L’objectif de notre étude est de comprendre les mécanismes impliqués dans la variation des qualités sensorielles et technologiques de la viande de porc. Les différentes expérimentations nous ont permis de mettre en évidence le rôle de l’oxydation des protéines dans la variation de qualités des viandes. Les modifications structurales qui ont en découlé participent également à l’élucidation des mécanismes à l’origine de la diminution du pouvoir en rétention d’eau. L’application des traitements thermiques sur la viande accentue les phénomènes oxydatifs dans lesquels la myosine et de l’actine sont des cibles privilégiées, impliquées dans la formation d’agrégats protéiques. Enfin, le rôle du glycogène comme potentialisateur de l’oxydation protéique a été démontré. / We aimed to better understand the mechanisms underlying sensorial and technological meat qualities. The experimental design put into relief the important role of protein oxidation in meat quality. As a consequence of oxidation, structural changes of proteins demonstrated also their implication in water holding capacity. Heating enhanced the oxidative process in which myosin and actin can be considered as favoured protein target. Moreover these proteins are implicated in aggregation /polymerization. Finally, glycogen as a catalyst of protein oxidation was demonstrated.

La détermination du rôle des protéines est à l'origine de la plupart des études biologiques. Elle est encore plus d'actualité depuis l'avènement du séquençage des génomes qui fournit des protéines de rôle inconnu en grande quantité. Le séquençage de nouveaux génomes a permis, par ailleurs, l'obtention de données post-génomiques à haut débit comme les données transciptomique. Il a permis également la construction de données comme les profils phylogénétiques. L'approche que nous avons utilisée, mêlant statistiques et biologie, intègre ces données post-génomiques pour prédire puis valider le rôle de protéines protéolytiques chez Lactococcus lactis. Nous avons procédé en trois étapes réalisant, dans un premier temps, une inférence statistique des liens prédits entre protéines du lactocoque basée sur cinq sources de données distinctes : le graphe des voies métaboliques, des données transcriptomiques, des profils phylogénétiques, des distances entre gènes en paires de bases et des données protéomiques issues de gels 2D. Ces liens nous ont permis de émettre des hypothèses biologiques sur le rôle de protéines cibles. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé des expériences de laboratoire pour valider les prédictions comparant la souche sauvage aux mutants de délétion de PepF et YvjB. La troisième étape de ce travail a consisté à réaliser une analyse de sensibilité dans le but de souligner les données qui ont contribuées le plus aux prédictions et de trouver un sous-ensemble de données aboutissant aux mêmes prédictions. Appliquée à deux enzymes protéolytiques potentielles du lactocoque, PepF et YvjB, cette approche nous a permis de vérifier leur participation dans l'export de protéines telle qu'elle avait été prédite par l'analyse statistique. Nous avons montré que PepF participe à l'export de protéines libérées dans le milieu extérieur (protéines sécrétées) en hydrolysant le peptide signal libéré par la signal peptidase I. PepF participe par ailleurs aussi à la synthèse de la paroi cellulaire et au métabolisme du pyruvate, fonctions aussi prédites par l'analyse statistique. YvjB participe à la mise en place et la maturation d'un autre groupe de protéines exportées, les lipoprotéines. Elle est nécessaire pour la localisation correcte de certaines lipoprotéines et participe au clivage de leur peptide signal. Notre approche s'est avérée très utile dans la mesure où elle permet d'émettre des hypothèses biologiques qui guident les validations expérimentales. Par ailleurs, cette démarche est applicable à tout organisme entièrement séquencé pour lequel suffisamment de données post-génomiques sont disponibles.

