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Structure et fonction du VDAC : aspects phylogénétiques et biochimiques

Smeyers, Mathias 09 September 2005 (has links)
Le VDAC (Voltage-Dependent Anion-selective Channel) est un canal ionique de la membrane externe de la mitochondrie. Il est caractérisé par une haute conductance (4nS dans du KCl 1M) à des faibles différences de potentiel et des fermetures vers des niveaux de conductance inférieurs suite à l’application de voltages élevés. La selectivité de l’état de haute conductance est anionique alors que celle du principal état de faible conductance est fortement cationique. La structure secondaire et la fonction est bien conservée chez les animaux, les plantes et les champignons alors que les séquences sont très différentes (moins de 30% d’identités). Au sein des différents groupes, quelques isoformes coexistent. La première partie du travail consiste à étudier l’évolution des isoformes de VDAC, à déterminer le nombre et les propriétés des isoformes. Nous montrons que les végétaux possèdent plus d’isoformes que les mammifères et que celles-ci sont également moins bien conservées. Nous avons défini trois classes d’isoformes sur base de leur charge nette : faiblement, moyennement ou fortement chargées. Les VDAC fortement exprimés et très bien conservés chez les champignons, les plantes et les animaux sont moyennement chargés. A l’opposé, les isoformes portant les plus hautes charges nettes sont très divergentes et peu exprimées. Ces particularités permettent pour la première fois de comparer les isoformes de groupes évolutivement distants. Ensuite, pour relier la structure et la topologie du VDAC à sa fonction, nous avons construit un modèle topologique. Il consiste en feuillet bêta de 18 brins antiparallèles reployés de manière à former un tonneau transmembranaire présentant une courte hélice alpha à son extrémité aminoterminale. Le modèle est compatible avec les séquences de VDAC fongiques, végétaux et animaux. Il rend compte des résultats expérimentaux obtenus par spectroscopie infrarouge et par microscopie électronique de cristaux 2D. Enfin, les résultats d’études topologiques et fonctionnelles publiées dans la littérature supportent également notre modèle. Nos travaux concernant le VDAC32 de Phaseolus coccineus a permis d’améliorer le protocole de purification et d’en obtenir la séquence. La structure et la stabilité du VDAC32 a été étudiée par spectroscopie infrarouge. L’étude de l’orientation du VDAC à l’aide de lumière infrarouge polarisée se base sur des modèles définissant deux angles, alpha et bêta correspondant à l’inclinaison de l’axe du tonneau par rapport à la normale à la membrane et l’inclinaison des brins par rapport à l’axe du tonneau. Nous proposons que l’angle alpha dépend également de l’asymétrie de la protéine. Nos mesures en spectroscopie infrarouge indiquent que la présence du VDAC diminue la température de transition de la membrane et que la structure protéique est sensible à la transition de phase des lipides membranaires. Enfin, nous montrons que la structure du VDAC est modifiée quand le rapport lipides/protéines diminue. L’orientation des brins bêta se rapproche de l’axe et les chaînes latérales des tyrosines deviennent moins ordonnées. Les VDAC sont insérés dans la membrane mitochondriale qui contient environ 5% de stérols. Certains auteurs ont détecté le VDAC dans les membranes plasmiques. Ces dernières sont beaucoup plus riches en stérols. Nous montrons dans ce travail que le VDAC possède la même fonction dans des membranes contenant 0% ou 5% de stérols alors que sa structure est légèrement modifiée. Par contre, en présence de hautes concentrations en stérols, la fonction du VDAC est sensiblement altérée. Ces résultats suggèrent que le VDAC a des propriétés différentes dans la membrane plasmique et dans l’enveloppe de la mitochondrie.
