Master of Science / Department of Plant Pathology / Erick D. DeWolf / Wheat blast, caused by Magnaporthe oryzae pathotype triticum, has emerged as a serious problem for wheat production in South America and recently emerged as a threat to wheat production in Bangladesh. To prepare for the possible introduction of wheat blast in to the United States, it would be helpful to identify areas of the country most at risk for blast epidemics. Because wheat blast occurs primarily in tropical and subtropical regions of the world, cold winter temperatures may restrict the establishment of the blast pathogen in the United States. Therefore, the first objective of this research was to quantify the freeze-thaw tolerance of the wheat blast pathogen in naturally infected wheat rachises from Bolivia and to measure the viability of the conidia after exposure to various treatments. The results indicate that exposing the fungus in moist residue to multiple freeze-thaw cycles is more damaging than exposing the fungus in moist residue to longer, single freezes. When in dry residue, the fungus was not harmed by the freeze-thaw cycles. Freezing and thawing of the wheat blast fungus in moist residue significantly affected its ability to produce viable conidia. The second objective of this research was to identify environmental conditions that could be conducive for wheat blast epidemics by examining historical epidemics of rice blast, caused by Magnaporthe oryzae pathotype oryza. The dataset used in this analysis consisted of 60 site-years of historical observations of rice blast levels from Arkansas, Louisiana, and Texas. These observations were coupled with monthly and weekly summaries of hourly weather variables based on temperature, relative humidity, precipitation, and regional moisture indices. Classification trees and logistic regression were used to identify variables associated with rice blast epidemics. The results indicate that rice blast epidemics are favored by cooler April temperatures and higher levels of precipitation in June. Preliminary models for rice blast based on these variables were able to correctly classify epidemic years with >75% accuracy. In the future, the results of this project will be used as part of a risk assessment for a wheat blast introduction and establishment in the United States.

The ascomycete fungus Magnaporthe oryzae, causative agent of rice blast disease, poses a threat to global food security, destroying enough rice to feed 60 million people each year. Characterization of the host-pathogen interaction between rice and M. oryzae is critical, as better understanding of the system may lead to better disease control strategies. The sequenced genome and repertoire of molecular tools available have made M. oryzae an ideal model system for understanding general plant-pathogen interactions as well. The objective of this dissertation was to characterize the M. oryzae homologs of Histoplasma capsulatum RYP (Required for Yeast Phase) genes that are required for transition to the parasitic phase. H. capsulatum is a human pathogen that undergoes a dimorphic switch from filamentous to yeast cell growth at 37°C, the host body temperature. Four H. capsulatum RYP genes were identified in a forward genetic screen to identify genes required for entry into the yeast phase. RYP1 is a member of the Gti1_Pac2 family, which contains previously characterized regulators of dimorphic switching. RYP2 and RYP3 are homologs of vosA and velB, members of the Velvet family, best characterized in Aspergillus nidulans, where they coordinate morphological differentiation with secondary metabolism. RYP4 is a zinc binuclear cluster protein, a main class in the zinc finger transcription factor family. Deletion of the M. oryzae RYP1 homolog, RIG1 (Required for Infectious Growth), resulted in a non-pathogenic mutant on susceptible rice cultivars, even upon removal of the host penetration barrier. Δrig1 was blocked in the transition to infectious hyphal growth, similar to H. capsulatum ryp1, which could not transition to the yeast phase. Deletion mutants of M. oryzae RYP2, RYP3, and RYP4 homologs were similar to the wild type in somatic growth and pathogenicity indicating that although RIG1 is a pathogenicity factor conserved in plant and animal pathogens, such conservation does not apply to all of the RYP pathogenicity genes identified in H. capsulatum. Δrig1 is the first M. oryzae mutant known to be blocked in production of primary infection hyphae. Overall, the study suggests limited parallels exist in phase transition of fungal pathogens of plants and animals.

No description available.

Host colonization is mediated through the secretion of effector proteins in order to neutralize host immune responses. However, the mechanism of the effector delivery during biotrophic invasion is not well defined in M. oryzae. In this thesis, I define the role of the exocyst complex, an evolutionarily conserved octameric protein complex involved in vesicle docking to the plasma membrane (composed of Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70 and Exo84), during infection-related development in M. oryzae. Like other filamentous fungi, M. oryzae, exocyst components localize to the vegetative hyphal tip distinct from the Spitzenkörper. However, at the initial stage of infection-related development all the exocyst components localise as a ring at the cortex of the appressorium and re-assembles around the appressorium pore in an actin-dependent manner in mature appressoria. I report that the septin network is required for the transition of exocyst ring from periphery to the appressorium pore. Deletion of Exo70 and Sec5 showed significant reduction in protein secretion and plant infection. I show that Sec6 is required for the exocyst assembly around the appressorium pore and effector secretion from the appressorium. I report that, during biotrophic invasion, effectors are secreted through a distinct pathway. Apoplastic effectors, Bas4 and Slp1 are secreted via a Golgi-dependent pathway while secretion of cytoplasmic effectors, Pwl2 and Bas1 meditates through a Golgi-independent pathway in which exocyst components Exo70 and Sec5 are involved.

