Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La luzerne est une plante fourragère, de la famille des Fabacées, largement cultivée en France du fait de sa richesse en protéines. Industriellement, cette plante est pressée, puis séchée sur tambour rotatif. L’étape de pressage conduit à l’obtention de grandes quantités de jus, lui aussi riche en protéines. L’objectif de cette thèse a été de développer un procédé de bioraffinerie de la luzerne, applicable aux autres plantes fourragères, permettant la valorisation des toutes les fractions de la plante. La première étape consiste en un fractionnement thermo-mécanique de la luzerne entière par extrusion bi-vis. Deux fractions sont obtenues : un résidu fibreux solide en partie déshydraté, pouvant être utilisé dans la filière agro-matériaux, et un filtrat vert, riche en protéines. L’extrusion bi-vis est une alternative intéressante aux procédés classiques de déshydratation, car l’étude de l’optimisation des paramètres d’extrusion a permis de montrer qu’il est possible de récupérer la grande majorité des protéines de la plante dans le filtrat. Ce filtrat subit par la suite une séparation liquide/solide par centrifugation, permettant la récupération d’un culot vert, dont on peut extraire la chlorophylle. Le jus clarifié est ultrafiltré, puis traité par chromatographie hydrophobe, avec l’huile de tournesol comme solvant extracteur, de manière à séparer différentes protéines. L’étude plus fondamentale de la fixation des protéines sur résine a permis de modéliser le fractionnement des protéines par interactions hydrophobes. / Alfalfa is a common Legume, cultivated as a forage crop, thanks to its high protein content. In the green crop industry, alfalfa is pressed and dried on a rotative cylinder. The pressing step leads to the production of large amounts of green juice, rich in proteins. The aim of this work was to develop a biorefinery process for alfalfa, which could be adapted to other green crops, allowing the valorization of each fraction. The first step is the whole plant thermo-mechanical fractionation in the twin-screw extruder. Two fractions are obtained: a solid fibrous residue, partly dehydrated which could be valorized as an agro-material, and a green filtrate, rich in proteins. Twin-screw extrusion is an interesting alternative to usual industrial dehydration processes. Indeed, the study of the extruder parameters optimization showed that most of the alfalfa proteins can be recovered in the filtrate. This green extract is then centrifuged, in order to separate the solid particles. Chlorophyll can be extracted from the centrifugation pellet. The clarified juice is treated by ultrafiltration, and lastly fractionated thanks to hydrophobic chromatography, with sunflower oil as the solvent, in order to separate the proteins. The more fundamental study of proteins fixation on resins allowed us to modelize proteins fractionation using hydrophobic interactions.

Le Fas Ligand (FasL) est le déclencheur naturel de l’apoptose induite par le récepteur Fas. Il est produit sous la forme d’une protéine membranaire homotrimérique, qui peut être clivée par une métalloprotéase pour engendrer une forme soluble (sFasL). Cette forme conserve sa structure homotrimérique, mais son activité pro-apoptotique est très faible car elle n’atteint pas un degré de polymérisation suffisant. Au laboratoire, une molécule sFasL hautement polymérique a été obtenue en fusionnant un domaine de type immunoglobuline au domaine extracellulaire du FasL. Ce domaine permet de polymériser le sFasL sous forme hexamérique et dodécamérique. Cette molécule appelée pFasL possède une activité anti-tumorale in vitro et in vivo dans un modèle de greffe de cellules humaines tumorales à des souris immunodéficientes. Dans cette étude, nous nous sommes focalisés sur l'amélioration de pFasL, avec deux objectifs complémentaires. Tout d'abord, nous avons fusionné un récepteur à l’antigène de lymphocytes Tγδ (TCRγδ) au pFasL (TCR-pFasL) de façon à orienter son activité vers les cellules tumorales carcinomateuses exprimant l’antigène spécifique de ce TCR, qui est l’EPCR (Endothelial Protein C Receptor). Ensuite, nous souhaitions améliorer la production et l’activité spécifique de pFasL et son dérivé TCR-pFasL. La stratégie de ciblage dépendante du TCR n’a pas été validée dans cette étude, mais nous avons pu décrire une approche originale pour améliorer la production et/ou l’activité cytotoxique de ces chimères en co-exprimant celles-ci avec