Le passage sélectif d'ions et de métabolites à travers les membranes biologiques est essentiel à de nombreux processus cellulaires fondamentaux. Au niveau de la membrane interne de la mitochondrie, la communication cellulaire et les processus d'échanges sont principalement assurés par les transporteurs mitochondriaux. Ces protéines membranaires jouent un rôle clef dans les fonctions métaboliques des cellules eucaryotes et leur dysfonctionnement est à l'origine d'un certain nombre de maladies graves chez l'homme Parmi les transporteurs mitochondriaux, deux familles ont été étudiées au cours de ce travail : les AACs (ADP/ATP Carriers) et les UCPs (UnCoupling Proteins). Deux systèmes de production hétérologue de ces transporteurs ont été mis en place : la synthèse in vitro et l'expression chez E. coli de protéines de fusion. Le premier a permis la production et la purification d'environ 0,6 mg de protéine par mL de réaction et le deuxième a été exploité afin de réaliser des caractérisations fonctionnelles des transporteurs ADP/ATP. Un test fonctionnel pour la protéine découplante a également été mis au point. Ce test, basé sur la mesure directe des courants électriques associés à l'activité de transport de l'UCP, à permis la caractérisation fonctionnelle de la protéine UCP1 native.

Dans cette étude, les aspects méthodologiques pour la production de structures cristallines à haute résolution des protéines membranaires ont été combinés et rapportés ici, ainsi que leur implication pour le cas biologique concret d'étude structurale des principes de fonctionnement de l'histidine kinase transmembranaire.Dans la cristallographie de rayons X, les échantillons de cristaux de protéines varient selon les tailles, les formes et les capacités de diffraction. Pour pouvoir collecter les données de diffraction de la manière la plus efficace, l'échantillon de cristaux doit être correctement caractérisé dans chaque cas particulier. L'analyse raster par rayons X est considérée comme la technique la plus viable pour le faire et dans ce contexte, une méthode d'analyse des échantillons de cristaux pour la cristallographie des protéines est présentée ici, qui est basée sur la technique de balayage des mailles par rayons X développée à l'ESRF. La méthode estime les positions, les tailles et la qualité de la diffraction de chaque cristal dans la zone scannée qui pourrait être plus utile pour la conception rationnelle du processus de collecte de données. La performance de la méthode est démontrée sur plusieurs échantillons de cristaux de protéines.Un autre goulot d'étranglement dans la production des structures cristallines des protéines est un problème de phase communément connu. Les techniques les plus répandues pour traiter la structure qui ne peut pas être résolue avec le remplacement moléculaire sont les techniques de mise en phase expérimentales basées sur SAD ou MAD. Cela implique l'incorporation de divers diffuseurs anormaux à la structure cristalline. Dans la liste des diffuseurs disponibles, les halogénures se distinguent surtout principalement par leur faible toxicité et leur facilité de manipulation, mais en même temps leur capacité à produire un signal anormal. Le protocole de cryo-trempage des cristaux de protéines dans des solutions contenant des halogénures s'est avéré efficace sur les structures protéiques solubles. Dans l'étude actuelle, ce protocole a été testé sur quatre structures cristallines différentes des protéines membranaires. Les résultats présentés indiquent et soutiennent de manière expérimentale que l'iodure pourrait être facilement et efficacement utilisé pour résoudre le problème de phase dans le cas des structures de cristaux de protéines membranaires.Le capteur histidine kinases est l'un des récepteurs transmembranaires les plus communs présents dans tous les royaumes de la vie. La compréhension des principes de signalisation transmembranaire de l'histidine kinases sensorielle est une question fondamentale qui reste actuellement sans réponse. Pour arriver à l'idée de quels changements structurels fournissent la transmission du signal à travers la membrane lipidique dans ce travail, la structure cristalline de la construction tronquée de l'histidine kinase NarQ d'Escherichia coli – un capteur de nitrates/nitrites – qui contient le capteur périplasmique, les hélices transmembranaires et le domaine HAMP au niveau du côté cytoplasmique a été déterminée dans les états lié à un ligand et l'apo muté. Les structures présentées fournissent un aperçu des changements de conformation qui se produisent dans le domaine transmembranaire et dans le domaine HAMP en aval pendant la transduction du signal induite par le ligand. L'avancement de la recherche structurelle a été grandement renforcé par l'implication des résultats méthodologiques présentés dans ce travail. Cet impact et, en particulier, les résultats prospectifs de ce travail aux disciplines méthodologiques et appliquées de la biologie structurale et de la cristallographie des rayons X en particulier sont discutés. / In this study the methodological aspects for producing high-resolution crystal structures of membrane proteins were combined and reported here as well as their implication for the concrete biologically-relevant case of structural investigation of transmembrane histidine kinase