Les protéines jouent un rôle important dans les cellules, via leur activité enzymatique et les interactions qu’elles mettent en jeu. Ces fonctions sont principalement basées sur la structure des protéines. Afin de détecter leur présence, et de caractériser leur structure, nous nous sommes appuyés sur les propriétés optiques des nanostructures. La résonance des plasmons de surface localisés (RPSL), ainsi que la diffusion Raman exaltée de surface(DRES), nous ont permis de détecter différentes protéines. Une optimisation des nanostructures nous a également permis de concevoir un biocapteur basé sur la DRES, qui soit sensible, reproductible et spécifique. En effet, la détection spécifique d’un biomarqueur pathologique, la protéine Manganèse Super Oxide Dismutase (MnSOD), a été réalisée grâce à l’utilisation de nanostructures optimisées et fonctionnalisées avec un aptamère (séquence ADN). Avec ce système, nous avons démontré la détection de la MnSOD à des concentrations physiologiques dans des fluides corporels comme le sérum et la salive. Enfin, l’étude de la structure de la protéine Spleen Tyrosine kinase (Syk), par DRES, nous a permis de mettre en évidence un réarrangement structurale de Syk lors de sa phosphorylation. Une étude complémentaire par Western Blot montre que son activité kinase est dépendante de son état de phosphorylation indiquant que la structure et l’activité de Syk sont liées. L’ensemble de ces travaux contribue à une meilleure connaissance de l’interface entre la physique et la biologie. / Proteins play an important role in cells via their enzymatic activity and the irinteractions. Their functions are mainly based on the protein structure. In order to detect their presence and to characterize their structure, we used optical properties of nanostructures. The localized surface plasmon resonance (LSPR), as well as the surface enhanced Raman scattering (SERS), allowed us to detect various proteins. We also optimized nanostructures to build a sensitive, reproducible and specific biosensor based on SERS. Indeed, specific detection of one pathological biomarker, the Manganese Super Oxide Dismutase (MnSOD) protein, was investigated by using optically optimized and aptamer-functionalized nanostructures. Using this system, we were able to detect the MnSOD at physiological concentration in body fluids, such as serum and saliva. Finally, the structural study of the Spleen Tyrosine kinase (Syk) protein by SERS, allowed us to demonstrate that its structure varied with its phosphorylation levels. A complementary Western Blot analysis showed that the Syk kinase activity depended also on its phosphorylation state, meaning that the structure and the activity of Syk were linked. Altogether, these data contributed to a better understanding of the interface between physics and biology.

La lécithine:rétinol acyltransferase (LRAT) est une enzyme de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) qui joue un rôle essentiel dans le cycle visuel des rétinoïdes au niveau de l'estérification du rétinol tout-trans en rétinyl ester tout-trans. Plusieurs travaux de caractérisation de cette protéine ont été publiés depuis les 20 dernières années, mais ce n'est que depuis 2003 qu'il est possible d'utiliser une forme tronquée et purifiée de la LRAT qui correspond à sa portion cytosolique (tLRAT) (Bok et al. 2003). Bien que plusieurs mécanismes biochimiques aient été approfondis avec la tLRAT purifiée, très peu d'investigations à propos de sa structure et de son interaction membranaire ont été publiées jusqu'à maintenant. De plus, même si les paramètres enzymatiques de la tLRAT ont été étudiés par différents groupes de recherche, ces travaux ont été effectués avec un protocole expérimental indadéquat conduisant à des niveaux d'activité non-reproductibles d'un article à l'autre. Nous avons donc produit la tLRAT afin d'étudier en profondeur sa structure secondaire, son interaction membranaire et son activité enzymatique. En élaborant un nouveau protocole de recherche pour étudier l'activité enzymatique de la tLRAT, nous avons pu obtenir des niveaux d'activité très élevés et reproductibles. Par surcroît, les méthodes de spectroscopie infrarouge (IR) dichroïsme circulaire électronique et vibrationnel ont permis de déterminer que la tLRAT était constituée d'une structure secondaire majoritairement en hélice alpha. Ensuite, la spectroscopie de réflexion-absorption par modulation de polarisation en IR (PM-IRRAS) a permis de déterminer que la tLRAT interagissait fortement et hydrolysait des monocouches de phospholipides. L'interaction entre la tLRAT et différents types de lipides retrouvés dans les membranes de l'EPR a également été caractérisée avec la méthode des monocouches de Langmuir par la détermination de la pression d'insertion maximale (PIM). Cette méthode a permis de déterminer que la tLRAT s'adsorbait spontanément aux monocouches de lipides à des pressions de surface au-delà la pression latérale des membranes biologiques. Les deux segments hydrophobes en N- et C-terminal de la LRAT qui n'ont pas été surexprimés dans la tLRAT ont été synthétisés afin de les étudier en PM-IRRAS. Ces expériences ont permis de démontrer qu'ils interagissaient fortement avec les monocouches de lipide et qu'ils adoptaient une structure en hélice alpha. Enfin, le mutant S175R responsable de la rétinite pigmentaire a été produit afin de comprendre les impacts moléculaires de cette mutation. La méthode des monocouches de Langmuir et le dichroïsme circulaire ont permis de démontrer que son interaction membranaire et sa structure secondaire n'étaient pas modifiés en comparaison à la forme sauvage de la tLRAT. Cependant, comme son activité enzymatique est absente, il a été conclu que l'entrée du substrat dans le site actif devait être compromise par la mutation de la serine en arginine.

Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / Le fil de soie d'araignée est un matériau structural ayant des propriétés mécaniques de résistance et d'endurance exceptionnelles. Récemment, Nexia Biotechnologies Inc. a réussi à produire en grande quantité les deux protéines recombinantes (MaSpI et MaSpII) qui composent la soie d'araignée. Un défi important est de pouvoir convertir ces protéines en biomatériaux ayant les propriétés mécaniques désirées, ces dernières étant fortement dépendantes du processus de filage. In vivo, le filage de la soie implique le passage d'une solution protéique concentrée contenue dans la glande à travers une filière conduisant à une fibre insoluble. La conformation des protéines dans la glande serait déterminante pour l'optimisation de ce processus. Dans la première partie de notre projet, nous avons étudié pour la première fois la conformation des protéines de soie d'araignée in situ à l'intérieur de la glande ampullacée majeure ainsi que des deux protéines recombinantes en solution. À cette fin, nous avons utilisé des techniques sensibles à la conformation des protéines comme la spectromicroscopie Raman, la spectroscopie infrarouge et le dichroïsme circulaire vibrationnel (VCD). Les données obtenues par VCD montrent la présence d'hélices 3₁ gauche de type polyproline II (PPH), d'hélices a et de structures désordonnées. La présence de PPII pourrait influencer fortement le processus de filage. En effet, les angles dièdres de la structure PPII et des feuillets, p étant proches, la transition d'un état à l'autre nécessiterait peu d'énergie. La caractérisation des propriétés d'auto-assemblage des protéines recombinantes a également été effectuée. Ces résultats devraient conduire à une meilleure compréhension des paramètres qui gouvernent le processus de filage naturel des protéines de soie. Dans la deuxième partie du projet, nous avons étudié par spectromicroscopie Raman la conformation et l'orientation des protéines de soie dans différents types de fibres produites de l'araignée Araneus diadematus. Les résultats obtenus nous ont permis d'établir des corrélations entre la structure de la soie et les propriétés mécaniques des fibres.

Le domaine C-terminal de MaSpI, la protéine majeure du fil de trame de l'araignée, joue un rôle clé dans le contrôle de la solubilité de cette protéine et l'alignement des fibres de soie. La formation de ces fibres est initiée par des perturbations physicochimiques, telles que des changements de pH, des variations de force ionique et l’accroissement de forces de cisaillement, qui sont toutes rencontrées dans les conduits de la glande ampullacée majeure. La réaction structurale du domaine C-terminal de MaSpI en réponse à ces stimuli reste inconnue. Nous avons donc établi un protocole de purification du segment C-terminal recombinant de la protéine MaSpI de Nephila clavipes qui limite son agrégation. De cette façon, des études structurales ainsi que sur le niveau d'oligomérisation de la protéine ont pu être effectuées dans différentes conditions de pH. Les résultats ont permis de mettre en évidence un possible état conformationnel distinct, dit globule fondu.

Les travaux présentés portent sur l'étude de la structure moléculaire des fibres de soie et de la soie en solution. La spectroscopie infrarouge à réflexion totale atténuée a permis d'étudier la deutération de la soie de l'araignée Nephila clavipes et du ver à soie Bombyx mori. Nous avons pu identifier la présence de structures amorphes, de feuillets β cristallins et de feuillets β interfaciaux dans les deux fibres en plus de calculer leurs proportions et leur orientation. Le dichroïsme circulaire vibrationnel et l'activité optique Raman ont été utilisés pour étudier la structure secondaire de la soie en solution puisque ces techniques sont très sensibles à la conformation des protéines. Les spectres des protéines recombinantes rMaSpI et rMaSpII, analogues aux protéines de la soie d'araignée, et de la soie d'araignée et de Bombyx mori indiquent que la soie forme des hélices 3i en solution dans l'eau et dans l'eau lourde.