Les interactions des glucides sont impliquées dans plusieurs processus biologiques normaux ou bien pathologiques (la communication cellulaire, l'adhésion et l'entrée de pathogènes dans la cellule ou encore de carcinomes métastatiques). Souvent, ces interactions ont une forte spécificité mais une affinité faible. In vivo, cette faible affinité est résolue par la présentation de copies multiples des ligands glucidiques à des multiméres de récepteurs protéiques (lectines). Globalement, l'interaction observée est alors largement supérieure à la somme des interactions individuelles. Ce phénomène est connu comme « l'effet cluster glycosidique ». Ces interactions ont encouragées le développement des recherches interdisciplinaires dans les domaines de la glycochimie et de la glycobiologie. Les nanoparticules d'or, fonctionnalisées avec des glucides (glyco-nanoparticules, GNPs) constituent un nouvel outil pour étudier ce phénomène. Leur synthèse est assez simple, et ils montrent plusieurs propriétés physicochimiques comme la modification de la densité de présentation, le control de la taille de la particule, et ils ont aussi des propriétés électroniques, magnétiques et optiques, liées aux effets quantums. Nous présentons la synthèse et la caractérisation des GNPs fonctionnalisées avec du mannose et du galactose dans le but d'étudier les interactions avec des protéines multivalentes (les lectines Con A, BclA et PA-IL), en utilisant des techniques biophysiques comme la résonance plasmonique de surface, et le microcalorimétrie isotherme de titration. Ces techniques ont montrées que l'affinité des lectines varie avec la densité de présentation des ligands chez les GNPs. Les GNPs sont un outil novateur pour développer des nouvelles méthodes de diagnostiques ou thérapeutiques dans les domaines de la glycobiologie, des biotechnologies et de la science des matériaux.

Les DD-peptidases sont des enzymes impliquées dans la synthèse de la paroi bactérienne. Elles sont aussi appelées "Penicillin Binding Proteins" (PBPs) car elles forment des acyl-enzymes stables avec des antibiotiques de type beta-lactames comme la pénicilline, la stabilité de ces complexes étant à l'origine de l'effet antibiotique. Certaines bactéries sont résistantes aux b-lactames grâce à la production de beta-lactamases, capables d'hydrolyser ces antibiotiques jusqu'à 10E8 fois plus rapidement que les PBPs selon un mécanisme impliquant deux étapes, d'acylation puis de désacylation. Il est généralement accepté que les beta-lactamases ont évolué à partir d'une PBP ancestrale en intégrant au site actif un mécanisme catalytique efficace pour la réaction de déacylation. L'objectif de cette thèse s'inscrit dans la compréhension des mécanismes d'évolution de la catalyse enzymatique au niveau moléculaire. Nous tenterons de reproduire un mécanisme évolutif en créant in vitro une activité b-lactamase à partir d'une DD-peptidase. La protéine de départ pour ce travail est la PBP-A de Thermosynechococcus elongatus, appartenant à une nouvelle famille de PBPs homologue aux beta-lactamases de classe A. L'analyse biochimique de cette protéine suggère que c'est une DD-peptidase, et une approche rationnelle par substitution d'un résidu dans le site actif de PBP-A a permis d'augmenter la vitesse de désacylation de l'acyl-enzyme formé avec la pénicilline d'un facteur 90. L'analyse des structures 3-D de PBP-A sauvage et mutante laisse ouverte la question de savoir comment évoluer cette PBP en beta-lactamase. Ainsi, pour l'évolution dirigée de cette protéine, deux banques ont été construites par approches aléatoire et semi-rationnelle. Il a été possible de sélectionner par "phage display" des enzymes améliorées pour la réaction d'acylation. L'obtention de mutants améliorés pour l'acylation ou la désacylation constitue des premiers pas vers l'évolution de PBP-A en beta-lactamase.