du sFasL non apoptotique. Cette approche a été validée avec deux autres chimères obtenues à partir de pFasL, l’une contenant la molécule de présentation antigénique HLA-A2 et la seconde le ligand CD80 du récepteur CD28, pour lequel le ciblage fonctionne. Notre étude ouvre ainsi des perspectives pour appliquer ce protocole à une grande variété de protéines de fusion dérivées du sFasL pour des applications diverses, en recherche et en thérapie. / Fas ligand (FasL) is the natural trigger for apoptosis induced by the Fas receptor. FasL exists as an homotrimer on the cell surface, which can be cleaved by a metalloprotease to generate a soluble form (sFasL). The sFasL form retains its homotrimeric structure, but displays almost no pro-apoptotic activity because it does not reach a sufficient degree of polymerisation. In the laboratory, a highly polymeric molecule sFasL was obtained by fusing an immunoglobulin-like domain to the extracellular domain of FasL. This domain polymerises the molecule through disulphide bonds, leading to hexameric and dodecameric compounds. This molecule, called pFasL, possesses an anti-tumor activity in vitro but also in vivo in a model of human tumor cell transplanted to immunodeficient mice. In this study, we focused on improving pFasL with two complementary objectives. Firstly, we fused to pFasL an antigen receptor of γδ T-cells (TCRγδ, leading to TCR-pFasL) to direct its activity towards carcinoma cells expressing this TCR specific antigen, which is the EPCR (Endothelial Protein C Receptor). Then, we wanted to improve the production and specific activity of pFasL and its derivative TCR-pFasL. In this study, the TCR dependent targeting strategy has not been validated, but we have described a novel approach to improve the production and/or cytotoxic activity of these chimeras by coexpressing them with non-apoptotic sFasL. This strategy has been validated with two other chimeras obtained from pFasL, one containing the antigen-presenting molecule HLA-A2 and the second one CD80, the ligand for the CD28 receptor. For this latter one, the cell targeting activity proved efficient. Our study opens up opportunities to improve and develop a wide variety of sFasL-derived fusion proteins for various applications in research and therapy.

Les douleurs chroniques, inflammatoire ou neuropathique, se traduisent par un état d'hypersensilité douloureuse. Cet état se manifeste par des douleurs spontanées et des douleurs provoquées, soit par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie), soit par une stimulation douloureuse provoquant une sensation exagérée (hyperalgésie). Les traitements actuels ne sont souvent que partiellement efficaces et peuvent s'accompagner d'effets secondaires importants. Quel sont les mécanismes de ces symptômes douloureux et donc les cibles thérapeutiques potentielles pour de nouveaux médicaments ? Utilisant des approches comportementales, pharmacologiques, électrophysiologiques, anatomo-fonctionnelles, moléculaires et microscopiques, nous avons caractérisé les mécanismes segmentaires de la douleur spontanée et l'allodynie mécanique statique (douleur provoquée par une légère pression cutanée). En utilisant le modèle de douleur provoquée par l'injection sous-cutanée (s.c.) de capsaïcine dans la face chez le rat, nous avons évalué (1) le rôle de l'inhibition GABAAergique et des dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) (2) l'implication d'interneurones spécifiques exprimant l'isoforme γ de la protéine kinase C (PKCγ) localisés dans les couche II interne (IIi) et III externe (IIIe), et (3) les propriétés de ces interneurones, dans le sous-noyau caudal du trijumeau. L'immunohistochimie anti-phospho-ERK1/2 révèle que deux circuits neuronaux différents sont mis en jeu lors de la douleur spontanée et de l'allodynie mécanique statique après injection s.c. de capsaïcine. Le premier implique des neurones uniquement dans les couches superficielles (I et II externe (IIe)) et le second, des neurones dans les couches I, IIe, IIi et IIIe, dont les interneurones PKCγ. Comme après injection s.c. de capsaïcine, l'injection intracisternale (i.c.) d'un donneur de ROS ou d'un inhibiteur des récepteurs GABAA induit une allodynie mécanique statique et l'activation neuronale associée impliquant les interneurones PKCγ. Ces deux phénomènes sont supprimés par l'inhibition pharmacologique de ROS ou de la PKCγ, avant injection s.c. de capsaïcine, alors que la douleur spontanée subsiste. Les microscopies optique