La polarité cellulaire est un processus fondamental qui contrôle les spécificités fonctionnelle et physiologique de la plupart des cellules eucaryotes. Cette asymétrie intracellulaire repose sur l’existence de compartiments membranaires distincts, à la fois dans leur composition en protéines mais également en phosphatidyl-inositols (PIs). Ainsi, la mise en place et le maintien de la localisation asymétrique de modules multi-protéiques associés notamment aux protéines PAR sont essentiels pour l’élaboration des domaines de polarité cellulaire. Durant ma thèse, j’ai étudié les relations entre les protéines de polarité et les PIs dans le contrôle de la polarité cellulaire. Plus particulièrement, en utilisant la chambre ovarienne de Drosophile, j’ai cherché à caractériser la suite d’évènements qui en amont régule l’activité de la PIP5K, Skittles (SKTL), qui produit le PI(4,5)P2 et à caractériser les mécanismes moléculaires qui lient le PI(4,5)P2, SKTL et les protéines PAR dans le contrôle et le maintien de la polarité cellulaire. J’ai contribué à caractériser l’importance de PI(4,5)P2 majoritairement produit par SKTL, dans le maintien de la polarité apico-basale et lors de la morphogenèse des cellules folliculaires de la chambre ovarienne. Le PI(4,5)P2 assure la localisation apicale de PAR3 et le maintien des jonctions adhérentes, sans affecter la localisation de PAR1. Par une méthode de quantification précise, j’ai ensuite démontré dans l’ovocyte que SKTL et le PI(4,5)P2, probablement grâce au trafic vésiculaire, étaient requis pour à la fois l’accumulation à l’antérieur de PAR3 et son exclusion au postérieur qui se fait à partir du stade 9B. L’accumulation antérieure de PAR3 est également dépendante d’un transport Dynéine dépendant et de la kinase IKKε tandis que son exclusion postérieure dépendant des phosphorylations par PAR1. Enfin, j’ai également étudié les modifications post traductionnelles de SKTL et leur importance dans la polarité cellulaire. J’ai identifié la présence de palmitoylation et de phosphorylations dont certaines impliquent la kinase PAR1 et la phosphatase PP1. Ces phosphorylations pourraient avoir un lien avec le rôle de SKTL dans le trafic vésiculaire. Ces résultats permettent donc d’élucider certains mécanismes cellulaires qui contrôlent la mise en place et le maintien de la polarité des cellules en liant les PIs et les protéines PAR / Cell polarity is a fundamental process that controls cell’s functional and physiological specificities. This process relies on membranous compartments differently composed both on proteins and on phosphatidyl-inositols (PIs). Indeed, through their asymmetric localization, polarity proteins, such as the PAR proteins, are essentials to establish and maintain polarity of the cells. During my PhD, I studied the interplay between the polarity proteins and the PIs. Using the Drosophila egg chamber, as a model, I aimed to characterized the upstream events that regulate the PI(4,5)P2 producing kinase (PIP5K), Skittles (SKTL), activity and localization. I also studied the downstream molecular process that link the PI(4,5)P2, SKTL and the PAR proteins in cell polarity. I contributed to the characterization of the importance of PI(4,5)P2, mainly produced by SKTL in maintaining the apical-basal polarity and during the morphogenesis of the follicle cells. The PI(4,5)P2 is ensuring PAR3 and adherens junctions but not PAR1 proper localizations. Next, through a precise quantification method, I showed that SKTL and the PI(4,5)P2, probably via vesicular traffic, were also ensuring PAR3 proper localizations (anterior accumulation and stage 9B posterior exclusion) in the oocyte. PAR3 accumulation also relies on a Dynein mediated transport and the IKKε kinase while its posterior exclusion relies on PAR1 phosphorylation. Finally, I studied SKTL post translational modifications and their relevance on cell polarity. I identified palmitoylation and phosphorylations that are regulated by the kinase PAR1 and the phosphatase PP1. SKTL phosphorylations seem to be related to its role on the vesicular traffic. Altogether these results clarify some mechanisms involving both PIs and PAR proteins in cell polarity maintaining and establishment

