Les nématodes à galles (RKN), Meloidogyne spp. sont des petits vers parasites qui infectent les racines des plantes où ils induisent la formation de sites nourriciers. Les RKN sont des endoparasites à large gamme d'hôtes, englobant les principales espèces de plantes cultivées. Meloidogyne javanica, M. graminicola et M. incognita sont les principales espèces parasitant le riz (Oryza sativa). Le succès infectieux des RKN repose sur la production de protéines effecteurs de virulence, secrétées dans leurs glandes oesophagiennes et libérées dans les cellules de la plante hôte par leur stylet. La caractéristique principale des RKN est leur capacité à déréguler des cellules du parenchyme vasculaire pour induire la formation de cellules géantes multinucléées, à haute activité métabolique. Les processus moléculaires sous-jacents restent encore mal connus, alors que l’identification d’effecteurs de virulence et de leurs cibles végétales pourrait fournir de nouvelles perspectives pour le contrôle des RKN. Ainsi, les objectifs de cette étude étaient (1) d’évaluer le rôle de protéines de Meloidogyne sécrétées (MSP) au cours des interactions riz - RKN et (2) d'identifier des cibles des MSP parmi les principales protéines Hub d’Arabidopsis thaliana impliquées dans l'immunité des plantes, afin d'évaluer la fonction putative des MSP dans les cellules hôtes. Pour la première partie de notre étude, nous avons sélectionné trois MSP exprimées dans les glandes oesophagiennes et possiblement sécrétées. L’analyse de l’expression des gènes par RT-qPCR a montré que MSP2 est fortement exprimé dans les premiers stades du cycle du nématode, tandis que MSP18 et MSP19 sont activés au cours du parasitisme dans les racines du riz. Les essais de localisation subcellulaire dans les cellules d'oignon ont identifié le noyau (pour MSP2) et le cytoplasme (pour MSP7 et MSP18) comme compartiments cellulaires ciblés par les protéines du nématode. Des plants de riz (O. sativa Nipponbare) transgéniques ont été produits pour évaluer le rôle des MSP au cours des interactions riz-RKN. Des lignées de riz surexprimant MSP18 ont permis un taux de reproduction plus élevé de M. javanica et M. graminicola. Au contraire, des retards de développement et de reproduction de M. javanica ont été observés sur des lignées de riz exprimant des micro-RNAs capables de supprimer l’expression des gènes MSP2 ou MSP19. Ces données ont montré que MSP2, MSP18 et MSP19 peuvent être des gènes importants pour le parasitisme ou le développement du nématode. Les tests d'expression transitoire dans le tabac (Nicotiana benthamiana) ont montré que MSP18 peut interférer avec la mort cellulaire programmée déclenchée par INF1, ce qui suggère que MSP18 pourrait supprimer les voies de défense des plantes pour faciliter l’infection. Dans une deuxième partie de ce travail, des analyses systématiques en double-hybride chez la levure ont été menées pour vérifier les interactions protéine-protéine entre 6 MSP et 18 protéines Hub d’A. thaliana. Chez la levure, la protéine du nématode MSP400 interagit avec trois protéines Hub, l’Anaphase-Promoting-complex 8 (At-APC8) et les facteurs de transcription At-TCP14 et At-TCP15. L'interaction physique de MSP400 avec At-APC8, un régulateur clé du cycle cellulaire de la plante, a été confirmée in planta par complémentation bimoléculaire de fluorescence (BiFC). Ces résultats démontrent pour la première fois qu'un effecteur de nématode est capable d'interagir directement avec une protéine régulatrice du cycle cellulaire chez la plante, révélant un nouveau mécanisme utilisé par les RKN pour commander la machinerie du cycle de la cellule hôte et induire ainsi la formation du site d'alimentation. Les données obtenues dans cette étude élargissent considérablement notre connaissance des acteurs moléculaires qui contribuent à la pathogénicité des nématodes, mettant en évidence les différents mécanismes exploités par les RKN pour promouvoir la sensibilité des plantes. / Root-knot nematodes (RKN), Meloidogyne spp. are small parasitic worms that infect plant roots where they induce the formation of highly specialized nutrient feeding sites. RKN are endoparasites with a wide host range encompassing major plant crops, impairing effective specific control. Meloidogyne javanica, M. graminicola, and M. incognita are the principal RKN species responsible for rice (Oryza sativa) production losses. Successful plant infection is likely achieved by nematode effector proteins produced in their esophageal gland cells and released into the host plant cells through their stylet. In particular, one of the striking features of RKN is their ability to deregulate vascular parenchyma cells to induce the formation of multinucleated giant cells with a high metabolic activity in the roots. The molecular processes underlying plant-RKN interactions still remain poorly understood. Identification of nematode virulence effectors and their plant targets may provide new insights for developing control strategies towards RKN. Thus, the aims of this study were to (1) assess the role of Meloidogyne secreted proteins (MSP) in rice – RKN interactions and (2) identify MSP targets among the major Arabidopsis thaliana Hub proteins involved in plant immunity, to assess the putative MSP function into host cells. For the first part of our study, we selected three Meloidogyne-genus specific proteins expressed in esophageal glands and predicted to be secreted. Gene expression analysis