et électronique montrent que ces interneurones PKCγ (1) expriment les récepteurs GABAA et glycine et (2) ne reçoivent de projections directes que de fibres afférentes de type A. La PKCγ est majoritairement localisée au niveau de la membrane cytoplasmique, où elle forme souvent des clusters perisynaptique. Nos résultats suggèrent qu'une allodynie mécanique statique se manifeste lorsque des circuits polysynaptiques locaux spécifiques, incluant les interneurones PKCγ, sont désinhibés par réduction de l'inhibition GABAAergique, vraisemblablement provoquée par une libération de ROS suite à une stimulation intense des fibres afférentes nociceptives. Des mécanismes spécifiques semblent donc exister pour chaque symptôme douloureux, représentant autant de cibles pour un traitement particulier de chacun d'eux. / Inflammatory or neuropathic chronic pain is characterized by persistent pain hypersensitivity. This includes spontaneous pain (pain experienced in the absence of any obvious peripheral stimulus), hyperalgesia (an increased responsiveness to noxious stimuli) and allodynia (pain in response to normally innocuous stimuli). Much of the currently available clinical treatment is only partially effective and may be accompanied by distressing side effects. What are the mechanisms underlying these pain symptoms and therefore the putative targets for new drugs? Using behavoural, pharmacological, electrophysiological, anatomo-functional, molecular and microscopic techniques, we have characterized the segmental mechanisms of spontaneous pain and static mechanical allodynia (pain produce by a light pressure). Using the facial capsaicin pain model in rats, we evaluated (1) the role of GABAAergique inhibition and reactive oxygen species (ROS), (2) the involvement of specific interneurons which express the γ isoform of protein kinase C (PKCγ) and are localized in the inner part of laminae II (IIi) and the outer part of lamina III (IIIe), and (3) the properties of these PKCγ interneurons in the medullary dorsal horn (MDH). Phospho-ERK1/2 immunochemsitry reveals that two different neuronal circuits are involved in the manifestation of spontaneous pain and static méchanical allodynia after subcutaneous (s.c.) injection of capsaicin. The first includes neurons exclusively located in the most superficial laminae (I and outer part of lamina II (IIe)) and the second, neurons in laminae I, IIe, IIi and IIIe, including PKCγ interneurons. As after s.c. capsaicin, intracisternal (i.c.)injection of a ROS donor or a GABAA receptor inhibitor induces static mechanical allodynia and associated activation of the local circuit. Conversely, these two phenomenons, but not spontaneous pain, are suppressed following i.c. injection of ROS scavenger and PKCγ inhibitors before s.c. capsaicin. Light and electron microscopies show that PKCγ interneurons (1) express both GABAA and glycine receptors, and (2) only receive direct inputs from A-fiber primary afferents. PKCγ is mostly localized on cytoplasmic membranes where it often clusters close to synaptic clefts. Our results suggest that static mechanical allodynia is expressed when specific local polysynaptic circuits, including PKCγ interneurons, are unmasked by disrupted GABAAergic inhibition, likely produced by ROS release following a strong activation of C-fiber nociceptive primary afferents. Specific mechanisms appear to be involved in these different pain symptoms, each of them being a possible target for new drugs aimed specifically at these symptoms.

Les gènes Hox sont responsables de l’identité des segments le long de l’axe antéro-postérieur. Ils sont évolutivement conservés et codent des facteurs de transcription. In vitro, toutes les protéines Hox se lient à des séquences nucléotidiques très similaires via un domaine de liaison à l’ADN très conservé, l’homéodomaine (HD). Cette faible spécificité de liaison à l’ADN in vitro contraste avec leur spécificité d’action in vivo. Une manière d’expliquer ce paradoxe est que les protéines Hox agissent en interaction avec des protéines cofacteurs, dont le mieux caractérisé est Extradenticle (Exd) chez la drosophile, Pbx chez les mammifères (collectivement appelés PBC). L’interaction Hox-PBC s’appui sur un motif conservé chez la presque totalité des protéines Hox, situé en amont de l’HD, le motif Hexapeptide (HX). Des travaux récents au sein de notre équipe ont montré l’existence d’un nouveau mode d’interaction Hox-PBC, non-générique, médié par un motif spécifique à certains