Les divisions asymétriques permettent l’apparition de deux cellules filles différentes via la ségrégation polarisée de déterminants cellulaires pendant la division. La polarisation de la cellule mère est essentielle au bon déroulement des divisions asymétriques. Les précurseurs des organes sensoriels externes de la Drosophile (SOP) se divisent asymétriquement dans le plan de l’épithélium du thorax. La polarisation planaire des SOP dépend de la localisation asymétrique du complexe PAR (Baz-Par6-aPKC). Néanmoins, ces protéines sont aussi impliquées dans le maintient de la polarité apico-basale de l’épithélium. Les mécanismes régulant le remodelage de la polarité épithéliale, permettant la polarisation planaire du complexe PAR sont inconnus.Au cours de ma Thèse, j’ai développé une méthode d’analyse quantitative de la polarisation des protéines PAR au cours du temps. Je montre que Baz, Par6 et aPKC se sont asymétriques avant la mitose, et que cette polarisation dépend de la PCP (Planar Cell Polarity). J’ai également identifié Expanded (ex) et p120/catenin (p120ctn), dont l’expression est réduite dans les SOP, respectivement comme régulateurs de Crumbs et de la dynamique des jonctions. Leur inhibition promeut le remodelage de la polarité épithéliale et la polarisation des SOP.Un modèle de polarisation de la SOP est proposé, où l’inhibition spécifique d’ex et de p120ctn libère Par6-aPKC et Baz, permettant la formation du complexe PAR. Ce dernier interprète la PCP et devient asymétrique. Ainsi, ce travail relie la spécification de la SOP et sa division asymétrique, et propose un modèle général pour l’étude des divisions asymétriques dans les épithéliums. / During development, cell fate diversity can be generated by asymmetric cell division. As fate asymmetry can result from the unequal segregation at mitosis of cell fate determinants, polarization of the mother cell is essential for this process. The epithelial Sensory Organ Precursor cells (SOPs) divide asymmetrically within the plane of the notum epithelium in Drosophila. Planar polarization of mitotic SOPs critically depends on the asymmetric distribution of the PAR polarity complex. Nevertheless, PAR proteins are also involved in the maintenance of epithelial apico-basal polarity. When and how this epithelial polarity is remodelled to allow planar polarization of the PAR complex is unknown. During my thesis, I developed a quantitative live-imaging approach to monitor polarization of the PAR proteins. I showed that the three members of the PAR complex (Bazooka (Baz), Par6 and atypical Protein Kinase C (aPKC)) become planar polarized prior to mitosis and identified Planar Cell Polarity (PCP) as the initial symmetry breaking input. Expanded (Ex) and p120/catenin (p120ctn) were identified as SOP-specific regulators of Crumbs and AJ dynamics, respectively, that negatively regulate planar polarization in SOPs. This work led to a model whereby decreasing levels of Ex and p120ctn in SOPs increases free Par6-aPKC and Baz to promote the formation and polarization of the Baz-Par6-aPKC complex. Thus, this study links fate determination to asymmetric cell division and provides a general framework to understand how epithelial cells can divide asymmetrically despite having junctions.

Les acides chlorogéniques (CGAs) représentent une famille d'esters formés d'un dérivé de l'acide cinnamique conjugué à l'acide quinique ou shikimique. Ces métabolites secondaires produits par la voie des phénylpropanoides sont largement répandus chez les végétaux terrestres et sont une source majeure d'antioxydants alimentaires. Les esters hydroxycinnamoyl-CoA sont les précurseurs des CGAs et d'autres composés phénoliques tels que les lignines. Ces intermédiaires activés sont synthétisés à partir d'un acide hydroxycinnamique et du coenzyme A par la 4-coumarate CoA ligase (4CL) appartenant à la superfamille des enzymes formant des adénylates. Nicotiana tabacum 4CL2 a été utilisée pour la production d'esters et sa structure a été résolue par remplacement moléculaire. Deux gènes codant pour des hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransférases chez Coffea canephora ont été clonés. CcHCT et CcHQT, qui appartiennent à la superfamille des acyltransférases acyl-CoA-dépendantes, ont été surexprimées dans E. coli et purifiées à homogénéité. L'analyse par diffraction aux rayons X de cristaux de CcHCT a permis de déterminer sa structure par remplacement moléculaire. Un modèle a été dérivé par homologie de séquence pour CcHQT afin de proposer les déterminants de la préférence pour l'acide quinique ou shikimique. Des modélisations moléculaires ont été réalisées afin d'identifier les résidus potentiellement impliqués dans les intéractions enzyme-substrat. L'analyse par chromatographie liquide haute performance des réactions enzymatiques ont montré que ces enzymes sont capables de synthétiser l'acide 5-O-caféoylquinique mais aussi le diester 3,5-O-dicaffeoylquinique, qui est un composé majeur du grain de café avant mûrissement. La production de variants par mutagenèse dirigée a permis l'identification de résidus importants pour la catalyse des réactions de mono- et de diacylation. L'approche combinée de la biologie structurale et de l'enzymologie s'avère particulièrement utile pour mieux comprendre le rôle de HCT et HQT.

