were further applied to target PCa cells from body fluids of patients using bioluminescence microscopy. In chapter two we show that PCA3-3STA activity was highly specific for PCa cells, ranging between 98.7 and 108.0-fold higher, respectively, than that for benign prostate or non-PCa cells. In PCa cell line mouse xenografts, PCA3-3STA was shown to image PCA3 promoter activity with high sensitivity. Moreover, when primary PCa biopsies were infected with PCA3-3STA, it managed to image PCa epithelial cells but not stromal cells. In chapter three we further developed a bioluminescence microscopy technique using the TSTA system with PSA promoter to target PCa cells from blood of patients and assess heterogeneous single cell response to antiandrogens. This technique also shows that bioluminescence microscopy is highly quantitative and has the ability to detect molecular changes at the cellular level. The fourth chapter presents the MP-ITSTA system. This system integrates the combined activation of two promoters giving a single reporter gene expression. PCA3 when combined with the PSA promoter could assess single cell response to antiandrogens in cells isolated from urine of patients. Hence, PCA3-3STA and MP-ITSTA utilizing the bioluminescence microscopy represent a prostate- and PCa-specific expression systems with the potential to target, with high accuracy, PCa epithelial cells, assess their response to therapy in vivo and ex vivo. This can play an important role for imaging, immunotherapy, or gene therapy.