Le but de ce travail consiste à créer un nouveau tag de purification d'affinité permettant la purification de protéines recombinantes sur une matrice DEAESépharose Fast Flow. Dans la nature, certaines protéines de surface de Streptococcus pneumoniae sont liées à la paroi bactérienne par des interactions non convalentes faisant intervenir des molécules de choline présentes sur les acides téichoiques et lipotéichoiques. Ces protéines de surface présentent une organisation modulaire avec le domaine catalytique et le domaine de liaison fonctionnant indépendamment l'un de l'autre. La choline étant un analogue structural du DEAE, l'étude des domaines de liaison à la choline constitue une approche de choix pour concevoir un tag de purification présentant une affinité pour le DEAE-Sépharose. Nous avons plus particulièrement travaillé sur la N-acétyl-L-alanine amidase (LytA) qui dégrade spécifiquement certaines liaisons du peptidoglycan de la paroi de Streptococcus pneumoniae. Son domaine de liaison à la choline C-terminal (ClytA) se compose de six motifs répétés imparfaits, constitué chacun d'une vingtaine de résidus. Deux stratégies ont été développées pour concevoir le tag de purification. D'une part, 126 motifs répétés de 19 domaines de liaison à la choline ont été alignés pour définir une séquence consensus. Cette approche a permis de mettre en évidence les résidus importants conservés parmi les motifs répétés. D'autre part, nous avons construit des protéines de fusion portant des fragments du domaine de liaison ClytA de longueur variable. Des expériences de chromatographies sur matrice DEAESépharose nous ont permis d'isoler un petit fragment de ClytA(L234), présentant toujours une affinité spécifique pour le DEAE Sépharose. Cette affinité est maintenue lorsque le fragment L234 est fusionné à l'extrémité C-terminale d'une autre protéine reporter. Cependant, nos résultats suggèrent que le candidat tag L234 est instable et qu'il conduit à l'insolubilisation de la protéine de fusion lors de la production de celle-ci dans Escherichia coli. Afin d'améliorer la solubilité/stabilité du fragment L234, nous avons développé trois approches bioinformatiques. Cellesci ont permis de définir trois groupes de mutations permettant d'améliorer potentiellement la solubilité et/ou la stabilité du fragment L234. Les tags mutants ont été construits et fusionnés à l'extrémité C terminale de la thiorédoxine. Le premier tag mutant, EDE-L234, est plus soluble que la version non mutante mais présente une perte d'affinité pour le DEAE Sépharose. Le second mutant, NG-L234, ne montre pas d'augmentation de solubilité et perd également une partie de son affinité pour la matrice. Le troisième tag mutant, V1V2V3-L234, présente une augmentation d'affinité pour le DEAE-Sépharose bien que sa solubilité reste inchangée.

Pas de résumé en français

La destruction radio-induite des complexes ADN-protéine peut avoir des conséquences graves pour des systèmes impliqués dans des fonctions cellulaires importantes. Le premier système qui a été étudié est un système de régulation de l'expression génique chez Escherichia coli, celui de l'opéron lactose. Le complexe répresseur-opérateur est détruit après l'irradiation du complexe ou de la protéine seule. L'endommagement du domaine de fixation du répresseur à l'ADN (appelé headpiece) a été démontré et étudié tant du point de vue de l'intégrité de la chaîne peptidique que de la conformation et des modifications de certains acides aminés. Dans un deuxième temps, des dysfonctionnements de l'induction in vitro d'un complexe répresseur irradié-opérateur non irradié ont été mises en évidence. Ces perturbations, dues à une diminution du nombre de sites de fixation sur le répresseur, sont corrélées à l'endommagement de résidus tryptophane. D'autre part, l'inducteur protège le répresseur lorsque ces deux partenaires sont irradiés ensemble, d'une part par capture (pouvoir scavenger) des radicaux en solution et d'autre part par le masquage de son site de fixation sur la protéine. Le deuxième système étudié est formé par Fpg (ou Formamidopyrimidine glycosylase), protéine de réparation de l'ADN, et par de l'ADN porteur d'une lésion oxidative. Les résultats obtenus montrent que l'irradiation de la protéine perturbe la réparation à la fois en diminuant son efficacité de reconnaissance et de fixation des lésions, et en modifiant son activité enzymatique.