by RT-qPCR showed that MSP2 is highly expressed in the early stages of the nematode cycle, while MSP18 and MSP19 are up-regulated during parasitism in rice roots. Subcellular localization assays in onion cells identified the nucleus (for MSP2) and cytoplasm (for MSP7 and MSP18) as the main cellular compartments targeted by nematode proteins. Transgenic rice (O. sativa Nipponbare) plants expressing the MSP cDNAs or artificial micro-RNAs (amiRNAs) able to silence MSP genes were used to assess the role of MSPs during rice-RKN interactions. Homozygous transgenic lines were inoculated with pre-parasitic juveniles (J2) and (i) the number and developmental stage of nematodes present in roots after 21 days, (ii) the number of egg masses laid after 28 days and, (iii) the number of next-generation hatched J2 after 45 days were assessed. Rice lines overexpressing MSP18 allowed a higher reproduction rate of M. javanica and M. graminicola. On the contrary, impaired M. javanica development and reproduction was observed in rice lines expressing amiRNAs against MSP2 or MSP19 genes. These data showed that MSP2, MSP18, and MSP19 genes might be important genes for nematode parasitism or development. Transient expression assays in tobacco (Nicotiana benthamiana) revealed that MSP18 interfered with the INF1-triggered programmed cell death, suggesting that MSP18 could suppress the plant defense pathways to facilitate nematode parasitism. In the second part of this work, systematic yeast-two-hybrid paired assays were conducted to check for protein-protein interactions between 6 MSP and 18 A. thaliana Hub proteins. In yeast, the nematode MSP400 protein interacts with three Hub proteins, the Anaphase-Promoting-Complex 8 (At-APC8) and the transcription factors At-TCP14 and At-TCP15. Physical interaction of MSP400 with At-APC8, a key plant cell cycle regulator, was confirmed in planta by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays. These results demonstrated for the first time that a plant parasitic nematode effector is able to directly interact with a cell cycle regulatory protein, revealing a novel mechanism utilized by RKN to control the host cell cycle machinery and thereby induce feeding site formation. The data obtained in this study significantly broaden our knowledge of the molecular players contributing to nematode pathogenicity, highlighting the different mechanisms exploited by RKN to promote plant susceptibility.

Salmonella est un pathogène intracellulaire dont la virulence dépend de la fonction de deux systèmes de sécrétion du type trois (T3SS). Les T3SSs sont responsables pour la transduction de protéines effectrices dans le cytoplasme de la cellule hôte afin d'initier l'invasion de la cellule et de former la vie intracellulaire de Salmonella. Plusieurs effecteurs forment la SCV et induisent un réseau de tubules qui est impliqué dans la stabilisation de la SCV. Il consiste de trois différents genres de tubules. Nous avons pu montrer que les protéines effectrices SseF et SseG sont responsables pour la formation d'un genre de ces tubules, les LAMP-1 negative tubules (LNTs). Leur fonction est importante puisque des souches de Salmonella qui induisent que des LNTs et ne pas d'autres tubules sont apte de créer une SCV stable. Ceci améliore la réplication et virulence in vivo comparé à des souches qui ne peuvent pas induire des tubules. En utilisant les LNTs comme modèle, nous avons essayé de comprendre la contribution des tubules à la formation de la SCV et aussi leurs interaction avec les endosomes tardives et les lysosomes (LE/lys). Nous avons découvert une contribution essentielle de la petite GTPase Arl8B à la fusion de tubules avec les LE/lys. Ainsi, le knockdown d'Arl8B réduit la capacité de reproduction de Salmonella dans la cellule hôte. Nous avons pu démontrer qu'une interaction entre l'effecteur SifA et Arl8B est responsable pour ces observations. / Salmonella is an intracellular pathogen, whose virulence relies on the function of two type three secretion systems (T3SSs). The T3SSs are responsible for the delivery of effector proteins into the host cell cytoplasm in order to mediate invasion of the cell and to shape Salmonella's intracellular life.Salmonella's intracellular survival and replication depends on its niche, the Salmonella containing vacuole (SCV), a compartment that is derived from host plasma membrane. Several effectors shape the SCV and give rise to a tubular network, which is implicated in the SCV's stabilization and consists of three different kinds of tubules. We were able to show that the effector proteins SseF and SseG play in concert to form one kind of tubules, the recently discovered LAMP-1-negative tubules (LNTs). Their function is important to Salmonella, as strains having only LNTs but none of the other tubules are able to create a stable SCV, which leads to better replication and virulence in vivo compared to a strain that lacks in tubule formation. Starting from these LNTs as working model, we tried to understand the contribution of tubules to the formation of the SCV and their interactions with the late endosomal / lysosomal compartment (LE/lys). We deciphered the small GTPase Arl8B to play an essential role in the fusion of tubules with LE/lys. Thereby, the knockdown of Arl8B reduced Salmonella's capability to replicate within host cells. We were able to show that an interaction between the effector SifA and Arl8B was responsible for our observations.