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Biochemische und –physikalische Charakterisierung von rekombinanten Porinen aus den beiden pathogenen Bakterien Nocardia farcinica und Vibrio cholerae sowie von nativen Porinen aus drei Streptomyces Arten

Kläckta, Christian January 2009 (has links) (PDF)
Die vorliegende Dissertation beschreibt detaillierte biochemische und biophysikalische Untersuchungen von rekombinanten Porinen aus den beiden pathogenen Bakterien Nocardia farcinica und Vibrio cholerae sowie von nativen Porinen aus drei Streptomyces Arten. Für die beiden pathogenen Vertreter sind bereits impermebable Zellwandstrukturen beschrieben worden (Daffe et al., 1993; Rodriguez-Torres et al., 1993). Für Streptomyces Arten ist keine vergeichbare, definierte äußere Zellwandbarriere bekannt. Im Fall von S. griseus konnten dennoch undefinierte, kovalente Lipidverknüpfungen mit der Peptidoglykanschicht nachgewiesen werden (Kim et al., 2001). Daher besteht die Notwendigkeit des Transports von Nährstoffen und anderer Moleküle auch bei Streptomyces Arten durch porenformende Proteine, so genannte Porine. Unter Porinen versteht man wassergefüllte Kanäle, die in zwei Klassen unterteilt werden können: allgemeine Diffusionsporen und substratspezifische Porine. Allgemeine Diffusionsporen filtern entsprechend der molekularen Masse der gelösten Substrate und weisen ein lineares Verhältnis zwischen Translokationsrate und Substratkonzentrationsgradient auf. Dagegen kann der Transport bestimmter Substanzen durch spezifische Porine mit einer Substrat-Bindestelle im Kanal durch die Michaelis-Menten-ähnliche Kinetik beschrieben werden. Diese Kanäle ermöglichen den schnellen Influx bestimmter Klassen von Substraten. / This thesis describes detailed biochemical and biophysical investigations of recombinant porins of both pathogenic bacteria Nocardia farcinica and Vibrio cholerae besides native porins of three Streptomyces strains. For both pathogenic strains used in this work impermeable cell-wall structures have already been described (Daffe et al., 1993; Rodriguez-Torres et al., 1993). However, there is little known about cell-wall composition in Streptomyes strains yet. It was shown that Streptomyces griseus contains lipids that are covalently linked to the peptidoglycan layer (Kim et al., 2001). Therefore it is conceivable that the transport of nutrients and other molecules across the outer membrane of Streptomyces strains is also enabled by pore-forming proteins, so called porins. Porins are water-filled channels which can be subdivided into two different classes, general diffusion pores and substrate-specific porins. General diffusion pores sort mainly according to the molecular mass of the solutes and show a linear relation between translocation rate and solute concentration gradient. Specific porins with a substrate-binding site inside the channel exhibit Michaelis-Menten-like kinetics for the transport of certain solutes and are responsible for the rapid uptake of different classes of solutes.
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Rôle de la porine OprD et du système d'efflux MexEF-OprN dans la résistance des souches cliniques de Pseudomonasb aeruginosa aux antibiotiques / Role of porin OprD and MexEF-OprN efflux system in antibiotic resistance of Pseudomonas aeruginosa clinical isolate

Richardot, Charlotte 03 December 2015 (has links)
Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste majeur des patients atteints de mucoviscidose. Les infections à P. aeruginosa sont souvent difficiles à traiter, notamment en raison de sa capacité à développer des résistances à plusieurs familles d'antibiotiques. Dans les années 1980, les carbapénèmes font leur apparition dans l'arsenal anti-pyocyanique. Toutefois, les premiers cas de résistance apparaissent rapidement en raison de la« perte» de la porine OprD, voie d'entrée spécifique de ces antibiotiques dans la bactérie. L'étude de 173 souches cliniques de P. aeruginosa, a permis de caractériser les mécanismes à l'origine de cette résistance. La perte de la porine résulte de mutations inactivant le gène oprD ou se traduisant par des substitutions d'acides aminés responsables d'altérations structurales de la porine. Le gène oprD peut également être réprimé par certains régulateurs de pompes d'efflux telles que MexEF-OprN. La surproduction de ce système suite à l'inactivation d'une oxydoréductase, MexS, chez les mutants nfxC in vitro, confère une résistance conjointe à plusieurs familles d'antibiotiques ainsi que la perte de la production de nombreux facteurs de virulence. Toutefois, les altérations retrouvées dans la protéine MexS de 22 mutants nfYC cliniques sont majoritairement des substitutions d'acides aminés qui compromettent peu la virulence. L'origine de la surproduction de la pompe MexEF-OprN et de la multi-résistance qui lui est associée chez les souches cliniques s'est révélée indépendante de mutations dans le gène mexS chez près de la moitié des isolats, indiquant indirectement la participation d'autres gènes dans la régulation de ce système d' efflux. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen which contributes to the decline of respiratory function in cystic fibrosis patients. Shortly after infection, the bacterium is able to develop various strategies to resist antibiotics of different classes. ln 1980's, new antibiotics, called carbapenems, are developed for anti-pyocyanic treatments. However, isolation of carbapenem resistant clinical strains of P. aeruginosa increases. Resistance to carbapenem mainly results from loss of porin OprD, the major route of entry of these molecules in the bacteria. Aim of this study is to characterize the mechanisms of this resistance through 173 clinical isolates of P. aeruginosa. Loss of porin OprD is mostly due to mutations inactivating oprD gene or generating deleterious amino-acid substitutions in the porin structure. Gene oprD can also be down-regulated by efflux system regulators such as Mexî, the transcriptional activator of MexEF-OprN efflux pump. Overexpression of mexEF-oprN in laboratory-selected nfxC mutants is caused by inactivation of an oxydoreductase, MexS, leading to resistance to fluoroquinolones, chloramphenicol and carbapenem and loss of production of several virulence factors. Analysis of 22 non-redundant clinical nfxC mutants showed that (i) in contrast to in vitro selected counterparts only 3 of them harbored a disrupted gene mexS, (ii) 9 contained amino-acid substitutions in MexS associated with moderate effects on resistance an virulence factors production and (iii) 1 O did not display mutations in any of the regulators known to control mexEF-oprN expression, indicating that other loci are responsible for the pump upregulation.