groupes de paralogies seulement, et situé en en C-terminal de l’HD. Ceci souligne que les interactions Hox-PBC, qui spécifient la fonction des protéines Hox, reposent sur de modes multiples d’interaction.Mes travaux de thèse ont porté sur le mode d’action des protéines Hox, en étudiant la fonction de trois motifs ayant un rôle démontré ou potentiel dans le recrutement du cofacteur Exd par la protéine Hox de drosophile AbdominalA (AbdA). L’approche empruntée visait à analyser de manière globale la manière dont chacun de ces motifs pris isolément, ou en interaction, définit la fonction d’AbdA. Les conclusions de ce travail soulignent l’absence de pléiotropie fonctionnelle et un haut degré d’interactivité entre ces motifs. Le second volet de ma thèse a été d’initier la découverte de nouveaux motifs fonctionnels au sein des protéines Hox. J’ai abordé cette question en sélectionnant des modules phylogénétiquement conservés. Afin d’évaluer leur fonction, ces motifs ont été mutés et l’impact de leur mutation a été analysé in vitro et in vivo. Les résultats obtenus ont permis l’identification d’au moins un domaine protéique qui contribue de manière prédominante à la fonction de la protéine Dfd. / Hox genes are responsible for the identity of segments along the antero-posterior axis. They are evolutionarily conserved and encode transcription factors. In vitro, all Hox proteins bind to a similar nucleotide sequence via a highly conserved DNA binding domain, the homeodomain (HD). This low specificity of DNA binding in vitro contrasts with their specificity in vivo. One way to explain this paradaox is that Hox protein function with protein cofactors, best represented by Extradenticle (Exd) in Drosophila, Pbx in mammals (collectivaly refered as PBC). Hox-PBC interaction relies on a motif located upstream of the HD, conserved in most Hox proteins, the Hexapeptide (HX). Recent work in our group identified a novel mode of Hox-PBC interaction, non-generic, specific to a subset only of Hox paralog groups, and relying on a motif located C-terminal to the HD. This highlight plasticity in Hox-PBC interaction.My PhD work aimed at investigating the mode of action of Hox protein, by studying the function of three protein motifs, with known or putative role in Exd recruitment by the Drosophila Hox protein AbdominalA (AbdA). The approach taken aimed at analyzing, using a large functional window, how these motifs, taken in isolation or collectively, define AbdA protein activity. Conclusions highlight the absence of pleitropy and a high degree of functional interaction for these protein motifs. The second part of my PhD work has been to initiate the search for novel functionally important protein motifs within Hox proteins. This was approached by selecting phylogenetically conserved motifs, and addressing their function in vitro and in vivo following motif mutations. At least one functional domain was isolated, that contributes predominantly to Dfd protein function.

L'apeline, ligand endogène du Récepteur Couplé aux Protéines G, APJ, joue un rôle majeur au niveau cardiovasculaire, notamment dans l'angiogenèse physiologique et la néovascularisation tumorale. Par une étude profiling array, notre équipe à mis en évidence que le gène de l'apeline est surexprimé dans un tiers des adénocarcinomes humains, et de manière intéressante, avec une fréquence très élevée (2/3) dans les cancers du pancréas. Ainsi, mon projet de thèse avait pour but de caractériser l'implication du système apelinergique dans le cancer du pancréas. L'adénocarcinome pancréatique canalaire (ADK) est la forme la plus commune des cancers du pancréas et la découverte de biomarqueurs et nouvelles cibles potentielles est particulièrement importante pour ce cancer dont le diagnostic est tardif et les traitements peu efficaces. Par une approche immunohistochimique sur des coupes d'ADK humains (49 patients), nous avons mis en évidence que l'apeline et APJ sont fortement exprimés par les cellules tumorales pancréatiques. Dans le but de caractériser l'expression spatio-temporelle de l'apeline et de son récepteur au cours de la carcinogenèse pancréatique, nous avons étudié par immunohistochimie leur expression dans des modèles murins d'ADK. Ainsi, dans les souris K-ras (Lox-Stop-Lox-K-rasG12D/+/Pdx1-Cre) récapitulant les stades précoces de la pathologie, et le modèle murin KPC (Lox-Stop-Lox- K-rasG12D/+ ; Lox-Stop-Lox-Trp53 R172H/+/Pdx1-Cre) qui développe un ADK jusqu'au stade invasif, nos résultats mettent