Les histones désacétylases de type 2 (HD2) ont été caractérisées chez le tabac comme étant des régulateurs négatifs de la mort cellulaire associée à la réponse hypersensible induite par la cryptogéine, un éliciteur protéique.Les principaux objectifs de cette thèse sont d’accroître nos connaissances générales sur les HD2 et de caractériser leur rôle dans la voie de signalisation induite par la cryptogéine.Nous nous sommes tout d’abord intéressé à l’évolution des HD2 au sein des Viridiplantae et nous avons défini deux groupes de HD2. Nous nous sommes ensuite focalisés sur l’évolution des HD2 dans le genre Nicotiana. Nous avons identifié chez le tabac six gènes codant sept isoformes de HD2. Les quatre isoformes de HD2 de Gr1 seraient redondants fonctionnellement.Pour mieux comprendre le mode d’action des HD2 à l’échelle moléculaire et étant donné que nous n’avons pas pu détecter d’activité enzymatique chez les HD2, nous avons tenté d’identifier les gènes cibles et les partenaires protéiques potentiels des HD2.Des expériences de puces à ADN nous ont permis d’identifier des gènes régulés par la cryptogéine de manière HD2 dépendante, parmi lesquels ERF3 qui pourrait constituer un gène majeur impliqué dans l’initiation de la mort cellulaire.Des expériences de co-immunopurification combinées à des analyses par spectrométrie de masse nous ont permis d’identifier des partenaires protéiques des HD2 dont l’histone H4.De manière générale, les résultats obtenus au cours de cette thèse soulèvent la question de savoir si les HD2 possèdent une activité HDAC intrinsèque et nous ont permis de mieux comprendre le rôle des HD2 dans la signalisation nucléaire induite par la cryptogéine. / Type 2 histone deacetylases (HD2s) have been characterized in Nicotiana tabacum as negative regulators of hypersensitive response (HR)-associated cell death induced by cryptogein, a proteinaceous elicitor secreted by Phytophthora cryptogea.The main objectives of this thesis are to increase our general knowledge about HD2s and to characterize their role in the signaling pathway induced by cryptogein.We first examined the evolution of HD2s in green plants and defined two groups of HD2s. We then focused on the evolution of HD2s in the genus Nicotiana. Six genes coding seven isoforms of HD2s were identified in N. tabacum. The four Gr1 HD2 isoforms are functionally redundant in the response to salt stress.To better understand the mode of action of HD2s at the molecular level, and since we – as well as other research groups – were unable to detect any enzymatic activity from HD2s, we tried to identify target genes and potential protein partners of HD2s.Microarray experiments allowed us to identify genes that are regulated by cryptogein in a HD2-dependant fashion. Among these genes, ERF3, coding an ethylene-responsive factor, could be a major gene involved in the initiation of HR-associated cell death.Co-immunopurification experiments combined with mass spectrometry analyses permitted us to identify protein partners of HD2s such as histone H4.Globally, the results obtained during this thesis call into question whether HD2s do have an HDAC activity themselves, or are associated into complexes containing HDACs from the RDP3/HDA1 family. These results also permitted us to better understand the role of HD2s in the nuclear signaling pathway induced by cryptogein in tobacco.