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Structure et fonction du VDAC: aspects phylogénétiques et biochimiques

Smeyers, Mathias 09 September 2005 (has links)
Le VDAC (Voltage-Dependent Anion-selective Channel) est un canal ionique de la membrane externe de la mitochondrie. Il est caractérisé par une haute conductance (4nS dans du KCl 1M) à des faibles différences de potentiel et des fermetures vers des niveaux de conductance inférieurs suite à l’application de voltages élevés. La selectivité de l’état de haute conductance est anionique alors que celle du principal état de faible conductance est fortement cationique. La structure secondaire et la fonction est bien conservée chez les animaux, les plantes et les champignons alors que les séquences sont très différentes (moins de 30% d’identités). Au sein des différents groupes, quelques isoformes coexistent.<p>La première partie du travail consiste à étudier l’évolution des isoformes de VDAC, à déterminer le nombre et les propriétés des isoformes. Nous montrons que les végétaux possèdent plus d’isoformes que les mammifères et que celles-ci sont également moins bien conservées. Nous avons défini trois classes d’isoformes sur base de leur charge nette :faiblement, moyennement ou fortement chargées. Les VDAC fortement exprimés et très bien conservés chez les champignons, les plantes et les animaux sont moyennement chargés. A l’opposé, les isoformes portant les plus hautes charges nettes sont très divergentes et peu exprimées. Ces particularités permettent pour la première fois de comparer les isoformes de groupes évolutivement distants.<p>Ensuite, pour relier la structure et la topologie du VDAC à sa fonction, nous avons construit un modèle topologique. Il consiste en feuillet bêta de 18 brins antiparallèles reployés de manière à former un tonneau transmembranaire présentant une courte hélice alpha à son extrémité aminoterminale. Le modèle est compatible avec les séquences de VDAC fongiques, végétaux et animaux. Il rend compte des résultats expérimentaux obtenus par spectroscopie infrarouge et par microscopie électronique de cristaux 2D. Enfin, les résultats d’études topologiques et fonctionnelles publiées dans la littérature supportent également notre modèle.<p>Nos travaux concernant le VDAC32 de Phaseolus coccineus a permis d’améliorer le protocole de purification et d’en obtenir la séquence. La structure et la stabilité du VDAC32 a été étudiée par spectroscopie infrarouge. L’étude de l’orientation du VDAC à l’aide de lumière infrarouge polarisée se base sur des modèles définissant deux angles, alpha et bêta correspondant à l’inclinaison de l’axe du tonneau par rapport à la normale à la membrane et l’inclinaison des brins par rapport à l’axe du tonneau. Nous proposons que l’angle alpha dépend également de l’asymétrie de la protéine. Nos mesures en spectroscopie infrarouge indiquent que la présence du VDAC diminue la température de transition de la membrane et que la structure protéique est sensible à la transition de phase des lipides membranaires. Enfin, nous montrons que la structure du VDAC est modifiée quand le rapport lipides/protéines diminue. L’orientation des brins bêta se rapproche de l’axe et les chaînes latérales des tyrosines deviennent moins ordonnées.<p>Les VDAC sont insérés dans la membrane mitochondriale qui contient environ 5% de stérols. Certains auteurs ont détecté le VDAC dans les membranes plasmiques. Ces dernières sont beaucoup plus riches en stérols. Nous montrons dans ce travail que le VDAC possède la même fonction dans des membranes contenant 0% ou 5% de stérols alors que sa structure est légèrement modifiée. Par contre, en présence de hautes concentrations en stérols, la fonction du VDAC est sensiblement altérée. Ces résultats suggèrent que le VDAC a des propriétés différentes dans la membrane plasmique et dans l’enveloppe de la mitochondrie.<p> / Doctorat en sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Resistência aos carbapenêmicos e virulência de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa isolados de um serviço de saúde terciário

Dias, Vanessa Cordeiro 18 December 2015 (has links)
Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-05-04T14:54:05Z No. of bitstreams: 1 vanessacordeirodias.pdf: 2034556 bytes, checksum: 89059620f1b31c4177f6ae487a15c672 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-07T15:33:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vanessacordeirodias.pdf: 2034556 bytes, checksum: 89059620f1b31c4177f6ae487a15c672 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T15:33:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vanessacordeirodias.pdf: 2034556 bytes, checksum: 89059620f1b31c4177f6ae487a15c672 (MD5) Previous issue date: 2015-12-18 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / As bactérias Gram-negativas não fermentadoras, como Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, estão amplamente disseminadas no ambiente e estão cada vez mais associados a infecções nosocomiais graves. O uso extensivo e indiscriminado de antibióticos tem contribuído para um aumento do número de infecções causadas por A. baumannii e P. aeruginosa resistentes a uma grande variedade de agentes antimicrobianos, incluindo β-lactâmicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar características fisiológicas e moleculares da resistência aos carbapenêmicos em P. aeruginosa e A. baumannii isolados em um hospital terciário. A partir de estudos com amostras clínicas de pacientes admitidos num hospital terciário foram isolados, em 2012, A. baumannii (n=44) e P. aeruginosa (n=28) resistentes aos carbapenêmicos e em 2013, P. aeruginosa (n=19) e A. baumannii (n=44) com igual fenótipo. As amostras bacterianas recuperadas em 2012 foram submetidas a testes de susceptibilidade aos antimicrobianos. Marcadores genéticos relacionados com a síntese de β-lactamases blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaOXA-58 e blaOXA-143 foram testados por PCR. A partir das linhagens isoladas no estudo de 2013, testes fisiológicos foram realizados para avaliar a atividade hemolítica, estresse oxidativo, tolerância aos biocidas, formação de biofilme e determinação da resistência aos antimicrobianos. Marcadores genéticos relacionados com a síntese de β-lactamases (ampC, blaKPC, blaSIM, blaIMP, blaSPM-1, blaVIM, blaGIM, blaOXA e blaNDM-1), sistemas de efluxo (adeB, mexB, mexD, mexF e mexY) e perda de porina (oprD) foram pesquisados por PCR. Foram analisados dados epidemiológicos de todos os pacientes avaliados. No estudo de 2012, a polimixina B foi a única droga eficaz para todos os isolados. Os marcadores genéticos foram observados apenas em isolados de Acinetobacter. O genótipo mais frequente observado foi blaOXA-23+/blaOXA-51+ (45,5%), seguido por blaOXA-51+/blaOXA-143+ (41%). Os genes blaOXA-24 e blaOXA-58 não foram detectados. Uma elevada taxa de mortalidade foi observada (> 70%) entre os pacientes. No estudo de 2013, idade avançada, predomínio de indivíduos internados em UTI, uso de dispositivos médicos invasivos, como cateter venoso, tratamento anterior com fluoroquinolonas ou ß-lactâmicos em combinação com um inibidor da β-lactamase e estadia prolongada no hospital foram fatores predisponentes para infecção por estes microrganismos. Colistina demonstrou atividade, in vitro, contra todas as amostras bacterianas avaliadas. Tigeciclina foi também efetiva para linhagens de A. baumannii. P. aeruginosa resistente aos carbapenêmicos não foi capaz de produzir hemolisinas. Essas linhagens foram menos tolerantes ao estresse oxidativo e alguns biocidas, mas mostraram um aumento da capacidade de formação de biofilme em relação aos isolados sensíveis. Os principais mecanismos de resistência presentes em linhagens de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos foi síntese de oxacilinases (OXA-23, OXA-51 e OXA-143), ausência de oprD e presença de bomba de efluxo (AdeABC). Em P. aeruginosa foram encontrados genes para bombas de efluxo (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM), blaSPM-1, além de ausência de oprD. Estes resultados confirmam a dificuldade de manejo terapêutico de pacientes com infecções associadas a microrganismos multirresistentes, com impacto direto na mortalidade e controle epidemiológico dessas linhagens nos centros de saúde. / The non-fermenting Gram-negative bacteria, such as Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii are widespread in the environment and are increasingly associated with severe nosocomial infections. Extensive and indiscriminate use of antibiotics has contributed to an increased number of infections caused by A. baumannii and P. aeruginosa that are resistant to a wide variety of antimicrobials, including β-lactams. This study aimed to evaluate physiological and molecular characteristics of carbapenem resistance in P. aeruginosa and A. baumannii. From studies with clinical samples from patients admitted to a tertiary hospital, were isolated in 2012 A. baumannii (n=44) and