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Il a été établi que la majorité des plantes vasculaires abritent des micro-organismes endophytes bactériens et fongiques, qui peuvent coloniser les tissus végétaux et former des associations allant du mutualisme à la pathogénèse. Les symbioses végétales mutualistes les plus communes impliquent les champignons endo-mycorhiziens arbusculaires (AMF). Ces champignons s’associent aux racines des plantes et leur permettent d’améliorer leur nutrition minérale, tandis qu’ils bénéficient des composés produits par l'hôte. Toutefois, les plantes de la famille Ericaceae s’engagent plutôt dans des associations mutualistes avec les champignons mycorhiziens éricoïdes (ErMF). Ces derniers sont morphologiquement et taxonomiquement mal définis, en apparence distribués aléatoirement parmi les espèces issues des grandes divisions taxonomiques des Ascomycota et Basidiomycota. En raison de cette incohérence taxonomique et de l'absence d'une histoire évolutive explicative, la diversité réelle de ces champignons est mal caractérisée. De ce fait, ce projet vise à étudier le microbiote associé à la plante Ericaceae Vaccinium macrocarpon Aït (canneberge), axant la recherche sur les angles morphologiques, génomiques et transcriptomiques des champignons de type ErMF et autres endophytes capables de contrôler la croissance des agents phytopathogènes et de stimuler la croissance des plantes. Notre première démarche présentée dans le chapitre 2 s’est focalisée sur la caractérisation du microbiote endophyte bactérien et fongique de la canneberge, une plante vivace principalement produite en Amérique du Nord, notamment au Québec. Nous avons isolé et identifié 180 micro-organismes à partir de plantes de cultivars variés, collectées de champs différents, et avons démontré l'existence d'une variabilité dans le microbiote selon les tissus, les cultivars, et même entre les champs d'une même ferme. Parmi les endophytes d’intérêt identifiés, l’isolat fongique Lachnum sp. EC5 a stimulé la croissance des cultivars de canneberge Stevens et Mullica Queen et a formé des structures intracellulaires similaires à celles des ErMF à l’intérieur des cellules racinaires de la canneberge. De plus, l’isolat EB37 identifié Bacillus velezensis s’est révélé être un puissant agent antifongique, montrant cependant une tolérance particulière au champignon Lachnum sp. EC5, lors des tests de confrontation. Ce volet sera détaillé avec plus de précision dans le chapitre 4. Le chapitre 3 a porté sur l’analyse génomique comparative de l’isolat fongique Lachnum sp. EC5 avec plusieurs espèces de champignons Leotiomycetes ErMF, saprophytes et pathogènes. Nous avons analysé le sécrétome protéique prédit de ces champignons et mis en évidence que les gènes codant pour les enzymes de dégradation des parois végétales ne sont pas corrélés au mode de vie fongique (mycorhizien, pathogène ou saprophyte). A l’inverse, 10 protéines effectrices de Lachnum sp. EC5 prédites pour cibler spécifiquement un compartiment intracellulaire chez les cellules végétales ont des similarités avec celles d’espèces mutualistes comme Meliniomyces variabilis et Oidiodendron maius. Aussi, la protéine effectrice putative Zn-MP, prédite pour cibler, potentiellement, les chloroplastes végétaux nous permet de proposer un rôle dans le renforcement de l’immunité végétale. Le chapitre 4 s’est intéressé aux mécanismes de régulation d'expression de gènes induits lors de l’interaction entre le champignon Lachnum sp. EC5 et la bactérie B. velezensis EB37. Ces mécanismes ont été comparés à ceux activés chez la bactérie en présence de champignons pathogènes. Nous avons démontré une physiologique cellulaire bactérienne distincte en présence de Lachnum sp. EC5, dénotée par une faible expression des gènes induits lors du stress nutritif associé aux processus de sporulation, de formation du biofilm, de secretion de CAZymes et de lipopeptides. Nous avons suggéré que la sous-régulation de ces mécanismes serait essentiellement explicable par une disponibilité plus importante en glucose ou en d’autres sources de carbone préférentielles pour la bactérie. En réponse, le champignon Lachnum sp. EC5 a vécu différents changements morphologiques. Il aurait détoxifié ses environnements intra et extra-cellulaires et surexprimé sa voie de production de carbone dépendante du cycle du glyoxylate, générant ainsi des conditions favorisant un contact physique entre les deux micro-organismes. En conclusion, nous avons argumenté et documenté que la définition des ErMF basée uniquement sur des critères morphologiques est mal adaptée à catégoriser ces champignons. Notre approche multidisciplinaire a mis en évidence la diversité du microbiote de la canneberge, a étendu la notion d’ErMF à d'autres champignons jusqu'ici exclus de ce groupe, et a souligné l'importance des