La protéine chaperonne CDC48 (Cell division cycle 48) est un acteur important du contrôle qualité des protéines chez les eucaryotes et est associée à divers processus physio(patho)logiques chez les mammifères. En revanche, son rôle au sein du règne végétal a été peu appréhendé. Ce travail de thèse s’inscrit dans l’étude des fonctions de CDC48 chez les plantes et concerne plus particulièrement son implication dans la réponse immunité induite chez le tabac par cryptogéine produite par l’oomycète phytophthora cryptogea.Trois stratégies ont été adoptées. Premièrement, la dynamique d’accumulation de la protéine CDC48 ainsi que les événements intracellulaires sous-jacents à la réponse immunitaire ont été étudiés à la fois dans des cellules de tabac sauvages et des cellules sur-exprimant la protéine CDC48 (lignée CDC48-TAP). Deuxièmement, une liste de protéines interagissant avec CDC48 a été établie suite à des expériences d’immuno-précipitation de CDC48 suivit d’analyses de spectrométrie de masse. Parmi celles-ci, la forme cytosolique de l’ascorbate peroxydase (cAPX), une enzyme impliquée dans la détoxication du H2O2 intracellulaire, a fait l’objet d’une étude ciblée. Enfin, ces travaux ont été complétés par une analyse bio-informatique de l’ensemble des partenaires de CDC48 identifiés chez le tabac et d’établissement du réseau d’interaction protéique de CDC48 chez Arabidopsis thaliana.Les principaux résultats obtenus ont montré que l’activation de la réponse immunitaire s’accompagne de l’induction d’une accumulation des transcrits et la protéine CDC48. De plus, une mort cellulaire précoce a été observée chez les cellules CDC48-TAP, suggérant un rôle de cette dernière dans la régulation de la réponse hypersensible. L’interaction physique entre CDC48 et cAPX a été confirmée par différentes approches. De façon intéressante, il s’est avéré que l’activité et la dynamique d’accumulation de cAPX sont fortement impactées par la surexpression de CDC48. En accord avec ses résultats, le statut rédox s’est également révélé altéré dans la lignée surexpresseur. Enfin, l’analyse bio-informatique du réseau d’interaction protéique de CDC48 a permis de dégager de nouvelles protéines cibles, en particulier celles impliquées dans le métabolisme de la S-adenosylméthionine, une molécule substrat des réactions de trans-méthylation et précurseur de l’éthylène et de la nicotianamine. De plus, cette analyse a confirmé son rôle dans du système de dégradation Ubiquitine/protéasome.Pour conclure, ce travail de thèse apporte de nouvelles informations quant au rôle de CDC48 dans la biologie des plantes. Il indique que celle-ci est mobilisée dans les cellules végétales exprimant une réponse immunitaire et impacte le statut rédox via la régulation du turnover de cAPX. De nouvelles pistes de recherche ont été dégagées, en particulier un rôle probable de CDC48 dans la régulation de la synthèse de la S-adenosylméthionine et de la réponse hypersensible suivant des mécanismes restant à déterminer. / The chaperone protein CDC48 (Cell division cycle 48) is a major regulator of the quality control of proteins and is involved in various cellular processes in animals and yeast. In contrast, the role of CDC48 in plants is poorly known. In the present work, we investigated the function of CDC48 in plant immunity thanks to the cryptogein/tobacco biological model, cryptogein being produced by the oomycete phytophthora cryptogea.Three strategies were carried out. First, the dynamic of accumulation CDC48 together with intracellular events inherent to the immune response were analyzed in both wild-type and CDC48 overexpressing tobacco cells (CDC48-TAP line). Second, a list if CDC48 partners was established based on immunoprecipitation assays followed by mass spectroscopy analysis. Among those partners the cytosolic form of acorbate peroxidase (cAPX), a central enzyme of the regulation of the redox status regulation, has been specifically studied. Finally, a computational analysis of the partner list of CDC48 and the subsequent generation of the protein-protein interaction (PPI) network of CDC48 in Arabidopsis thaliana were undertook.Our data indicated that the activation of the immune response is accompanied by an induction of the accumulation of both CDC48 transcript and protein. In addition, an early and exacerbated cell death was observed in the CDC48-TAP line, suggesting a role for CDC48 in the hypersensitive response. The interaction between CDC48 and cAPX was confirmed by different approaches. Interestingly, the activity of CDC48 and its dynamic of accumulation were strongly impacted in the CDC48 overexpressing line. Accordingly, a dysregulation of the redox status also occurred in this line. Finally, the computational analysis of the CDC48 PPI network highlighted new potential target proteins including proteins involved in the metabolism of S-adenosylmethionine, a substrate molecule of trans-methylation reactions and precursor of ethylene and nicotianamine.To summarize, this work provides new information about CDC48 in plant biology. It indicates that CDC48 is mobilized by plant cells undergoing an immune response and impacts the redox status through the regulation of the cAPX turnover. New research avenues emerged from our study, notably a putative role of CDC48 in the regulation of S-adenosylmethionine biosynthesis and in the establishment of hypersensitive response through process which remain to be investigated

