Les chloroéthylurées (CEUs) sont de nouveaux agents antinéoplasiques dont l'effet sur les bicouches lipidiques dépend fortement de la nature de leur substituant R et est corrélé avec leur action pharmacologique. De plus, il a été démontré que certaines CEUs ont un effet sur la protéine VDAC (voltage-dependent anion channel). Nous avons étudié l'interaction entre sept CEUs et trois membranes modèles reproduisant les membranes mitochondriales externes et internes et la membrane du réticulum endoplasmique. Les résultats obtenus indiquent que les CEUs ont un effet important sur les membranes modèles. De plus, le positionnement des CEUs à l'intérieur de bicelles isotropes a été étudié par RMN du ' H en solution. Finalement, la protéine VDAC a été extraite et purifiée avec succès à partir de mitochondries et son insertion a été tentée dans le système modèle reproduisant la membrane mitochondriale externe. Les résultats démontrent que l'insertion dans la membrane modèle est inefficace.

Le VDAC (Voltage-Dependent Anion-selective Channel) est un canal ionique de la membrane externe de la mitochondrie. Il est caractérisé par une haute conductance (4nS dans du KCl 1M) à des faibles différences de potentiel et des fermetures vers des niveaux de conductance inférieurs suite à l’application de voltages élevés. La selectivité de l’état de haute conductance est anionique alors que celle du principal état de faible conductance est fortement cationique. La structure secondaire et la fonction est bien conservée chez les animaux, les plantes et les champignons alors que les séquences sont très différentes (moins de 30% d’identités). Au sein des différents groupes, quelques isoformes coexistent.<p>La première partie du travail consiste à étudier l’évolution des isoformes de VDAC, à déterminer le nombre et les propriétés des isoformes. Nous montrons que les végétaux possèdent plus d’isoformes que les mammifères et que celles-ci sont également moins bien conservées. Nous avons défini trois classes d’isoformes sur base de leur charge nette :faiblement, moyennement ou fortement chargées. Les VDAC fortement exprimés et très bien conservés chez les champignons, les plantes et les animaux sont moyennement chargés. A l’opposé, les isoformes portant les plus hautes charges nettes sont très divergentes et peu exprimées. Ces particularités permettent pour la première fois de comparer les isoformes de groupes évolutivement distants.<p>Ensuite, pour relier la structure et la topologie du VDAC à sa fonction, nous avons construit un modèle topologique. Il consiste en feuillet bêta de 18 brins antiparallèles reployés de manière à former un tonneau transmembranaire présentant une courte hélice alpha à son extrémité aminoterminale. Le modèle est compatible avec les séquences de VDAC fongiques, végétaux et animaux. Il rend compte des résultats expérimentaux obtenus par spectroscopie infrarouge et par microscopie électronique de cristaux 2D. Enfin, les résultats d’études topologiques et fonctionnelles publiées dans la littérature supportent également notre modèle.<p>Nos travaux concernant le VDAC32 de Phaseolus coccineus a permis d’améliorer le protocole de purification et d’en obtenir la séquence. La structure et la stabilité du VDAC32 a été étudiée par spectroscopie infrarouge. L’étude de l’orientation du VDAC à l’aide de lumière infrarouge polarisée se base sur des modèles définissant deux angles, alpha et bêta correspondant à l’inclinaison de l’axe du tonneau par rapport à la normale à la membrane et l’inclinaison des brins par rapport à l’axe du tonneau. Nous proposons que l’angle alpha dépend également de l’asymétrie de la protéine. Nos mesures en spectroscopie infrarouge indiquent que la présence du VDAC diminue la température de transition de la membrane et que la structure protéique est sensible à la transition de phase des lipides membranaires. Enfin, nous montrons que la structure du VDAC est modifiée quand le rapport lipides/protéines diminue. L’orientation des brins bêta se rapproche de l’axe et les chaînes latérales des tyrosines deviennent moins ordonnées.<p>Les VDAC sont insérés dans la membrane mitochondriale qui contient environ 5% de stérols. Certains auteurs ont détecté le VDAC dans les membranes plasmiques. Ces dernières sont beaucoup plus riches en stérols. Nous montrons dans ce travail que le VDAC possède la même fonction dans des membranes contenant 0% ou 5% de stérols alors que sa structure est légèrement modifiée. Par contre, en présence de hautes concentrations en stérols, la fonction du VDAC est sensiblement altérée. Ces résultats suggèrent que le VDAC a des propriétés différentes dans la membrane plasmique et dans l’enveloppe de la mitochondrie.