P. aeruginosa (n=28) resistant to carbapenems and in 2013, P. aeruginosa (n=19) and A. baumannii (n=44) with similar phenotype. The bacterial samples recovered in 2012 were submitted to antibiotic susceptibility testing. Genetic markers related to β-lactamases synthesis blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaOXA-58 and blaOXA-143 were screened by PCR. From strains recovered in the 2013 study, physiological tests were performed to evaluate hemolytic activity, oxidative stress, biocides tolerance and biofilm formation, besides determination of antimicrobial resistance patterns. Genetic markers related to β-lactamases synthesis (ampC, blaKPC, blaSIM, blaIMP, blaSPM-1, blaVIM, blaGIM, blaOXA and blaNDM-1), efflux systems (adeB, mexB, mexD, mexF and mexY) and loss of porin (oprD) were screened by PCR. Epidemiological data about all of these patients were analyzed. In the 2012 study, polymyxin B was the only effective drug for all isolates. Genetic markers were observed only in Acinetobacter isolates. The most frequent genotype observed was blaOXA-23+/blaOXA-51+ (45,5%), followed by blaOXA-51+/blaOXA-143+ (41%). The genes blaOXA-24 and blaOXA-58 were not detected. High mortality rate (> 70%) between the pacients was observed. In a prospective study, advanced age, predominance of individuals hospitalized in ICU, use of invasive medical devices, such as venous catheter, previous treatment with fluoroquinolones or β-lactams in combination with β-lactamase inhibitor and prolonged stay in hospital were predisposing factors for infection by these microorganisms. Colistin has shown activity, in vitro, against all assessed bacterial samples. Tigecycline was also effective for strains of A. baumannii. Carbapenem-resistant P. aeruginosa was not able to produce hemolysin. These strains were less tolerant to oxidative stress and some biocides, but they showed increased ability of biofilm formation in relation to susceptible isolates. The major mechanisms of carbapenems resistance present in A. baumannii strains was oxacilinases synthesis (OXA-23, OXA-51 and OXA-143), oprD absence and efflux pump presence (AdeABC). In P. aeruginosa was found genes encoding efflux pumps (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM) and blaSPM-1; besides oprD absence. These results confirm the difficulty of therapeutic management of patients with infections associated with multidrug resistant microorganisms, with direct impact on mortality and epidemiological control of multidrug-resistant strains in health centers.
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Etude des relations structure-fonction du transporteur mitochondrial d'ADP/ATP et de ses interactions avec d'autres protéines membranaires mitochondriales.

Spira Afchain, Agathe 09 July 2007 (has links) (PDF)
La mitochondrie, organite présent chez toutes les cellules eucaryotes aérobies, est délimitée par deux membranes qui compartimentent des fonctions physiologiques essentielles. La membrane interne est une barrière que les métabolites ne peuvent franchir que grâce à des protéines spécifiques, dont le transporteur mitochondrial d'ADP/ATP. Un premier volet de cette thèse s'attache à la purification du transporteur bovin en complexe avec l'acide bongkrékique. Il s'inscrit dans le cadre des approches précédemment engagées au laboratoire, qui visent à résoudre la structure tridimensionnelle du transporteur bloqué dans différentes conformations impliquées lors de l'échange des nucléotides. Les résultats obtenus indiquent que ce complexe se dissocie lors de sa purification : il nous faut donc envisager d'autres stratégies pour le stabiliser avant d'en tenter la cristallisation. Les deux autres volets concernent deux protéines mitochondriales susceptibles d'interactions fonctionnelles avec le transporteur de la levure Saccharomyces cerevisiae. Ainsi, une protéine membranaire nommée yOm14, située dans la membrane externe des mitochondries, a été caractérisée et son interaction physique avec le transporteur clairement démontrée. La seconde protéine est la porine de levure yVDAC1, qu'une abondante littérature décrit comme étant un partenaire du transporteur. Elle a été purifiée en mettant en œuvre des méthodologies complémentaires, détaillées dans ce mémoire. Des essais de cristallisation vont désormais pouvoir être entrepris dans le but de résoudre sa structure tridimensionnelle et de pouvoir rechercher ainsi les bases moléculaires de son interaction avec le transporteur d'ADP/ATP.