Rice blast disease is caused by the filamentous ascomycete fungus Magnaporthe oryzae and is the most destructive disease of cultivated rice. The pathogen elaborates a specialized infection structure called the appressorium. The morphological and physiological transitions that lead to appressorium formation of M. oryzae are stimulated through perception of environmental signals and are tightly regulated by cell cycle checkpoints. External stimuli are internalized by a variety of intracellular MAP kinase signaling pathways, and the major pathway regulating appressorium morphogenesis and plant infection is the Pmk1 MAP kinase signaling pathway. The central kinase, Pmk1, is required for appressorium morphogenesis and the homeobox and C2/H2 Zn-finger domain transcription factor, called Mst12, is required for appressorium formation and tissue invasion. The Mst12 null mutant is able to form melanised appressoria, but it is non-pathogenic. To understand the mechanism of appressorium morphogenesis and penetration peg formation, genome-wide comparative transcriptional profiling analysis was performed for the Δpmk1 and Δmst12 mutant using RNA-seq and HiSeq 2000 sequencing. This thesis reports the identification of gene sets regulated by the Pmk1 signalling pathway and defines the sub-set of these genes regulated by Mst12. I show that a hierarchy of transcription factors is likely to operate downstream of Pmk1 to regulate the main processes required for appressorium morphogenesis and plant infection. I also report the role of Mst12 in cytoskeletal re-organisation and show that it is necessary for septin-dependent F-actin polymerisation at the base on the appressorium prior to plant infection. This is consistent with the major transcriptional changes observed by RNA-seq. The thesis also reports experiments that strongly suggest that appressorium mediated plant penetration is regulated by an S-phase checkpoint which operates independently of the conventional DNA damage and repair response, and the Cds1 and Chk1 checkpoint kinases. Transcriptional profiling results are consistent with the S-phase checkpoint operating downstream of the Pmk1 MAP kinase signalling pathway. An integrated model for the operation of the Pmk1/Mst12 signalling pathways and the hierarchical control of appressorium morphogenesis in the rice blast fungus is presented.

Plant-pathogenic fungi harbor various specialized metabolites including diterpenoids that function as hormones and virulence factors. The fungus Magnaporthe oryzae is the causal agent of rice blast disease and can infect over 50 grass species. We demonstrate that the rice blast fungus encodes two diterpene synthases that produce normal pimara-8,15-diene and manoyl oxide scaffolds. Phylogenetic analysis of diterpene synthases among rice blast pathotypes showed functional conservation of the two core diterpene synthases amongst all pathotypes and suggests further expansion in select grass species. These insights into the blast fungal terpenome may inform efforts to counteract deleterious phytopathogens in crucial food crops.