La résistance des bactéries aux antibiotiques est devenue un problème majeur dans la lutte aux infections bactériennes. En effet, plusieurs bactéries telles que Pseudomonas aeruginosa ont développé des mécanismes de résistance aux antibiotiques. Le développement de nouveaux agents antibactériens s'impose donc. Étant donné que les virus de type bacteriophage sont des pathogènes naturels des bactéries, ils représentent une approche intéressante dans le but de développer de nouveaux agents antibactériens. Pour ce faire, nous avons entrepris des études sur les mécanismes moléculaires qui permettent aux bacteriophages de lyser les bactéries. Dans le cadre de cette étude, nous avons évalué les interactions potentielles entre l'endolysine du phage <)>KZ (gpl44) et des membranes modèles. Nous avons constaté que gpl44 interagit préférentiellement avec les membranes anioniques bactériennes. Nos études suggèrent aussi que la structure de la protéine n'est pas affectée de façon significative par la présence des lipides. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons étudié des protéines de soie d'araignée naturelle et transgénique. Les fibres de soie d'araignée sont parmi les matériaux structuraux les plus évolués dans la nature. En effet, la soie, tout en étant très solide, possède une grande extensibilité. Comme ce type de matériau peut servir à de nombreuses applications, Nexia Biotechnologies Inc. a entrepris la production de soie d'araignée transgénique. Le but de notre étude est donc de déterminer l'influence de paramètres de production de la soie naturelle et transgénique sur la structure et la dynamique des protéines de fibres de soie et, éventuellement, de relier ces observations aux propriétés mécaniques de la soie. Nos études ont permis de déterminer que la vitesse de filage a une influence sur la dynamique des échantillons de soie naturelle. Pour ce qui est des différents types de soie naturelle étudiées soit la soie de la glande ampullacée majeure, mineure et de cocon, nous avons noté que bien qu'elles possèdent toutes les mêmes structures secondaires, des différences majeures ont été notées au niveau de la dynamique des échantillons. Nous avons aussi étudié des échantillons de soie transgénique produits par filage humide. Nous avons observé que peu importe la forme de l'échantillon transgénique étudié, il semble que ce soit la dynamique des échantillons qui soit critique pour obtenir des échantillons de soie recombinante possédant les mêmes propriétés mécaniques que la soie naturelle et non la structure secondaire de la protéine.

Dans l’industrie laitière, la présence de bactériophages dans du lait destiné à la fabrication de fromage peut retarder ou arrêter le processus de fermentation par les bactéries lactiques. La bactérie Lactococcus lactis, largement utilisée comme levain de départ, est la proie de plusieurs de ces virus, dont le phage p2, du groupe sk1-like de la famille des Siphoviridae. À ce jour, le mécanisme d’infection des bactériophages reste incompris. La prise de contrôle de la machinerie cellulaire par les phages est assurée par les gènes précoces et médians de ces derniers. La structure du phage p2 est connue, mais ses gènes précoces et médians codent pour des protéines qui ne possèdent pas d’homologues de structure ou de fonction connue. Ces gènes ont été clonés dans des systèmes d’expression bactériens afin de les exprimer, purifier, et en déterminer la structure par cristallographie aux rayons X. Parallèlement, la protéine codée par le gène orf47 a été synthétisée commercialement pour déterminer sa structure par résonance magnétique nucléaire. Nous espérons que l'obtention de la structure de ces protéines aidera à leur suggérer un rôle par recherche d’homologie structurale avec des protéines de rôle connu. Des cristaux ont été obtenus pour les protéines ORF-24, SaV (exprimée du gène orf26) et ORF-37, mais plus de travaux sont nécessaire afin de pouvoir obtenir leur structure. La structure d’ORF-47 a été déterminée par résonance magnétique nucléaire et démontre une homologie structurale avec les domaines B, C et E de la protéine staphylococcale SpA, domaines liant les immunoglobulines G de l’homme. La liaison de protéines similaires chez L. lactispar ORF-47 reste à être vérifié expérimentalement. / Cheese fermentation is a process in which milk is fermented by the Gram-positive bacteria Lactococcus lactis. However, the fermentation can be slowed or even stopped if specifi lactococcal bacteriophages are present in the medium. To this day, the infection mechanism of bacteriophages is still not fully known. The hijacking of the cell’s molecular machinery is carried out by proteins expressed by the phages’ early- and mid-expressed genes. The phage studied in this thesis is phage p2, of the Caudovirales order, Siphoviridae family and sk1-like group. The structure of phage p2 is known, but most early-and mid-expressed proteins do not have homologues of known structure or function in the public databases. These genes were cloned in a bacterial expression system in order to be expressed and the proteins purified and crystallized to determine their structure by X-ray crystallography. The protein encoded by the gene orf47 was commercially synthesized to be studied by nuclear magnetic resonance. Our overall goal is to suggest roles for these proteins by obtaining their structure and performing a structural homology query. Crystals were obtained for the proteins ORF-24, SaV (expressed from the gene orf26) and ORF-37 but more work is required in order to determine their structure. The structure of ORF-47 was obtained by nuclear magnetic resonance and has been found to have a fold highly similar to domains B, C and E of staphylococcal protein SpA. These domains bind human immunoglobulin G. The binding of similar proteins in L. lactis by ORF-47 has yet to be experimentally confirmed.