en évidence que l'apeline et son récepteur APJ sont exprimés par les cellules tumorales et ce, dès les premiers stades de la carcinogenèse. Afin d'étudier la fonction de la voie de signalisation apeline, nous avons caractérisé les cascades de transduction activées par l'apeline dans la lignée tumorale pancréatique humaine MiaPaCa qui exprime de façon endogène APJ et l'apeline comme retrouvé in vivo.Dans ces cellules, l'apeline induit la stimulation transitoire des ERKs et de la p70S6 Kinase, l'activation prolongée d'Akt et la phosphorylation inhibitrice de GSK3 stabilisant ainsi la Beta-caténine. De manière intéressante, mes travaux mettent en évidence que l'activation de la voie MAPK induite par l'apeline est dépendante de la protéine Gi. A l'inverse, la stimulation soutenue de la voie PI3K/Akt est indépendante de la voie G mais implique l'internalisation du récepteur. De plus, l'apeline régule positivement la quantité protéique de c-myc et cycline D1 tous deux impliqués dans la prolifération cellulaire, ainsi que de l'Hexokinase 2 permettant de maintenir un fort flux glycolytique, essentiel aux besoins énergétiques de la cellule tumorale. Ces résultats sont en accord avec les effets cellulaires que nous observons puisque l'apeline stimule la prolifération, la capture du glucose ainsi que la migration des cellules tumorales, des propriétés essentielles participant à la progression tumorale.Dans ce contexte, la surexpression de l'apeline et de son récepteur dans l'ADK et l'effet de cette de voie de signalisation sur la cellule tumorale fait de ce couple ligand/récepteur une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement du cancer du pancréas. / Apelin, the endogenous ligand of the human G-protein coupled receptor, APJ, is a key regulator of cardiovascular system, notably during physiological and tumor angiogenesis. Using a cancer profiling array approach, our team clearly showed that apelin gene is overexpressed in one third of the human carcinomas, with the highest frequency (2/3) in pancreatic cancers. Thus, the aim of my PhD project was to characterize apelin signaling function during pancreatic carcinogenesis. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the most common form of pancreatic cancer and the discovery of biomarkers and new therapeutic targets is of crucial interest for this cancer since this cancer is diagnosed too late and there is no effective therapy. By an immunohistochemistry approach on human PDAC slides (49 patients), we show that apelin and APJ are strongly expressed by pancreatic tumor cells. In order to characterize apelin and APJ spatio-temporal expression during pancreatic carcinogenesis, we have studied their expression by immunohistochemistry in genetically engineered mouse models of PDAC. In the K-ras mouse model (Lox-Stop-Lox-K-rasG12D/+/Pdx1-Cre) which recapitulates early stages of the disease, and in the KPC mouse model (Lox-Stop-Lox- K-rasG12D/+ ; Lox-Stop-Lox-Trp53 R172H/+/Pdx1-Cre) which develops PDAC until invasive stages, our results demonstrate that apelin and its receptor are expressed by tumor cells since the first steps of carcinogenesis. In order to study apelin signaling function, we have characterized signal transduction pathways activated by apelin in MiaPaCa human pancreatic cancer cell line endogenously expressing apelin and APJ as observed in vivo. In these cells, apelin induces transient activation of ERKs and p70S6 Kinase, a sustained Akt activation and an inhibitory phosphorylation of GSK3 thus allowing Beta-catenin stabilization. Interestingly, my results demonstrate that the MAPK pathway activation apelin induced is Gi protein dependent. Conversely, long term stimulation of PI3K/Akt pathway is G protein independent but instead involves receptor internalization. Moreover, apelin positively regulates on one hand c-myc and cyclin D1 protein levels, both of them being implicated in cell proliferation and on the other hand, intracellular protein content of Hexokinase 2 in order to ensure high glycolytic flux which is essential for tumor cells energy supply. These results are in agreement with cellular effects that we observed since apelin stimulates proliferation, glucose uptake and migration of tumor cells which are essentials properties for tumor progression. Accordingly, apelin and APJ overexpression in PDAC and the effects of this signaling pathway on tumor cells make of this ligand/receptor couple a new potential therapeutic target for pancreatic cancer treatment.