Le riz (Oryza sativa L) est la source principale d'alimentation pour plus de la moitié de la population mondiale (Khush, 2005). La production de riz devrait augmenter de plus de 40% en 2030 pour satisfaire la demande de croissance de la population. Chaque année, environ 25% de la production est perdue à cause des insectes ravageurs, des maladies et des mauvaises herbes (Khus, 2005). Des pertes semblables sont dues aux stress abiotiques comme la sécheresse. L'objectif de mon travail de thèse a consisté à étudier la fonction de deux facteurs de transcription (FT) à boîte MADS OsMADS25 et OsMADS26 dans la réponse aux stress ou dans le développement. Pour cela, j'ai généré des lignées de riz surexprimant les ADNc codant ces FT et aussi des lignées interférées pour le gène OsMADS26 en utilisant deux GST différentes pour induire de l'ARN interférence destiné à détruire les ARNm OsMADS26. Dans le cas du gène OsMADS25 qui appartient à un groupe de cinq gènes phylogénétiquement proches, j'ai généré des plantes exprimant la protéine OsMADS25 fusionnée avec le motif répresseur dominant de la transcription EAR. Les lignées T2 exprimant le FT OsMADS25 fusionné au motif EAR présentent un phénotype semblable à celui d'une lignée d'insertion de TDNA dans ce gène. Ces plantes sont caractérisées par une forte réduction du nombre de leur talle et par une hauteur plus importante de la talle principale. Les plantes qui surexpriment OsMADS25 natif ne présentent pas de phénotype particulier. Ceci suggère que le gène OsMADS25 pourrait être impliqué dans la régulation du nombre de talles chez le riz bien qu'il soit exprimé au niveau de la racine. Le mode d'action du gène OsMADS25 sur le contrôle du développement des méristèmes axillaire du riz reste à préciser. Les lignées interférées OsMADS26 présentent une meilleure résistance à Magnaporthe oryzae (Mo) et à Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Xoo), deux principaux pathogènes du riz, et aussi une meilleure capacité de restauration après l'application d'un stress hydrique par rapport aux lignées témoin tandis que les lignées surexprimant OsMADS26 sont plus sensibles à ces stress. Les analyses de QPCR et du transcriptome que nous avons effectuées ont mis en évidence l'expression constitutive plus élevée dans les lignées interférées de plusieurs gènes de réponse aux stress biotique et abiotique. Ces résultats suggèrent que OsMADS26 pourrait être un inhibiteur général des mécanismes de défense de la plante et que les plantes interférée OsMADS26 sont dans un statut physiologique de type primed-like qui leur permettent d'être plus résistantes aux stress. Les lignées interférées pour OsMADS26 sont très peu affectées dans leur développement. Le gène OsMADS26 est donc un gène très intéressant pour les programmes d'amélioration du riz / MADS-box transcription factors (TF) have been mostly characterized for their involvement of plant development such as floral organogenesis and flowering time. Some of them are involved in stress related developmental processes such as abscission, fruit ripening and senescence. Overexpression of the rice OsMADS26 TF suggested a function in stress response. Here we report that OsMADS26 interfered lines presented a better resistance against two major pathogens of rice, Xanthomonas oryzae (Xoo) and Magnaportae oryzae (Mo) and a better recovery capacity after a water stress period. Transcriptome analysis revealed that several biotic and abiotic stresses related genes were up regulated in OsMADS26 interfered lines. In addition QPCR analysis showed that the expression of a set of biotic and abiotic genes was induced when OsMADS26 interfered lines were infected by Xoo or submitted to a water stress. This indicated that OsMADS26 is a negative regulator of biotic and abiotic stress response in rice. Taking in account the data previously published that showed that inducible overexpression of OsMADS26 resulted in the activation of expression of genes involved in jasmonic acid or reactive oxygen species biosynthesis, we postulate that OsMADS26 may be a hub regulator of stress response in rice and that it may be posttranscriptional regulated to modulate negatively or positively rice response to various stresses.In addition we have shown in this thesis that an insertion mutant line disrupting the OsMADS25 gene is characterized by a reduced number of tiller. This phenotype was also obtained in transgenic lines expressing the OsMADS25 transcription factor fused with a dominant motif inhibitor of transcription. Thissuggested that OsMADS25 is involved in the control of tiller development in rice.Key words: Rice, stress, blast, tillering, MADS-box, transcription factor, OsMADS26, OsMADS25, transcriptome