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Modifications génétiques de Mycobacterium tuberculosis : interactions avec les organismes hôtes

Lamrabet, Otmane 25 September 2012 (has links)
Les mycobactéries sont classées parmi les bactéries contenant des acides mycoliques dans leur paroi et un haut GC% dans leur génome. Elles peuvent être isolées à partir du sol ou d'environnement d'eau douce où vivent aussi les protozoaires libres. Plusieurs études ont montré une possibilité de co-isolement des mycobactéries et des amibes à partir de ces sources environnementales. Il a été montré également que la plupart des mycobactéries de l'environnement ont la capacité à survivre dans les trophozoites et les kystes d'amibes et dans certaines cellules eucaryotes, y compris les macrophages. Les manipulations génétiques des mycobactéries en général et des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis en particulier sont compliquées et aucune étude de modification génétique des mycobactéries (pathogènes ou non pathogènes) n'avait été réalisée dans notre laboratoire avant notre travail de thèse. Dans notre travail de thèse, nous avons montré que les amibes ou d'autres organismes phagocytaires peuvent servir comme sources et lieu de transfert des gènes chez les mycobactéries. Ce transfert des gènes peut avoir contribué à l'adaptation des mycobactéries à un mode de vie intracellulaire. Nous avons développé ensuite deux systèmes de coculture: Mycobacterium smegmatis-Acanthamoeba polyphaga et Mycobacterium gilvum-A. polyphaga et nous avons clarifié le spectre des interactions des mycobactéries à croissance rapide avec les amibes. Ce modèle d'interaction mycobactéries-amibes a été utilisé pour tester l'hypothèse contraire au paradigme dominant que l'addition des gènes réduit la virulence des bactéries. / Mycobacteria are mycolic-acid containing, high GC% bacterial organisms which can be recovered from soil and fresh water environments where free-living protozoa also live. Co-isolation of mycobacteria and amoeba collected from such environmental sources has been reported. Several experiments further demonstrated the ability of most environmental mycobacteria to survive in the amoebal trophozoites and cysts and in some eukaryotic cells including macrophages. Genetic modification of mycobacteria in general and mycobacteria belonging to Mycobacterium tuberculosis complex in particular are complicated and no studies using genetic modification of mycobacteria (pathogenic or non-pathogenic) had been performed in our laboratory prior to our work. In our thesis work, we showed that amoebae or other phagocytic organisms can serve as sources and places for gene transfers in mycobacteria. Gene transfers may have contributed to the adaptation of mycobacteria to an intracellular lifestyle. In addition, we developed two co-culture systems: Mycobacterium smegmatis-Acanthamoeba polyphaga and Mycobacterium gilvum-A. polyphaga and we clarified the spectrum of rapid-growing mycobacteria and amoeba interactions. This model of mycobacteria-amoeba interactions was then used to test another hypothesis according to which unlike the prevailing paradigm, the addition of genes does not reduce the virulence of bacteria. For the first time in our laboratory we modified two species of the M. tuberculosis complex, M. tuberculosis H37Rv and Mycobacterium bovis BCG to observe the effect of these changes on their pathogenicity and survival.
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Méthodes de production et étude électrophysiologique de canaux ioniques : application à la pannexine1 humaine et au canal mécanosensible bactérien MscL / Production methods and electrophysiological study of ion channels : application to the human pannexine 1 and to the bacterial mechanosensitive channel MscL.

Assal, Reda 14 December 2011 (has links)
La production hétérologue des protéines membranaires reste difficile, peut-être parce que l’insertion dans la membrane de la cellule hôte constitue une étape limitante de la production. Afin de tourner cette difficulté, deux modes de synthèse ont été envisagés: la synthèse de protéines dans un système a-cellulaire, en l’absence de membrane mais en présence de détergent, ou l’adressage forcé de la protéine vers les corps d’inclusion dans le cas d’une expression plus classique en bactérie entière. La réalisation des deux stratégies repose sur l’utilisation de protéines de fusion possédant une séquence d’entraînement en amont du gène d’intérêt, soit qu’elles améliorent la traduction du transcrit en limitant le repliement spatial de ce dernier, soit qu’elles favorisent la production de la protéine d’intérêt en corps d’inclusion. La porine OmpX et le peptide T7 ont été choisis en cas d’expression dans les systèmes bactériens. La protéine SUMO est utilisée pour la production dans un lysat eucaryote. Les différentes approches ont été testées sur la production de la pannexine1 humaine (Px1).Si les séquences d’entraînement OmpX et le peptide T7 sont correctement produites in vitro, aucune des deux, en revanche, ne favorise la production de la Px1. Seul l’entraîneur SUMO est efficace. En effet, nous avons observé que cette protéine augmente la production de la Px1 dans un lysat eucaryote de germe de blé. Par ailleurs OmpX, connue pour être largement produite in vivo dans les corps d’inclusion, n’entraîne pas la