working principles.In X-ray crystallography protein crystal samples vary in sizes, shapes and diffracting abilities. To be able to collect the diffraction data in the most efficient way the crystal sample should be properly characterised on-axis in every particular case. Raster X-ray scan has been found to be the most viable technique to do so and in this context a method of crystal sample analysis for protein crystallography is presented here which is based on the X-ray mesh scan technique developed at the ESRF. The method estimates the positions, sizes and quality of diffraction of each crystal in the scanned area which could be further useful for the rational design of the data collection process. The performance of the method is demonstrated on several protein crystal samples.Another bottleneck in production of crystal structures of proteins is in commonly known phase problem. The most widespread techniques to deal with the structure that cannot be phased using molecular replacement are SAD or MAD-based experimental phasing. This implies incorporation of various anomalous scatterers to the crystal structure. In the list of available scatterers halides are particularly stood out mostly because their low toxicity and easiness of handling but at the same time their capability of producing anomalous signal. The protocol of cryo-soaking of the protein crystals in halide-containing solutions has shown to be successful on soluble protein structures. In the current study this protocol was tested on four different crystal structures of membrane proteins. The presented findings state and further support experimentally that iodide could be easily and successfully used for addressing the phase problem in the case of membrane protein crystal structures.Sensor histidine kinases are ones of the most common transmembrane receptors present in all kingdoms of life. The understanding of transmembrane signalling principles of sensor histidine kinases is a fundamental question that currently remains unanswered. In order to get to the idea of which structural changes provide the transmission of the signal across the lipid membrane in this work the crystal structure of the truncated construct of the histidine kinase NarQ of Escherichia coli – a sensor of nitrates/nitrites – which contains periplasmic sensor domain, transmembrane helices and HAMP domain at the cytoplasmic side was determined in the ligand-bound and mutated apo states. The presented structures provide an insight on the conformational changes occurring in the transmembrane domain and in the downstream HAMP domain during the ligand-induced signal transduction. The progress of the structural investigation was greatly enhanced by the involvement of the methodological findings presented in this work. This impact and as well the prospective outcomes of this work to both methodological and applied disciplines of structural biology and X-ray crystallography in particular are discussed.

L’obtention de la structure tridimensionnelle des protéines membranaires (PMs) est cruciale pour la chimie médicinale et la biochimie. Afin de maintenir les PMs en solution, et donc d’éviter leur agrégation, pour les études structurales et fonctionnelles, l’utilisation de détergents est indispensable. Cependant, la conformation des PMs en complexe avec les détergents pourrait être très différente de celle dans la membrane. Nous avons synthétisé une nouvelle famille de détergents, dans lesquels des carboxylates incorporés pourraient générer un réseau de ponts salins avec les acides aminés basiques des PMs, entraînant des interactions plus étroites qui pourraient préserver leur structure native. Les détergents dans lesquels la glycoconjugation a été réalisée par la réaction de cycloaddition d'azide-alkyne (CuAAC) catalysée par le Cu (I) ont montré une capacité remarquable à extraire, à stabiliser et à cristalliser les PMs étudiées. D'autre part, de nouveaux inhibiteurs efficaces d’ABCC2, une PM non cristallisée à ce jour, ont été identifiés par criblage : les 2-indolylméthylènebenzofuranones. De tels composés pourraient être considérés comme des outils pour étudier le rôle d’ABCC2 dans la pharmacocinétique des médicaments. / Understanding of tridimensional structure of membrane proteins (MPs) is crucial in medicinal chemistry and biochemistry. To maintain them in solution and consequently to prevent them from aggregation for structural and functional studies, utilization of detergents is indispensable. However, the conformation of MPs in complex with detergents could be very different from its membrane-embedded one. We synthetized new family of detergents, in which the incorporated carboxylates could generate a network of salt-bridges with basic-residue-enriched region of MPs, confer tighter interactions which could preserve their structural integrity. The detergents in which the glycoconjugation was achieved by Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) reaction showed remarkable capacity to extract, stabilize and crystallize studied PMs. On the other hand, novel inhibitors of ABCC2, a non-crystallized MP to date, were identified by screening: the 2-indolylmethylenebenzofuranones. Such compounds could be considered as useful tools to further investigate the role of ABCC2 in the pharmacokinetics of drugs.