Le pouvoir pathogène des microorganismes repose sur leur capacité à manipuler des processus cellulaires de l'hôte à l'aide de protéines sécrétées dans le tissu végétal : les effecteurs. En plus de leur rôle primordial dans le pouvoir pathogène, les effecteurs sont centraux pour la résistance des plantes. La reconnaissance de certains d'entre eux par des récepteurs du système immunitaire végétal, nommées protéines de résistance (R), déclenche la résistance de la plante. Cette thèse a permis la caractérisation moléculaire d'AVR-CO39, un effecteur du champignon pathogène du riz Magnaporthe oryzae. Nous montrons qu'AVR-CO39 est transloqué dans le cytoplasme des cellules infectées par un mécanisme indépendant de facteurs fongiques et est reconnu dans ce même compartiment par le produit du locus R nommé Pi-CO39. La surexpression d'AVR-CO39 dans des plantes transgéniques révèle que cet effecteur influence des processus développementaux et physiologiques du riz. Un crible double hybride dans la levure a permis d'identifier 9 protéines du riz potentiellement ciblées par AVR-CO39. Une d'elles, nommée RGA5, confère la résistance Pi-CO39 avec une seconde protéine R du riz appelée RGA4. Nos résultats indiquent que RGA4 induit l'activation de la défense tandis que RGA5 agit comme récepteur de protéines Avr. En effet, RGA5 interagit physiquement avec AVR-CO39 et AVR-Pia, un autre effecteur de M. oryzae, via un domaine C-terminal homologue à des protéines de liaison au cuivre. Cette thèse a donc permis l'identification d'un nouveau domaine de reconnaissance de protéines Avr et le développement d'un modèle mécanistique pour le fonctionnement de paires de protéines R chez les plantes. / Pathogenic microorganisms secrete numerous proteins during infection into the plant tissue to manipulate host cellular processes. These proteins are called effectors and are central to pathogenicity. Certain effectors are recognized by receptors of the plant immune system called resistance (R) proteins and this recognition triggers plant resistance. The objective of the thesis was the molecular characterization of AVR-CO39, an effector of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Localization studies indicate that AVR-CO39 is translocated into the cytoplasm of infected rice-cells by a mechanism independent of fungal factors and that it is recognized within this compartment by the product of the corresponding R locus Pi-CO39. Overexpression of AVR-CO39 in transgenic rice plants suggests that the effector influences plant physiology and development. Yeast two-hybrid screening identified 9 rice proteins potentially targeted by AVR-CO39. One of them, called RGA5, interacts with a second R protein, RGA4, to confer Pi-CO39 resistance. Our results suggest that RGA4 activates plant defense while RGA5 represses RGA4 function in the absence of effectors proteins and acts as an Avr receptor protein. Indeed, RGA5 physically interacts with AVR-CO39 and another M. oryzae effector named AVR-Pia through a previously undescribed C-terminal domain displaying homology to copper-binding proteins. Therefore, this work identified a new Avr recognition domain in R proteins and generated a new mechanistic model for the action of R protein pairs in plant resistance.

La pyriculariose provoquée par le champignon Magnaporthe oryzae constitue l’une des principales maladies du riz, avec des épidémies récurrentes et très destructrices qui touchent toutes les régions rizicoles. Outre les enjeux économiques et humanitaires liés à cette maladie, le statut de céréale modèle du riz et de champignon parasite modèle de M. oryzae font de l’interaction entre ces deux partenaires un modèle privilégié pour l’étude du contrôle génétique et moléculaire des relations hôte-pathogène. Les protéines effectrices, Avr, de M. oryzae sont sécrétées au cours de l’infection de la plante par ce champignon. Chez certaines variétés de riz ces effecteurs agissent comme des protéines d’avirulence. Elles sont reconnues par les protéines de résistance, R, et induisent une forte réponse de défense dont une mort cellulaire programmée appelée HR (hypersensitive response) à l’origine de la résistance de la plante. L’objectif de cette thèse est de déterminer les structures des protéines Avr, et R et celles des complexes Avr-R. L'analyse structure-fonction permettra d’identifier les domaines et les acides aminés importants pour l'activité des effecteurs et des protéines de résistance. Pour la réalisation de cette thèse, une large gamme de techniques de biologie moléculaire (PCR, clonage moléculaire), de biophysique (Fluorescence) et de biologie structurale (RMN, cristallographie aux RX) disponibles au laboratoire seront utilisées. Du point de vue fonctionnel, ces études devraient apporter de nouveaux éléments sur les fonctions végétales qui sont modulées au cours de l’infection et permettent ainsi à la maladie de s'établir en créant des conditions favorables à la mise en place du processus infectieux. / MAGNAPORTHE oryzae causes a devastating disease of rice known as rice blast, affecting all regions cultivating rice. In addition to the economic and humanitarian issues associated with the disease, rice and M. oryzae are widely accepted as models of cereal and fungus for studying genetic control and host-pathogen molecular interactions. The effector proteins, Avr of M. oryzae, are secreted during plant infection by the fungus. In some of the rice cultivation these effectors act as avirulence proteins. They are recognized by resistance proteins R, and induce a strong host response, including programmed cell death known as HR (hypersensitive response) leading to plant resistance. The purpose of the thesis is to elucidate the atomic structures of the proteins Avr, R and Avr-R complexes. Subsequent structure-function analysis will identify domains and important amino acids needed for the activity of the effector and resistance proteins. To carry out this thesis, a wide range of molecular biology techniques (pcr, molecular cloning), biophysics (fluorescence) and structural biology (NMR, X-ray crystallography) will be used. From the functional point of view, these studies will provide insight into mechanisms affecting host functions that are modulated during infection, thus creating favorable conditions for the infection process.