Le diagnostic précoce de l'hypothyroïdie permet d'initier le traitement au plus tôt et ainsi de préserver la santé du patient. Le bénéfice du traitement de l'hypothyroïdie franche a été depuis longtemps établi, mais les critères de prise en charge des patients en hypothyroïdie fruste sont encore difficiles à définir. En effet, les symptômes ne sont pas toujours présents et leur appréciation est subjective. Afin d'établir le diagnostic et la prise en charge, le médecin s'appuie sur le dosage de la thyréostimuline (TSH) dans le sang, qui peut éventuellement être complété par le dosage des hormones thyroïdiennes. Le dosage de la TSH, très sensible, peut présenter sur un même échantillon sanguin d'importantes variations qui rendent d'autant plus difficiles la décision du médecin et le suivi du patient. Le polymorphisme naturel de la TSH peut expliquer en partie ces variations. La TSH appartient en effet à la famille des hormones glycoprotéiques et sa glycosylation peut constituer jusqu'à 30% de son poids. Dans le cas de l'hypothyroïdie en particulier, ces glycanes sont modifiés et présentent une plus grande quantité d'acides sialiques terminaux. Ainsi, certaines variations entre les dosages de la TSH, qui freinent actuellement leur harmonisation, peuvent être dues à des différences de reconnaissance de glycoformes par les anticorps utilisés dans les dosages. Dans ce contexte, l'objectif de de ces travaux était de contribuer à la construction de dosages plus performants que ceux actuellement utilisés dans le diagnostic de l'hypothyroïdie. Un nouveau calibrateur recombinant sialylé plus proche de la TSH circulante dans l'hypothyroïdie a alors été produit. De nouvelles associations d'anticorps monoclonaux ont été utilisées pour construire des dosages. Les nouveaux dosages sélectionnés ont ensuite été calibrés avec la TSH sialylée produite et le calibrateur de référence international. Ils ont alors servi à doser plusieurs séries de sérums de patients. Ces travaux ont donc validé l'utilisation d'un nouveau calibrateur d'origine recombinante pour les dosages de la TSH, ce qui devrait à l'harmonisation des dosages existants. / If iodine deficiency is the first cause of low thyroid hormone levels in the world, there are also other etiologies to thyroid disorders. Diagnosis of those allow an early treatment to preserve patient's health. Although there is a general agreement concerning treatment of overt hypothyroidism, treatment of subclinical hypothyroidism is still under debate. In these cases, symptoms are, by definition, not always present. In order to establish diagnosis, the clinicians rely on the measurement of circulating thyroid stimulating hormone (TSH, potentially completed with thyroid hormones measurement). TSH assays are now very sensitive, but can present important between assays variations. The diagnosis and follow up of the patient are consequently complicated. Natural polymorphism of TSH can explain a part of this variability. TSH belongs to the glycoprotein hormones family and its glycans can count for more than 30% of its weight. In hypothyroidism, these glycans are subject of modulation and present higher levels of terminal sialylation. Variation in immuno-assays can be explained by these modifications of sialylation if recognition by antibodies used in immuno-assays is glycosylation dependent. In this context, the aim of this work was to contribute to the construction of new immuno-assays, more reliable in the early diagnosis of subclinical hypothyroidism. During this thesis a new recombinant standard closer to circulating TSH was produced. The total level of sialylation was higher and better mimic the circulating forms in hypothyroidism. In order to select the best antibodies associations in immuno-assays, new antibodies were obtained and associated with commercially available antibodies. New immuno assays improvement is based on the following two approaches: the first one is the use of a new standard which presents glycoformes closer to the circulating TSH and the second one consists in an appropriate selection of antibodies involved in the assays. The new assays were used to measure TSH concentration in blood samples. These studies associated with validation steps allow us to select four assays and constitute a proof of concept for the use of a new sialylated recombinant standard for TSH assays. This can contribute to the needed harmonization of TSH assays.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.