Les levures non conventionnelles, dont Yarrowia lipolytica, sont devenues desusines cellulaires attractives pour la production de protéines recombinantes. Lasélection de promoteurs régulés impliqués dans le métabolisme de substratshydrophobes est d'un grand intérêt pour une telle application. Dans ce cadre,l’objectif de ce projet est de mieux comprendre la régulation des promoteurs desgènes POX2 et LIP2 dans le but d’améliorer la production de protéinesrecombinantes chez Y. lipolytica.D’un point de vue biotechnologique, l'analyse à l’échelle cellulaire est devenueune approche répandue pour l’analyse et l’optimisation des bioprocédés. Ainsi,l'objectif de la première partie de ce projet vise le développement d’une méthoded’analyse en ligne des paramètres de culture Y. lipolytica dans un milieu contenantde l’acide oléique. Cette technique consiste au couplage d’un bioréacteur à uncytomètre en flux via une interface d’échantillonnage automatique. Cetteméthodologie a conduit principalement à une analyse rapide de la croissancecellulaire, de l'accumulation des lipides, du dimorphisme ainsi qu’à l'analyse duniveau d’induction des promoteurs chez Y. lipolytica.Les systèmes d’expression basés sur les promoteurs LIP2 et POX2 sont difficilesà manipuler, principalement en raison de l’utilisation de substrats insolubles dansl’eau (acide oléique) comme inducteur. Dans ce travail, il a été clairement démontréque pLIP2 est le promoteur de choix à utiliser pour développer un procédé deproduction de protéines recombinantes par culture de Y. lipolytica dans un milieucomplexe. De plus, l’utilisation d’un mélange acide oléique-glucose 60/40 (w/w) aconduit à une amélioration du niveau d’induction du promoteur LIP2 par un facteurde 10 par rapport à utilisation l'acide oléique. De plus, l’analyse à l’échelle cellulairemontre que ces deux substrats sont co-consommés par les cellules.Enfin, la dernière partie de cette thèse a eu pour but d'étudier la régulation dupromoteur LIP2 par rapport à la transition dimorphique. Nos résultats ont clairement montré que le changement morphologique chez Y. lipolytica n'a pas d'impact sur larégulation de pLIP2.L’ensemble de ces études a conduit à une meilleure compréhension de laphysiologie de Y. lipolytica, soulignant son potentiel avéré de production desprotéines recombinantes. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les mycobactéries, dont les plus connues sont Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae, agents étiologiques de la tuberculose et de la lèpre respectivement, présentent une enveloppe complexe et atypique faisant l'objet de nombreuses études dans le cadre de la lutte contre ces pathologies. Cette enveloppe est composée d'une couche externe aussi appelée capsule dans le cas de bactéries pathogènes, d'une paroi (mycomembrane - arabinogalactane (AG) - peptidoglycane (PG)) et d'une membrane plasmique. La membrane externe des mycobactéries, appelée mycomembrane est composée de protéines et majoritairement d'acides mycoliques, acides gras à très longues chaînes a-ramifiés et ß-hydroxylés. Ces derniers sont retrouvés covalemment liés, d'une part au complexe AG-PG dans le feuillet interne de la mycomembrane, et d'autre part au tréhalose au niveau du feuillet externe de la mycomembrane. On trouve également en fonction des mycobactéries des lipides complexes dont la localisation exacte dans l'enveloppe n'est à ce jour pas clairement connue et reste sujette à débats. Ce travail a permis de mettre au point un protocole, en deux étapes majeures, permettant le fractionnement cellulaire de deux espèces mycobactériennes, M. aurum et M. smegmatis. Le but étant d'isoler les deux membranes mycobactériennes afin de déterminer leur composition en terme de lipides mais aussi de protéines. Tout d'abord, des culots enrichis en mycomembranes (liées à l'AG-PG) ou en membranes plasmiques sont obtenus par ultracentrifugations différentielles puis purifiés sur gradients de densité discontinus de saccharose. L'absence de contaminations des membranes entre elles est vérifiée grâce à des marqueurs spécifiques. Il a été montré que les phospholipides qui sont les composants majoritaires de la membrane plasmique sont également présents dans la mycomembrane à côté des mycolates de tréhalose. De plus ce travail a permis de montrer que les lipoglycanes, lipoarabinomannanes et lipomannanes, lipides possédant des propriétés antigéniques, sont retrouvés dans les deux fractions membranaires. Ce travail de fractionnement a été le point de départ d'une étude de protéomique afin d'identifier les protéines retrouvées spécifiquement au niveau de la mycomembrane-AG-PG mais également les protéines de la membrane plasmique, les protéines sécrétées et les protéines solubles, provenant des cytosol et périplasme. Une étude de dynamique par RMN sur les fractions membranaires natives menée conjointement avec l'étude protéomique, devrait permettre de mieux comprendre l'organisation de l'enveloppe cellulaire des mycobactéries ainsi