associations interspécifiques sur l’interaction ErMF-plantes. Ces avancées permettront d’améliorer nos connaissances sur le microbiote des plantes éricacées contribuant, au développement de solutions environnementales éco-responsables pour l’industrie de la canneberge. / It has been established that the majority of vascular plants harbour bacterial and fungal endophytes that colonize plant tissues, and thus form associations that range from mutualism to pathogenesis. Mycorrhizal fungi are a particular class of endophytes that associate with plant roots and enhance plant mineral uptake. The most common type of mutualistic plant symbiosis involves arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), whereas plants of the Ericaceae family instead engage in mutualistic associations with ericoid mycorrhizal fungi (ErMF). The ErMF group, in its current definition, includes both ascomycete and basidiomycete species, yet is morphologically, taxonomically and evolutionarily poorly defined, which implies that the group’s true diversity is not well understood. The objective of this project is to complement morphological information with genomic and transcriptomic data to better understand the role of ErMF in 1) controlling the negative effects of pathogenic infections, and 2) the potential plant growth stimulation for the Ericaceous plant Vaccinium macrocarpon Ait. Our first approach presented in Chapter 2 focused on the characterization of the bacterial and fungal endo-symbiotic microbiota of the Ericaceous plant, Vaccinium macrocarpon Ait (cranberry), a perennial plant mainly in North America, particularly in Quebec. We isolated ~180 distinct bacterial and fungal endophytes collected from roots, stems, and leaves of cranberry plants cultivated in Quebec, Canada. We show that the cranberry microbiome varies substantially between tissues, cultivars, and across fields of the same farm. Among the isolated endophytes, the fungus Lachnum sp. EC5 was found to promote the growth of cranberry cultivars Stevens and Mullica Queen, and to form intracellular structures resembling those other ErMF inside the cortical root cells. In addition, the bacterium Bacillus velezensis (EB37) has been found to be a potent antifungal agent. Interestingly, a confrontation test between EB37 and the fungus Lachnum sp. EC5 revealed a mutual tolerance, which we will describe later in chapter 4. In chapter 3, our project focused on the comparative genomic analysis of the fungus Lachnum sp. EC5 with several Leotiomycete ErMF, saprophytes and pathogens. We analyzed fungal secretomes and demonstrated that genes encoding plant cell wall degradation enzymes are conserved between the tested fungi which suggests that such proteins are not indicative of a particular fungal lifestyle. On the other hand, 10 effector proteins identified in Lachnum sp. EC5 were also only found in mutualistic fungi, such as Meliniomyces variabilis, Oidiodendron maius and have been reported to target the plant intracellular compartments. Also, the identification of the putative effector protein Zn-MP, specific to Lachnum sp. EC5 and predicted to target plant chloroplasts, suggest a role in the reinforcement of plant immunity. Chapter 4 focuses on the patterns of gene expression regulation induced in the biocontrol bacterium B. velezensis EB37 in interaction with the potentially mutualistic fungus Lachnum sp. EC5. These mechanisms were then compared to those activated when the bacterium is in the presence of pathogenic/saprophytic fungi. We demonstrated that in co-culture with Lachnum sp. EC5, EB37expresses fewer genes related to stress, and fewer related to the stationary phase which often involves production of bacterial biofilms and lipopeptides, such as mycosubtilin. We suggest that the lessened response to stress is related to an increased availability of glucose or other preferential sources of carbons for the bacterium. Conversely, Lachnum sp. EC5 in the presence of EB37 underwent morphological changes by a higher lateral branching., detoxified its external and internal environment by expressing both a catalase activity and efflux pumps, and overexpressed its glyoxylate cycle-dependent carbon production pathway, and thus promoting favourable conditions for close physical contact with the bacterium. In conclusion, we demonstrated that the morphological-based definitions are poorly adapted to the categorization of ErMF fungi. Our multidisciplinary approach highlighted the diversity of the cranberry microbiota, extended the notion of ErMF to other fungi hitherto excluded from this fungal group and underlined the importance of interspecific associations on the ErMF-plant interaction. These advances enhance our understanding of the Ericaceous plant microbiota and contributes to the development of sustainable solutions for the cranberry industry.