Les acides chlorogéniques (CGAs) représentent une famille d'esters formés d'un dérivé de l'acide cinnamique conjugué à l'acide quinique ou shikimique. Ces métabolites secondaires produits par la voie des phénylpropanoides sont largement répandus chez les végétaux terrestres et sont une source majeure d'antioxydants alimentaires. Les esters hydroxycinnamoyl-CoA sont les précurseurs des CGAs et d'autres composés phénoliques tels que les lignines. Ces intermédiaires activés sont synthétisés à partir d'un acide hydroxycinnamique et du coenzyme A par la 4-coumarate CoA ligase (4CL) appartenant à la superfamille des enzymes formant des adénylates. Nicotiana tabacum 4CL2 a été utilisée pour la production d'esters et sa structure a été résolue par remplacement moléculaire. Deux gènes codant pour des hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransférases chez Coffea canephora ont été clonés. CcHCT et CcHQT, qui appartiennent à la superfamille des acyltransférases acyl-CoA-dépendantes, ont été surexprimées dans E. coli et purifiées à homogénéité. L'analyse par diffraction aux rayons X de cristaux de CcHCT a permis de déterminer sa structure par remplacement moléculaire. Un modèle a été dérivé par homologie de séquence pour CcHQT afin de proposer les déterminants de la préférence pour l'acide quinique ou shikimique. Des modélisations moléculaires ont été réalisées afin d'identifier les résidus potentiellement impliqués dans les intéractions enzyme-substrat. L'analyse par chromatographie liquide haute performance des réactions enzymatiques ont montré que ces enzymes sont capables de synthétiser l'acide 5-O-caféoylquinique mais aussi le diester 3,5-O-dicaffeoylquinique, qui est un composé majeur du grain de café avant mûrissement. La production de variants par mutagenèse dirigée a permis l'identification de résidus importants pour la catalyse des réactions de mono- et de diacylation. L'approche combinée de la biologie structurale et de l'enzymologie s'avère particulièrement utile pour mieux comprendre le rôle de HCT et HQT.

Les acides chlorogéniques (CGAs) représentent une famille d'esters formés d'un dérivé de l'acide cinnamique conjugué à l'acide quinique ou shikimique. Ces métabolites secondaires produits par la voie des phénylpropanoides sont largement répandus chez les végétaux terrestres et sont une source majeure d'antioxydants alimentaires. Les esters hydroxycinnamoyl-CoA sont les précurseurs des CGAs et d'autres composés phénoliques tels que les lignines. Ces intermédiaires activés sont synthétisés à partir d'un acide hydroxycinnamique et du coenzyme A par la 4-coumarate CoA ligase (4CL) appartenant à la superfamille des enzymes formant des adénylates. Nicotiana tabacum 4CL2 a été utilisée pour la production d'esters et sa structure a été résolue par remplacement moléculaire. Deux gènes codant pour des hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransférases chez Coffea canephora ont été clonés. CcHCT et CcHQT, qui appartiennent à la superfamille des acyltransférases acyl-CoA-dépendantes, ont été surexprimées dans E. coli et purifiées à homogénéité. L'analyse par diffraction aux rayons X de cristaux de CcHCT a permis de déterminer sa structure par remplacement moléculaire. Un modèle a été dérivé par homologie de séquence pour CcHQT afin de proposer les déterminants de la préférence pour l'acide quinique ou shikimique. Des modélisations moléculaires ont été réalisées afin d'identifier les résidus potentiellement impliqués dans les intéractions enzyme-substrat. L'analyse par chromatographie liquide haute performance des réactions enzymatiques ont montré que ces enzymes sont capables de synthétiser l'acide 5-O-caféoylquinique mais aussi le diester 3,5-O-dicaffeoylquinique, qui est un composé majeur du grain de café avant mûrissement. La production de variants par mutagenèse dirigée a permis l'identification de résidus importants pour la catalyse des réactions de mono- et de diacylation. L'approche combinée de la biologie structurale et de l'enzymologie s'avère particulièrement utile pour mieux comprendre le rôle de HCT et HQT. / Chlorogenic acids (CGAs) represent a family of esters formed between a cinnamic acid derivative and quinic or shikimic acid. CGAs are secondary metabolites produced via the phenylpropanoid pathway by higher plants and are a major source of dietary antioxidants. Hydroxycinnamoyl-CoA esters are the precursors for CGAs and other phenolic compounds such as lignins. These activated intermediates are synthesized from a hydroxycinnamic acid and coenzyme A by 4-coumarate CoA ligase (4CL), which belongs to the adenylate-forming enzyme superfamily. Nicotiana tabacum 4CL2 was used to produce hydroxycinnamoyl-CoA esters and its structure was solved by molecular replacement. Two genes encoding hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferases from Coffea canephora were cloned. CcHCT and CcHQT, which belong to the acyl-CoA-dependent acyltransferase superfamily, were overexpressed in E. coli and purified to homogeneity. X-ray diffraction analysis of CcHCT crystals resulted in a structural solution by molecular replacement. A homology model was derived for CcHQT in order to propose some determinants of the preference for quinic or shikimic acid. Docking experiments were carried out in order to identify potential residues involved in enzyme-substrate interactions. High performance liquid chromatography analysis of enzymatic reactions showed that these enzymes are capable of synthesizing 5-O-caffeoylquinic acid but also the diester 3,5-O-dicaffeoylquinic acid, which is a major component of the coffee grain before ripening. The production of variants by site-directed mutagenesis enabled the identification of residues important for catalysis of the mono- and diacyltransfer reactions. The combined approach of structural biology and enzymology provides molecular insights into the role of HCT and HQT in CGA biosynthesis.