que certains des mécanismes impliqués dans la pathogénicité. / Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae, etiological agents of tuberculosis and leprosy respectively, are composed of a complex and atypical cell wall, which is the focus of numerous studies in the context of the fight against these pathologies. This cell envelope, to which many biological properties have been attributed, is composed of three entities: an outer layer also called capsule in the case of pathogenic species, a cell wall and a plasma membrane. Within the mycobacterial cell wall, the outer membrane, called mycomembrane, is mainly composed of proteins and mycolic acids, very long chain a-branched and ß-hydroxylated fatty acids. These mycolic acids are found in the inner leaflet of the mycomembrane, covalently linked to the arabinogalactan-peptidoglycan complex (AG-PG), and in the outer leaflet where they are linked to trehaloses. Complex lipids are also known in mycobacteria, and may vary depending on the species, however their exact localization within the cell envelope is not yet clearly known and remains open to debate. In order to better delineate the composition of the two mycobacterial membranes, mycomembrane and plasma membrane, a two-step protocol was developed for cell fractionation of two mycobacterial species, M. aurum and M. smegmatis. Firstly, pellets enriched in mycomembranes (linked to AG-PG) or plasma membranes are obtained by differential ultracentrifugations. Then, these membrane pellets are purified using a sucrose step density gradient. To ensure the absence of cross-contaminations of the membranes, specific markers of each membranes are used. Phospholipids, which are the major components of the plasma membrane, are also found in the mycomembrane with trehalose mycolates. Moreover, this study allowed us to demonstrate that immunogenic lipoglycans, lipoarabinomannans and lipomannans, are found in the two mycobacterial membranes. Once the fractionation successfully achieved, it was possible to initiate proteomic studies in order to identify proteins that are specific of the mycomembrane-AG-PG but also those secreted or present in the soluble fraction, derived from the cytosol and periplasm compartments. Future NMR dynamic studies, to be performed on the native membranes, combined with the proteomic studies will help deciphering the organization of the mycobacterial cell envelope as well as the mechanisms involved in pathogenicity.

Selon l'organisation mondiale de la santé, 21 pays d'Amérique Latine et notamment le Brésil sont touchés par la maladie de Chagas qui est provoquée par le protozoaire Trypanosoma cruzi (T. cruzi). En dépit de très nombreuses études expérimentales, il n'existe aucun traitement efficace contre la maladie de Chagas, et l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques est fondamentale pour développer de nouvelles drogues. Dans cette thèse, j'ai revisité 41 protéines chez T. cruzi récemment proposées par Nicolas Carels et al. A partir d'une nouvelle procédure bioinformatique, j'ai trouvé qu'il est possible de prédire les structures 3D de séquences T. cruzi ayant des homologues ou des analogues chez l'homme et très probablement associées aux fonctions trypanothione réductase, cystéine synthase et ATPase, ainsi que des séquences spécifiques à T. cruzi et absentes chez Homo Sapiens associées à des activités 2,4-dienoyl-CoA réductase et leishmanolysine. Les implications de nos modèles raffinées par des dynamiques moléculaires atomistiques (monomère ou dimère) dans leur environnement in vitro (solution aqueuse ou bicouche membranaire) sont discutées à des fins thérapeutiques, et suggèrent que toutes les cibles protéiques, à l'exception de la cystéine synthase, méritent d'autres investigations. / According to the World Health Organization, 21 Latin American countries are endemic for Chagas disease, affecting 10 million people. Chagas' disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is a parasitic illness endemic mostly in Latin America and particularly in Brazil. Despite many experimental studies, there is no efficient treatment against Chagas disease, and the search for new therapeutic targets specific to T. cruziis critical for drug development. In my thesis, I have revisited 41 protein sequences proposed by the analogous enzyme pipeline, and found that it is possible to provide structures for 33 T. cruzisequences with clear homologs or analogs in H. sapiensand likely associated with trypanothione reductase, cysteine synthase and ATPase functions, and structures for sequences specific to T. cruziand absent in H. sapiens associated with 2,4-dienoyl-CoA reductase, and leishmanolysin activities. The implications of our structures refined by atomistic molecular dynamics (monome or dimer states) in their in vitro environments (aqueous solution or membrane bilayers) are discussed for drug development and suggest that all protein targets, except cysteine synthase, merit further investigation.