La résistance partielle aux agents pathogènes représente une source importante pour l'amélioration des plantes. Cependant les mécanismes moléculaires sous-jacents à ce type de résistance sont encore mal connus. L'interaction entre le riz et le champignon Magnaporthe oryzae est un modèle de choix pour ce type d'analyse, de nombreuses ressources génétiques et outils d'analyse fonctionnelle étant disponibles. Chez le riz, hormis le gène Pi21 qui contrôle la résistance partielle, aucune information biologique et fonctionnelle ne permet d'expliquer cette forme de résistance. En amont de ce travail de thèse, le phénomène de défense préformée a récemment été identifié ; il est défini par la corrélation entre l'expression des gènes liés à la défense avant infection et la résistance partielle à M. oryzae. L'identification de régulateurs de la résistance partielle et des défenses préformées a été l'objectif de cette thèse. Deux stratégies ont été adoptées. Une étude du transcriptome visant à sélectionner et caractériser des gènes candidats sur la base de leur profil d'expression constitutive a été réalisée. Une méthode de sélection par « guilt-by-association » s'est avérée efficace pour identifier des gènes impliqués dans la résistance de la plante. Les gènes AGO18, Z-BED, HSF23 et CaMBP ont été identifiés comme des régulateurs positifs des défenses de la plante. Les gènes HSF23 et CaMBP contrôlent l'expression constitutive des gènes liés à la défense mais leur sur-expression modifie la croissance des plantes. La sur-expression des gènes Z-BED et AGO18 n'a entraîné aucune modification de la croissance de la plante mais une augmentation de la résistance à M. oryzae, sans modification apparente de l'expression des gènes de défense testés. Le gène Z-BED code pour un facteur de transcription putatif dont on peut faire l'hypothèse qu'il contrôle un ensemble encore inconnu de l'arsenal de défense. Le gène AGO18 code pour une protéine argonaute potentiellement impliquée dans l'extinction de gène via la méthylation de la chromatine. Enfin le gène OB-fold est un régulateur négatif des défenses de la plante dont les cibles, potentiellement des ARN, restent à identifier.La deuxième approche a consisté en une détection de loci contrôlant la densité de lésions causées par M. oryzae. Une zone du génome, PRM1, contrôle ce phénotype, confère une résistance à un spectre de souches relativement large, semble contrôler l'expression de gènes de défense avant et au cours de l'infection, et enfin semble ralentir la croissance du champignon avant pénétration. Cette approche sans a priori renforce l'hypothèse que l'expression des gènes de défense avant infection est associée à la résistance partielle du riz à M. oryzae.De plus amples investigations seront nécessaires pour relier les phénotypes de résistance partielle tels que l'inhibition de la croissance pré-pénétration et la densité de lésions entre eux d'une part et d'autre part à l'expression des gènes de défenses avant infection / Partial resistance to pathogens is a major source for plant breeding. However, the molecular mechanisms underlying this type of resistance are still poorly understood. The interaction between rice and the fungus Magnaporthe oryzae is a model of choice for this type of analysis, many genetic and functional analysis tools being available. In rice, except for the Pi21 gene that controls partial resistance, no biological and functional information can explain this form of resistance. Prior to this thesis, the phenomenon of preformed defense has recently been identified; it is defined by the correlation between the expression of genes related to defense before infection and partial resistance to M. oryzae. Identification of partial resistance and preformed defense regulators has been the objective of this thesis. Two strategies were adopted.A transcriptome analysis to select and characterize candidate genes based on their constitutive expression pattern was performed. A method of selection by "guilt-by-association" has been effective in identifying genes involved in plant resistance. The genes AGO18, Z-BED, HSF23 and CaMBP were identified as positive regulators of plant defenses. The genes HSF23 and CaMBP control the constitutive expression of defense related genes, but their over-expression modifies plant growth. Over-expression of Z-BED and AGO18 genes does not affect plant growth but increases the resistance to M. oryzae, without apparent change in the expression of the defense genes tested. The Z-BED gene encodes for a putative transcription factor that likely controls an unknown set of the defense arsenal. The AGO18 gene encodes an Argonaute protein potentially involved in gene silencing via chromatin methylation. Finally the OB-fold gene is a negative plant defense regulator, and its hypothetical RNA targets remain to be identified.The second approach consisted of detection of loci controlling the lesions density caused by M. oryzae. A region of the genome, PRM1, controls this phenotype, confers resistance to a relatively wide range of isolates, appears to control the expression of defense genes before and during the infection, and finally seems to inhibit the growth of the fungus before penetration. This approach without a priori supports the hypothesis that the expression of defense genes before infection is associated with partial resistance of rice to M. oryzae.Further investigations are needed to link the resistance phenotypes such as partial inhibition of fungal growth pre-penetration and density of these lesions on the one hand, and the defense gene expression before infection on the other hand.