Les protéines membranaires représentent environ 2/3 des cibles thérapeutiques. Le développement de nouveaux médicaments est toutefois limité par l'absence de données structurales pour de nombreuses protéines. Les protéines membranaires s'avèrent en effet difficiles à manipuler et à maintenir en solution ce qui complique leur étude structurale. Les protéines sont en général solubilisées grâce à des surfactants comme les détergents, les amphipols, les hémifluorés et les peptergents. Il est aussi possible de les étudier dans des conditions plus physiologiques en les insérant dans des membranes lipidiques telles que des liposomes, des bicelles, ou des nanodisques.Les nanodisques sont des particules protéolipidiques autoassemblées, composées de protéines d'assemblages et de lipides, qui constituent un système de membranes modèles très prometteur permettant de solubiliser des protéines membranaires dans un milieu dépourvu de détergent. D'autres avantages sont aussi la variabilité de la constitution en lipides et l'accessibilité des deux côtés de la membrane.Dans le cadre de ma thèse, j'ai mis au point l'insertion de plusieurs protéines membranaires en nanodisques afin de permettre leur caractérisation fonctionnelle, biophysique et structurale. Nous avons en particulier étudié le transporteur ABC BmrA impliqué dans la résistance aux antibiotiques et cherché à identifier les changements conformationnels de la protéine en nanodisques par microscopie électronique. Les interactions de la protéine YedZ, un homologue de NADPH oxydases, avec ses partenaires solubles potentiels ont été étudiés par différentes méthodes telles que le pontage chimique, la résonance plasmonique de surface et la spectrométrie de masse native. En parallèle, le mécanisme d'assemblage des nanodisques a été investigué. Une interaction entre les protéines d'assemblages et des cations divalents a été mise en évidence. Cette interaction a un effet sur l'oligomérisation de la protéine d'assemblage mais également sur l'homogénéité des nanodisques. Ces observations nous ont permis d'améliorer les conditions de préparation des nanodisques, condition déterminante pour le succès de nombreuses approches structurales. Nous avons pu en particulier explorer la possibilité de cristalliser ces particules en vue d'études cristallographiques. / Membrane proteins represent around 2/3 of therapeutic targets. However, the development of new drugs is hampered by the lack of structural data for many proteins. Membrane proteins are indeed difficult to handle and to maintain stable in solution, which complicates their study by structural methods. Proteins are usually stabilized by surfactants like detergents, amphipols, hemifluorinated compounds and peptergents. It is also possible to study those proteins in an environment mimicking their native conditions by incorporating them in lipid membranes such as liposomes, bicelles or nanodiscs.Nanodiscs are self-assembled proteolipidic particles, composed of a scaffold protein and lipids. This technology is a top-notch model membrane system, which provides a detergent free environment to study membrane proteins in solution. Further advantages are the possibility to vary the lipid composition and the accessibility of the incorporated protein from both sides of the membrane.During my PhD project, I have achieved the insertion of several membrane proteins into nanodiscs for functional, biophysical and structural characterizations. In particular, we have studied Bmra, an ABC transporter involved in multidrug resistance and tried to identify the conformational changes of the protein in nanodiscs by electron microscopy. The interaction of YedZ, a NADPH oxidase homologue, with potential soluble partners has been studied by various methods such as cross-linking, surface plasmon resonance and native mass spectrometry. In parallel, the mechanism of nanodiscs assembly has been investigated. An interaction between the scaffold protein and divalent cations has been revealed. This interaction influences the oligomerization of the scaffold protein but also the nanodiscs homogeneity. Those observations allowed us to improve the preparation of the nanodiscs, which was an essential step torward the success of many structural approaches. In particular, we were able to explore their accessibility to protein crystallography.

Les protéines de la famille Mep/Amt/Rh sont largement conservées dans l’évolution. Cette famille comprend les facteurs Rhésus dont les antigènes Rh humains sont les membres les plus notoires. Le rôle des protéines de type Mep/Amt/Rh en tant que transporteurs d’ammonium a largement été décrit chez les bactéries, les champignons et les plantes. Néanmoins, leur mécanisme de fonctionnement demeure élusif et la régulation de leur activité a été peu abordée chez les organismes eucaryotes. En utilisant comme modèles de la famille Mep/Amt/Rh les trois transporteurs d’ammonium de la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons tenté de comprendre les mécanismes de fonctionnement et de régulation de cette famille de protéines membranaires.<p>Nous montrons qu’un résidu aspartate, conservé dans la famille Mep/Amt/Rh et situé à proximité d’un vestibule cation-attractif, joue un rôle structural dans la reconnaissance de l’ammonium chez le transporteur Mep2. De plus, un résidu histidine très conservé dans le pore hydrophobe des protéines Mep/Amt/Rh est substitué par un aspartate chez un sous-groupe de transporteurs d’ammonium fongiques. Cette substitution permet de définir deux sous-familles fonctionnelles possédant des propriétés bien distinctes.