Les maladies des plantes causées par les champignons sont un problème majeur en agriculture. Pour les contrôler, les gènes de résistance (R) qui permettent de développer des variétés de plantes résistantes sont des éléments clés. La majorité des gènes R codent pour des protéines NLRs caractérisées par la présence d'un domaine de liaison aux nucléotides (NB-ARC) et un domaine de répétitions riches en leucines (LRR). Ces protéines agissent comme des récepteurs immunitaires intracellulaires et reconnaissent des facteurs de virulence des agents pathogènes appelés effecteurs. Les champignons phytopathogènes possèdent de vastes répertoires d'effecteurs qui contiennent centaines de protéines sécrétés, de petites tailles et sans similarités de séquence entre elles.La première question abordée dans ma thèse concerne l’origine de l'immense diversité des effecteurs fongiques. Une analyse structurale a identifié une famille d’effecteurs de séquences différentes mais qui possèdent une structure conservée. Cette famille a été appelée MAX-effectors (Magnaporthe Avrs and ToxB like) et elle est particulièrement importante chez Magnaporthe oryzae, l'agent causal de la pyriculariose du riz. Par des analyses d'expression, j'ai confirmé que la majorité des effecteurs MAX de M. oryzae sont spécifiquement exprimés durant la phase précoce de l'infection, suggérant une fonction importante durant la colonisation de la plante. Les effecteurs MAX constituent la première famille d'effecteurs fongiques définis par leur structure. Cette étude apporte donc de nouvelles pistes pour l'identification d'effecteurs chez les champignons et contribue à une meilleure compréhension de l'évolution des effecteurs. En effet, le scénario observé chez les effecteurs MAX suggère que beaucoup d’effecteurs fongiques appartiennent à un nombre restreint de familles d'effecteurs définies par leur structure. La seconde question que j’ai abordée durant ma thèse est le mécanisme moléculaire de la reconnaissance des effecteurs par les NLRs. J'ai abordé cette question en étudiant la reconnaissance de l'effecteur AVR-Pia par le couple de NLRs RGA4/RGA5. Des travaux précédents ont montré que RGA5 agit comme récepteur et se lie directement à AVR-Pia tandis que RGA4 agit comme élément de signalisation constitutivement actif, qui, en absence de l’agent pathogène, est réprimé par RGA5. Un domaine de RGA5, normalement absent chez les protéines NLR et similaire à la chaperonne du cuivre ATX1 (domaine RATX1), interagit physiquement avec AVR-Pia. Il a été suggéré que ce domaine RATX1 puisse agir comme un leurre de la cible de virulence d’AVR-Pia. Ce leurre, intégré dans la structure de RGA5, permettrait de « piéger » l’effecteur par interaction directe et jouerait donc un rôle crucial dans sa reconnaissance spécifique. Grâce à une analyse structurale détaillée d’AVR-Pia j’ai pu confirmer le rôle central de l'interaction AVR-Pia-RATX1 dans la reconnaissance de cet effecteur ce qui conforte le modèle du « leurre intégré ». De plus, j’ai caractérisé la surface d'interaction avec laquelle AVR-Pia lie le domaine RATX1. De plus, j'ai détecté des interactions entre AVR-Pia et d'autres parties de RGA5, indépendantes du domaine RATX1, notamment les domaines NB-ARC et LRR. Ceci a permis de développer un modèle qui explique comment la liaison d’un effecteur à un récepteur NLR comportant un leurre intégré par différentes interactions indépendantes conduit à une reconnaissance très sensible et spécifique qui est peu affectée par des mutations ponctuelles de l’effecteur. En résumé, cette étude a produit des connaissances nouvelles sur la fonction des récepteurs des plantes de type NLRs et sur leur capacité à reconnaitre des effecteurs. Ceci contribue à une meilleure compréhension du système immunitaire des plantes, ce qui est un élément important pour l’obtention de cultures durablement résistantes aux maladies / Plant diseases caused by fungi constitute a worldwide threat to food security and disease resistance (R) genes that allow to breed resistant crops are key elements for efficient disease control. The vast majority