localisation de la Px1 dans ces structures. Contre toute attente, l’étiquette T7 dirige la Px1 dans les corps d’inclusion. L’étude électrophysiologique de la Px1 a donc été effectuée à partir de la protéine produite in vivo (T7his-Px1) après renaturation, ou produite sous forme soluble in vitro (his6-Px1) dans le lysat eucaryote. Dans le cas de la protéine T7his-Px1 renaturée, une activité canal qui rappelle celle qui est observée après expression dans l’ovocyte de Xénope, a été détectée en patch-clamp, mais dans trois cas seulement. Dans le cas de la protéine his6-Px1, aucune activité canal n’est clairement détectée. Dans une deuxième partie de ce travail on examine le rôle de la boucle périplasmique dans la sensibilité à la pression du MscL, un canal mécanosensible bactérien devenu un système modèle dans l’étude de la mécanosensibilité. Presque toutes les études fonctionnelles sur ce canal ont été réalisées sur le canal de E.coli, alors que la structure a été obtenue à partir de l’homologue de M. tuberculosis. Une étude fonctionnelle a montré que le MscL de M. tuberculosis est difficile à ouvrir : son ouverture requiert l’application d’une pression double de celle qui est nécessaire chez E.coli. Les deux homologues diffèrent principalement par la longueur de leur unique boucle périplasmique. De manière à examiner le rôle de la boucle, on a comparé l’activité du canal MscL de E.coli, celle du canal de M. tuberculosis et celle d’une protéine chimère constituée de la protéine de M. tuberculosis dans laquelle la boucle a été changée pour celle de la protéine de E.coli. De manière inattendue, nous avons constaté que les canaux de E.coli et de M. tuberculosis ont la même sensibilité à la pression. La protéine chimère n’avait pas d’activité canal. Si ce travail ne permet pas de conclure quant au rôle de la boucle, il montre sans ambigüité que contrairement à ce qui a été rapporté les canaux MscL de E.coli et de M. tuberculosis ne diffèrent pas sensiblement sur le plan fonctionnel / The production of heterologous membrane protein is notoriously difficult; this might be due to the fact that insertion of the protein in the membrane host is a limiting step. To by-pass this difficulty, two modes of synthesis were tested: 1) production in a cell-free system devoid of biological membrane but supplemented with detergent or liposomes, 2) production in bacteria, with targeting of the membrane protein to inclusion bodies. Both strategies were tested for the production of the human pannexin 1 channel (Px1). The gene coding the protein was fused with an “enhancer” sequence resulting in the addition of a peptide or short protein at the N terminus of the protein of interest. This enhancer sequence which is well produced in vitro or in vivo is supposed to facilitate the translation of the protein of interest. Three enhancer sequences were chosen: 1) the small porin OmpX of E. coli, which, in addition, should target the protein to inclusion bodies when the protein is expressed in bacteria 2) a peptide of phage T7 for expression in E.coli lysate or E.coli cells 3) the small protein SUMO for production in a wheat germ cell-free system. In a bacterial cell-free system, neither OmpX nor T7 promoted Px1 production. Px1 is only produced when the SUMO enhancer sequence is used in the wheat germ system. In bacteria, OmpX, known to form inclusions bodies did not promote the targeting of the fusion protein to inclusion bodies. Unexpectedly, the peptide T7 was able to do it.Px1 obtained from inclusion bodies (T7his-Px1) was renatured and reconstituted in liposomes. Similarly his6-Px1 produced in wheat germ system was reconstituted in liposomes. Both preparations were used for electrophysiological studies (patch-clamp and planar bilayers). With the refolded T7his-Px1, channel activity reminiscent of that observed with Px1 expressed in Xenope oocyte (Bao et al., 2004) could be detected, but only in three cases. In the case of his6-Px1, no clear channel activity could be observed. The second part of this work deals with the involvement of the periplasmic loop of the bacterial mechanosensitive channel MscL in its sensitivity to pressure. Mscl has become a model system for the investigation of mechanosensisity. Nearly all functional studies have been performed on MscL from E.coli while the structure of the protein has been obtained from the Mycobacterium tuberculosis homologue. In one functional study it was shown that MscL from M. tuberculosis is extremely difficult to open, gating at twice the pressure needed for E.coli MscL The periplasmic loop is the most variable sequence between the two homologues, being longer in E.coli than in M. tuberculosis. In order to assess the role of the periplamic loop in the sensitivity to pressure, we compared the activity of the E.coli and M. tuberculosis MscL and of a chimeric protein made of the M. tuberculosis protein in which the periplasmic loop has been exchanged for that of the E. coli channel. Unexpectedly, M. tuberculosis and E .coli MscL were observed to gate at a similar applied pressure. The chimeric protein had no functional activity. In conclusion, this study does not allow any conclusion as to the role of the loop in the sensitivity to pressure, but it shows clearly that, in contrast to the results of a previous study, there is no functional difference between E. coli and M. tuberculosis MscL.