La soie d'araignée naturelle est un biomatériau aux propriétés mécaniques exceptionnelles. Elle combine extensibilité et résistance, ce qui la rend supérieure à beaucoup d'autres fibres synthétiques déjà existantes. Puisqu'il est difficile de faire l'élevage des araignées, les biologistes moléculaires ont contourné cette difficulté, en isolant les gènes codant les protéines de soie d'araignée (MaSpI et MaSplI) et en les insérant dans des organismes vivants. Le nouveau défi est de réussir à fabriquer une fibre aussi résistante et extensible que la soie naturelle. La compagnie Nexia Biotechnologies Inc. a réussi l'exploit d'insérer les gènes dans les cellules mammaires de chèvres, d'isoler les protéines de soie d'araignée des autres composantes du lait et de fabriquer des fibres régénérées. En collaboration avec cette compagnie, nous avons étudié par spectromicroscopie Raman la conformation et l'orientation des protéines de soie de fibres régénérées fabriquées industriellement. Nous avons comparé ces résultats avec la soie d'araignée naturelle. L'orientation et la conformation des fibres régénérées sont comparables à la soie naturelle, mais les propriétés mécaniques de ces fibres ne sont pas aussi bonnes. La deuxième partie du projet consistait à étudier l'auto-assemblage des protéines MaSpI et MaSplI produites par Nexia Biotechnologies Inc. à l'interface air-eau en utilisant la technique des films de Langmuir. La microscopie à angle de Brewster (BAM) nous a permis d'étudier la morphologie des films. Nous avons aussi étudié la structure et l'orientation moléculaire des protéines dans les films in situ à l'aide de la spectroscopie infrarouge de réflexion absorption avec modulation de polarisation (PM-IRRAS). Afin de vérifier ces résultats, nous avons transféré les films sur un substrat de germanium, ce qui nous a permis d'utiliser la spectroscopie infrarouge à réflexion totale atténuée (ATR) pour étudier la conformation des protéines et de calculer l'orientation des feuillets fi et des hélices a. Les résultats ont montré que les deux protéines forment des feuillets (3, même à très faible pression de surface. Cependant, lors de la compression des films, les deux protéines se comportent différemment : le pourcentage de feuillets (3 augmente pour la protéine MaSpI alors que pour la protéine MaSplI, il y a une augmentation de la structure en hélice a et une diminution du contenu en feuillet p\

Les propriétés mécaniques remarquables de la soie d'araignée font d'elle la fibre les plus prisée de toutes les fibres naturelles et synthétiques. Une compagnie canadienne de biotechnologie, Nexia a réussi à utiliser des chèvres comme système d'expression pour les protéines de soie d'araignée. Malheureusement, les propriétés mécaniques des fibres produites à partir de la soie de Nexia n'étaient pas à la hauteur de celles des fibres naturelles. Dans le but de produire des fibres synthétiques avec des propriétés mécaniques semblables à celles de la soie naturelle, l'étude du comportement des protéines de soie en solution et sous forme solide est nécessaire. C'est pourquoi des études structurales par RMN en solution et solide des protéines de Nexia et de soie naturelle ont été effectuées. Les résultats suggèrent que les structures désordonnées et en hélices de polyproline II en solution sont importantes pour l'étape préfilage et que ces structures se changent en feuillets-β pour former des cristaux qui confèrent la haute contrainte à la rupture des fibres de soie d'araignée. Les résultats suggèrent aussi la nécessité de forcer les interactions intermoléculaires soit mécaniquement et/ou en changeant les conditions physicochimiques des solutions de protéines pour former des feuillets-β orientés. Des études de RMN et de DLS nous ont permis d'obtenir des diamètres hydrodynamiques pour les protéines de soie en solution et suggèrent un processus de filage alliant des changements de pH, de sels et une augmentation des forces de cisaillement qui forcent les protéines à s'assembler et former des fibres. La baisse de pH dans le processus de filage favoriserait une population oligomérique des protéines. De plus, le sel aiderait à l'entreposage des protéines avant le filage et son absence forcerait les protéines à s'assembler et former un gel. La partie non répétitive conservée C-terminale des protéines de soie semble être d'une grande importance vue la conservation de cette partie de la protéine à travers les derniers 240 millions d'années d'évolution. Un résumé des études effectuées sur ce segment de protéine est également présenté. Des éléments nouveaux dans le processus de filage sont discutés à la lumière des résultats obtenus dans cette thèse.