<p>Nous montrons également que la kinase Npr1 intervient dans la modulation de l’activité intrinsèque des trois protéines Mep qui demeurent inactives mais stables à la membrane plasmique en absence de la kinase. <p>Hormis leur rôle dans le transport d’ammonium en tant que source d’azote, nous montrons que l’activité des protéines Mep est requise pour différentes réponses physiologiques. Une diminution d’entrée d’ammonium en absence des protéines Mep ou de leur régulateur positif Npr1 entraîne une dérépression des gènes soumis à la répression catabolique azotée ainsi qu’un défaut dans le repompage de l’ammonium catabolique excrété durant la croissance en présence d’autres sources azotées. Un rôle supplémentaire de senseur d’ammonium avait été attribué au transporteur Mep2 dans l’induction de la croissance filamenteuse en réponse à une limitation en ammonium. Nous montrons que l’état d’activité de la protéine Mep2 est étroitement lié à sa capacité à induire le développement filamenteux. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Ce mémoire porte sur l'étude des structures et des interactions membranaires de peptides amyloïdes dérivés de la transthyrétine (TTR10-20), de la protéine de prion (PrP110-136) et de l'amyloïde-β (Aβl-42). Grâce aux spectroscopies IR-TF et RMN, complémentées par des techniques de microscopic nous avons étudié la structure et les interactions entre TTR10-20 et PrP110-136 et des membranes modèles zwitterioniques (DMPC) et anioniques (DMPG). Finalement, les spectroscopies UV-Vis et de fluorescence ont permis d'étudier la cinétique d'agrégation d'Aβi-42. Les résultats démontrent que TTR10-20 a tendance à former des agrégats non-fibrillaires qui affectent davantage la dynamique des têtes polaires de DMPC. D'un autre côté, PrP110-136 forme une hélice transmembranaire avec DMPC, mais cette hélice semble préférer interagir avec les têtes polaires des vésicules de DMPG. Dans la dernière étude, nous avons déterminé qu'Aβl-42 commence à former des structures fibrillaires après une phase latente de 500 à 600 minutes.

Les chloroéthylurées (CEUs) sont de nouveaux agents antinéoplasiques dont l'effet sur les bicouches lipidiques dépend fortement de la nature de leur substituant R et est corrélé avec leur action pharmacologique. De plus, il a été démontré que certaines CEUs ont un effet sur la protéine VDAC (voltage-dependent anion channel). Nous avons étudié l'interaction entre sept CEUs et trois membranes modèles reproduisant les membranes mitochondriales externes et internes et la membrane du réticulum endoplasmique. Les résultats obtenus indiquent que les CEUs ont un effet important sur les membranes modèles. De plus, le positionnement des CEUs à l'intérieur de bicelles isotropes a été étudié par RMN du ' H en solution. Finalement, la protéine VDAC a été extraite et purifiée avec succès à partir de mitochondries et son insertion a été tentée dans le système modèle reproduisant la membrane mitochondriale externe. Les résultats démontrent que l'insertion dans la membrane modèle est inefficace.

Les spermatozoïdes subissent la maturation lors de leur passage dans l'épididyme sous l'influence de plusieurs facteurs et protéines encore méconnus. Le présent projet concerne l'étude des protéines induites par la présence des spermatozoïdes. Pour y arriver, des cellules épithéliales épididymaires immortalisées de souris ont été misent en co-culture pour étudier l'expression des protéines induites. Par ce procédé, une protéine a été identifiée comme étant sécrétée par les cellules épithéliales. La protéine en question est la fibuline-2 qui est exprimée entre autres, dans les membranes basales et au cours du développement embryonnaire. De plus, le transcriptome des cellules en culture a été étudié par macro-array ce qui a permis l'identification de plusieurs ARNm induits par les spermatozoïdes dont le CD49c qui est exprimé dans des conditions similaires à la fibuline2. En résumé, nos résultats semblent indiquer que la présence de spermatozoïdes pourrait effectivement influencer l'expression de gènes ainsi que la synthèse et la sécrétion de protéines par les cellules épididymaires. / When passing through the epididymis, the spermatozoon becomes mature by acquiring forward motility and fertilizing capacity. This maturation process is under influence of several unknown factors and proteins. Experiments were done to study the modification of transcriptom and proteome modulate by spermatozoa. Cell culture was done with epithelial epididymal cell lines which origined from transgenic mice in coculture with mouse spermatozoa. Experiment allows us to find a protein expressed only in co-incubation conditions named fibulin-2 which is found in basement membrane and during embryonic development. Also, study of transcriptom of PC-1 in presence of spermatozoa by Macro-array determines several mRNA induced by spermatozoa such as CD49c. This protein is expressed in same condition that fibulin-2. Together, these results strongly suggest that spermatozoa can modulate gene expression and de novo protein synthesis and secretion of epididymal cell. This novel finding provides new concept and working hypothesis to clarify how testicular factors, such as spermatozoa itself, initiate the activation and differentiation of epididymal epithelium during the sperm maturation process.