of R genes code for NLR multi domain proteins characterized by nucleotide-binding and leucine-rich repeat domains and acting as intracellular immune receptors for pathogen-secreted virulence factors termed effectors. Phytopathogenic fungi possess huge effector repertoires that are dominated by hundreds of sequence-unrelated small secreted proteins. The first question I addressed in my PhD thesis is: how is the tremendous diversity of fungal effectors generated? A structural analysis had identified the family of sequence-unrelated but structurally conserved MAX-effectors (Magnaporthe Avrs and ToxB like) that has expanded specifically in Magnaporthe oryzae the causal agent of rice blast disease. By expression analysis, I confirmed that the majority of M. oryzae MAX-effectors are expressed specifically during early infection suggesting important functions during host colonization. MAX effectors are the first structurally defined family of effectors in fungi and this study gives therefore news clues for the identification of candidate effectors in fungi and constitutes a crucial step towards a better understanding of effector evolution. In fact, the scenario observed for MAX-effectors leads to the hypothesis that the enormous number of sequence-unrelated fungal effectors belong in fact to a restricted set of structurally conserved effector families.The second question I investigated in my PhD thesis is: what are the molecular mechanisms of effector recognition by NLR immune receptors? I addressed this question by studying recognition of the M. oryzae effector AVR-Pia by the rice NLR pair RGA4/RGA5. Previous work has shown that RGA5 acts as a receptor that binds directly to AVR-Pia while RGA4 acts as a constitutively active signaling protein that is, in the absence of pathogen, repressed by RGA5. This functional interaction involves formation of an RGA4/RGA5 receptor complex. By protein-protein interaction studies, I showed that complex formation involves interactions between the RA4 and RGA5 NB-ARC and LRR domains, in addition to previously identified interactions between the coiled-coil domains. AVR-Pia recognition seems not to induce dissociation of the RGA4/RGA5 complex but a ternary RGA4/RGA5/AVR-Pia complex could also not be detected consistently. How effector recognition is translated into receptor complex activation remains therefore to be elucidated in more detail in the future. Previous work has shown that a domain of RGA5 normally not present in NLRs and related to the copper chaperone ATX1 (RATX1 domain) interacts physically with AVR-Pia and may be crucial for effector recognition. The RATX1 domain was hypothesized to mimic the true host targets of AVR-Pia leading to the development of the ‘integrated decoy’ model that states that unconventional domains in NLRs act as decoys in the recognition of effector proteins. By detailed structure-informed analysis of AVR-Pia, I could confirm the pivotal role of the AVR-Pia-RATX1 interaction for effector recognition lending important support to the integrated decoy model. In addition, I could precisely characterize the interaction surface with which AVR-Pia binds to the RGA5 RATX1 domain. Finally, I detected interactions of AVR-Pia with other parts of RGA5, in particular the NB-ARC and the LRR domains. Based on these results, I developed a model that explains how such binding to several independent sites in NLRs leads to high overall affinity and robust effector recognition that is resilient to effector mutations. Taken together, this study provides important novel insight into NLR function and effector recognition and contributes by this to a better understanding of plant immunity which is crucial for generating durable disease resistance in crops.

L’activation des réponses immunitaires des plantes repose sur la reconnaissance de motifs moléculaires associés aux pathogènes (aussi appelés PAMP) par des récepteurs de l’immunité, également nommés PRR (pattern recognition receptors). La chitine, principal composant de la paroi des champignons, est un PAMP bien caractérisé qui induit des réponses de défense aussi bien chez les mammifères que chez les plantes.La première partie de cette étude met en évidence que deux chito-oligosaccharides, la chitine et le chitosan, agissent comme des PAMP chez la vigne (Vitis vinifera) puisqu’ils induisent des évènements précoces de signalisation, l’expression de gènes de défense et une résistance contre des agents pathogènes. Ces résultats suggèrent que des systèmes de perception existent chez la vigne. Une analyse phylogénétique a permis d’identifier trois récepteurs kinases à domaine LysM (LysM-RK ou LYK) chez V. vinifera (VvLYK1-1, -2, -3) appartenant au même clade que le récepteur à la chitine chez Arabidopsis et nommé AtCERK1 (Arabidopsis thaliana Chitin Elicitor Receptor Kinase 1). Leur analyse fonctionnelle a été réalisée par complémentation du mutant d’Arabidopsis Atcerk1, affecté dans la perception de la chitine. Nos résultats montrent que VvLYK1-1 et VvLYK1-2, mais pas VvLYK1-3, complémentent fonctionnellement le mutant Atcerk1 en restaurant l’activation des MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases) et l’expression de gènes de défense induits par les chito-oligosaccharides. De plus, l’expression de VvLYK1-1 chez Atcerk1 restaure la résistance basale à l’agent de l’oïdium de la vigne (Erysiphe necator).La seconde partie du projet s’est focalisée sur les éliciteurs oligosaccharidiques de type « damage-associated molecular patterns (DAMP) ». Ces molécules endogènes peuvent provenir de la dégradation de la paroi lors d’une attaque et sont capables d’activer les réponses immunitaires de la plante. Les DAMP les mieux caractérisés actuellement sont les oligogalacturonates (OG), des fragments de pectine qui induisent des réponses immunitaires chez de nombreuses espèces végétales dont l’activation de MAPK, la production d’H2O2, l’expression de gènes de défense et le dépôt de callose. Nous avons montré dans cette étude que les xyloglucanes (Xh), des fragments d’hémicellulose pariétale purifiés, induisaient l’activation de MAPK et l’expression de gènes de défense chez la vigne et Arabidopsis, afin d’induire une résistance contre le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea. Les Xh induisent également la production de resvératrol, une phytoalexine majoritaire chez la vigne, et un dépôt de callose chez Arabidopsis. Par une approche génétique, nous avons identifié certains composants de la signalisation induite par les Xh chez Arabidopsis. L’utilisation de mutants suggère que la résistance induite par les Xh contre B. cinerea est dépendante des voies de la camalexine, de l’acide salicylique, de l’acide jasmonique et de l’éthylène chez Arabidopsis. De manière globale, nos résultats mettent en lumière que les xyloglucanes peuvent être considérés comme de nouveaux éliciteurs de l’immunité chez la vigne et Arabidopsis. / Activation of the plant immune responses requires recognition of common pathogen-associated molecular pattern (PAMP) by their cognate pattern recognition receptors (PRR). Chitin, a major component of fungal cell walls, is a well-known PAMP that triggers defense responses in several mammal and plant species.In the first part of this study, we show that two chitooligosaccharides, chitin and chitosan, act as PAMPs in grapevine (Vitis vinifera) as they elicit immune signaling events, defense gene expression, and resistance against pathogens. These two PAMPs are active in grapevine suggesting that at least one perception system exists. Phylogenetic analysis clearly distinguished three V. vinifera LysM Receptor Kinases (VvLYK1-1, -2, -3) located in the same clade as the Arabidopsis Chitin Elicitor Receptor Kinase 1 (AtCERK1), which mediates chitin-induced immune responses. Their functional characterization was achieved by complementation assays in the Atcerk1 mutant, impaired in chitin perception. Our results provide evidence that VvLYK1-1 and VvLYK1-2, but not VvLYK1-3, functionally complement the loss of AtCERK1 function by restoring chitooligosaccharide-induced MAPK activation and immune gene expression. Moreover, expression of VvLYK1-1 in Atcerk1 restored penetration resistance to the non-adapted grapevine powdery mildew (Erysiphe necator).The second part of this study focused on damaged-associated molecular patterns (DAMP), endogenous molecules that can be released from the plant cell wall during an attack and activate the plant innate immunity. Until now, the best characterized DAMPs are oligogalacturonides (OG) coming from pectin fragments that induce innate immune responses in various plant species, including MAPK activation, H2O2 production, defense gene expression and callose deposition. In this study, we showed that purified xyloglucans (Xh), derived from the plant cell wall hemicellulose, elicit MAPK activation and immune gene expression in grapevine (V. vinifera) and Arabidopsis to trigger induced resistance against the necrotrophic fungus Botrytis cinerea. Xh also elicit the production of resveratrol, the main grapevine phytoalexin, and callose deposition in Arabidopsis. Using a genetic approach, we identified some signaling components of Xh-induced immunity. The use of Arabidopsis mutants suggests that Xh-induced resistance against B. cinerea is dependent on the camalexin, salicylate, jasmonate and ethylene pathways. Taken together, our data highlight that Xh can be considered as new elicitors of grapevine and Arabidopsis immunity.

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