<p> / Doctorat en sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chez les végétaux, peu de canaux ioniques sont identifiés moléculairement. Nos travaux, par l’apport de preuves fonctionnelles, mettent en évidence les propriétés électrophysiologiques d’une protéine de la membrane mitochondriale externe (MOM) de Phaseolus coccineus, VDAC32. Nous montrons que cette protéine forme un canal partageant plusieurs caractéristiques électrophysiologiques typiques des canaux anioniques voltages dépendants (VDACs) (cinétique d'ouverture et de fermeture, sensibilité au voltage, conductance relativement grande, courbe de voltage dépendance en forme de cloche). <p>Nous avons constaté que la concentration saline avait un effet sur la voltage-dépendance du canal. En effet, le VDAC devient insensible à la différence de potentiel appliquée lorsqu'il est reconstitué dans des concentrations physiologiques en sel. Nombreuses sont les expériences réalisées dans des conditions non physiologiques (1 M KCl), mais nous montrons dans ce travail que le canal ne se comporte pas de la même manière en conditions physiologiques (0,1 M KCl).<p>La première partie de notre travail a été consacrée à l’étude de l’effet du cholestérol et deux phytostérols les plus abondants (sitostérol et stigmastérol) sur la voltage-dépendance du VDAC. Dans ce chapitre, nous avons montré l’effet des stérols sur la fonction des canaux ioniques au niveau moléculaire. Le rôle des stérols sur la sélectivité et la voltage-dépendance du VDAC a été mis en évidence. L’étude des phytostérols a permis de comprendre comment les propriétés du VDAC peuvent être modulées avec le type de stérol et son abondance dans la membrane. De même, la réversibilité de l’effet des phytostérols sur le VDAC en présence de la Méthyle-β-cyclodextrine a été prouvée. La conductance unitaire n’était pas affectée par l’addition des stérols.<p>Le deuxième chapitre de cette thèse a été consacré à l’étude des deux principaux phospholipides membranaires ;la phosphatidylcholine (PC) et phosphatidyl-éthalamine (PE). Il a été montré qu’à des concentrations salines similaires à celles trouvées in vivo, la voltage-dépendance du VDAC est inhibée en présence de membrane formée de PC mais pas en présence de membrane formée de PE et/ou PE méthylé une fois et deux fois. De même, la voltage-dépendance est restaurée suite à l’ajout de 2% de phytostérol ou de 2% de PE ou lorsque le degré de méthylation de la choline diminue. L’effet des stérols sur la voltage-dépendance est réversible. Nous avons montré que la sélectivité aux anions augment lorsque le degré de méthylation de la choline diminue tandis que la conductance unitaire du canal est invariable.<p>Nos résultats indiquent que l’interaction lipide-protéine est essentielle pour la régulation de l’activité du canal VDAC. La nature de la tête polaire des lipides est déterminante pour cette régulation ce qui suggère qu’elle s’effectue au niveau de l’interface membrane-solution. <p>La suite de nos travaux nous a conduit à l’étude de l’effet du cation monovalent, divalent et trivalent sur le VDAC. Nous avons montré que la voltage-dépendance est perdue dans des concentrations faibles en KCl (100 mM) et que cette dernière est restaurée en présence de 800 mmolale en KCl ou 100 mM de calcium ou 30 mM de lanthane. Ces résultats suggèrent que la restauration de la voltage-dépendance à des faibles concentrations en sel (100 mmolale) impliquerait un effet électrostatique/In plants, only some ion channels are identified molecularly. By providing functional evidence, our work highlights electrophysiological properties of the outer mitochondrial membrane (MOM) protein of Phaseolus coccineus, VDAC32. We show that this protein forms a channel sharing several typical electrophysiological characteristics of voltages dependent anion channels (VDACs) (gating kinetics, voltage sensitivity, relatively large conductance, voltage dependence curve bell-shaped).<p>We found that the salt concentration had an effect on the voltage-dependence of channel. Indeed, VDAC becomes insensitive to the applied potential difference when it was reconstituted in physiological salt concentrations. The greater part of the experiments were performed under non-physiological conditions (1 M KCl), but we show in our work that the channel does not have the same behavior under physiological conditions (0.1 M KCl).<p>The first part of our work has been devoted to the study of the effect of cholesterol and the two most abundant phytosterols (sitosterol and stigmasterol) on the VDAC voltage dependence. In this chapter, we have shown the effect of sterols on ion channel function at the molecular level. The role of sterols on the selectivity and the voltage-dependence of VDAC was highlighted. The study of phytosterols helped us to understand how the properties of VDAC can be modulated with the type of sterol and its abundance in the membrane. Similarly, the reversibility of the effect of phytosterols on the VDAC in the presence of Methyl-β-cyclodextrin has been proven. The unit conductance was not affected by the addition of sterols.<p>The second chapter of this thesis was devoted to the study of the two major membrane phospholipids, phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethalamine (PE). It has been shown that in similar salt concentrations to those found in vivo, the VDAC voltage-dependence is inhibited in the presence of membrane formed by PC but not in the presence of membrane formed by PE and/or PE methylated once and two times. Similarly, the voltage-dependence is recovered following the addition of 2% of phytosterol or 2% of PE or when the degree of methylation of choline decreases. The effect of sterols on the voltage-dependence is reversible. We have shown that the anion selectivity increases when the degree of methylation of choline decreases while the unitary conductance of the channel is invariable.<p>Our results indicate that lipid-protein interaction is essential for the regulation of the activity of VDAC channel. The nature of the lipids polar head is crucial for this regulation suggesting that it occurs at the membrane-solution interface.<p>The rest of our work has led us to study the effect of monovalent, divalent and trivalent cation on VDAC. We have shown that the voltage-dependence is lost in low concentrations of KCl (100 mM) and it is restored in the presence of 800 mmolale of KCl or 100 mM of calcium or 30 mM of lanthanum. These results suggest that the restoration of the voltage-dependence at low salt concentrations (100 mmolale) involve an electrostatic effect.<p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les mitochondries sont des organites dynamiques dont la morphologie dépend de l’équilibre fusion/fission de leurs membranes. Ce processus essentiel à la survie cellulaire est nommé dynamique mitochondriale et sa dérégulation est associée à des troubles neurologiques. Cependant les mécanismes précis régissant la dynamique mitochondriale ne sont pas élucidés. Cette thèse porte sur la protéine Fzo1p, une grande GTPase de la superfamille des Dynamin-related-Protein. C’est un élément clé impliqué dans la fusion mitochondriale de la membrane externe de la levure. Sa structure et sa dynamique ont été étudiées par modélisation et simulations de dynamiques moléculaires tout-atome dans une bicouche lipidique solvatée. Le modèle structural obtenu tient compte de données expérimentales, de template structuraux, et de modèles ab initio du domaine transmembranaire de Fzo1p. Ce modèle a été validé expérimentalement par mutagenèse dirigée. Des permutations de charges ont confirmé des ponts salins à longue distance prédits dans le modèle. En outre, des mutations ont montré que les domaines coiled-coil de Fzo1p, contrairement à sa partie N-terminale, sont indispensables à sa fonction. L’ensemble des résultats expérimentaux et in silico met en évidence l’implication des domaines charnières dans le changement conformationnel de Fzo1p, ainsi que des résidus critiques affectant sa stabilité. Les précisions atomiques obtenues sur l’interaction de Fzo1p avec le GDP permet de formuler des hypothèses sur le mécanisme moléculaire de la catalyse du GTP pour la fusion membranaire; voire à la compréhension de la dynamique mitochondriale. / Mitochondria are dynamic organelles whose morphology is determined by fusion and fission of their membranes. This essential process is known as mitochondrial dynamics. Defects in mitochondrial dynamics are associated with neurological disorders making the investigation of physiological relevance. However, the precise sequence of events that lead mitochondrial dynamics are still not well characterised. Fzo1p, a large GTPase of the Dynamin-Related Proteins superfamily, is a key component in mitochondrial outer membrane fusion in yeast. During this PhD project I built a model of the protein Fzo1p. The structure and dynamics of the model was investigated through molecular modelling and all-atom molecular dynamics simulation in a fully hydrated lipid bilayer environment. The Fzo1p structural model integrates information from several template structures, experimental knowledge, as well as ab initio models of the transmembrane segments. The model is validated experimentally through directed mutagenesis, for instance charge-swap mutations confirm predicted long-distance salt bridges. A series of mutants indicate that coiled-coil domains are required for protein function at variance with its N-terminal region. Overall, the experimental and in silico approaches pinpoint the hinge domains involved in the putative conformational change and identifies critical residues affecting protein stability. Finally, key Fzo1p-GDP interactions provide insights about the molecular mechanism of membrane fusion catalysis. The model provides insight on atomic level and proposes a structure that will be instructional to understanding mitochondrial membrane fusion.