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Zur Substratspezifität und Substratbindung des periplasmatischen Chaperons SurA aus <i>Escherichia coli</i> / Substrate specficity and substrate binding of the periplasmic chaperone SurA from <i>Escherichia coli</i>

Hennecke, Gerrit 01 November 2005 (has links)
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Contribution of the adenine nucleotide carrier, porin, and sphingolipid metabolism to mitochondria membrane permeabilization in Saccharomyces cerevisiae / Contribution du transporteur adénine nucléotide, porine, et du métabolisme des sphingolipides à la perméabilization de la membrane mitochondrial de saccharomyces cerevisiae

Martins Trindade, Dario 20 December 2013 (has links)
La perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (MOMP) est un évènement décisif lors de la balance entre la vie et la mort de la cellule. Les évènements biochimiques responsables de la MOMP ne sont pas encore complètement définis. Deux mécanismes majeurs et distincts ont été impliqués dans le contrôle de la MOMP: i) l'action des protéines de la famille de Bcl-2, qui peuvent directement s'insérer dans la membrane mitochondriale externe (OMM) et induire l'ouverture de pores; et ii) le pore de transition de perméabilité (PTP), un canal non sélectif de la membrane mitochondriale interne, qui induit un gonflement des mitochondries à la suite d'une ouverture prolongée, suivie d'une éventuelle rupture de la MOM. L'intérêt croissant pour la biologie de la mort cellulaire, entretenu par des contributions significatives d'études sur la levure dans la compréhension des mécanismes biologiques de base, ont amené l'eucaryote unicellulaire Saccharomyces cerevisiae sur le devant de la scène. La levure est dépourvue de certains régulateurs majeurs de l'apoptose, mais possède cependant des homologues des facteurs pro-apoptotiques mitochondriaux, ainsi que des orthologues des composantes moléculaires généralement attribuées au PTP, notamment le l'échangeur ADP/ATP (AAC) et la Porine (Por1). Ces caractéristiques de S. cerevisiae, ainsi que la disponibilité d'outils moléculaires et génétiques, ont fourni une excellente opportunité d'étudier les membres de la famille de Bcl-2 dans un environnement contrôlé, ainsi que la contribution du PTP et de ses composantes à la mort cellulaire. Dans ce travail, la contribution des groupes thiol de l'AAC, leur oxydation, Por1, et la possible interaction entre ces deux protéines, ont été explorées au cours de la mort cellulaire de la levure induite par l'acide acétique. Nous avons observé que l'oxydation de Aac2p, notamment la formation de ponts disulfures, ne contribuait pas au programme de mort induit par l'acide acétique. Cette conclusion est soutenue par l'absence d'un profil particulier d'oxydation d'Aac2p. Néanmoins, il avait été précédemment démontré que l'AAC était requis pour la relocalisation du cytochrome c induite par l'acide acétique, et que son absence promouvait la survie des cellules de levure. Par contre, la délétion de Por1 diminue la viabilité de levures traitées par l'acide acétique. Il a été émis l'hypothèse que les deux protéines participent à la même voie de régulation de la mort cellulaire. Pour la tester, la relocalisation du cytochrome c a été mesurée dans des mitochondries isolées de cellules Δaac1/2/3, Δpor1 et Δaac1/2/3Δpor1 suite à l'exposition à l'acide acétique. Les données obtenues suggèrent que l'absence de Por1 n'affecte pas la relocalisation du cytochrome c pendant la mort cellulaire induite par l'acide acétique, mais pourrait être importante pour sa régulation. Quand à la fois AAC et Por1 sont absentes, les mitochondries de levure peuvent toujours relarguer le cytochrome c, suggérant l'existence d'un mécanisme indépendant de l'AAC. De plus, nous avons montré que les deux protéines ont des effets distincts dans les réponses cellulaires à différents stress. En effet, l'absence des AACs contribue à l'augmentation de la résistance au stress osmotique et de l'intégrité de la paroi cellulaire. Enfin, S.cerevisiae a été utilisé comme modèle pour étudier les aspects mécanistiques relatifs à la fonction des protéines de la famille de Bcl-2. Notamment, nous avons évalué le rôle des sphingolipides sur l'action du régulateur pro-apoptotique humain Bax. Nous avons montré que l'absence de Isc1p, une inositol phospholipase C qui dégrade les sphingolipides complexes en céramides chez la levure, favorise la viabilité de cellules de levures exprimant une forme active de Bax. Nous avons ensuite révélé que cet effet n'est pas associé à des modifications de l'activité de Bax. Il semblerait plutôt que cet effet soit lié aux conséquences cellulaires de l'action de Bax. / A decisive event in the cell’s life-or-death decision is the mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP). The biochemical events responsible for MOMP, are not entirely defined. Two major and distinct mechanisms have been implicated in the control of MOMP: i) the action of Bcl-2 family proteins, which can directly engage the outer mitochondria membrane (OMM) and induce the opening of pores; and ii) the mitochondrial permeability transition pore (PTP), an inner membrane unselective channel that induces mitochondria swelling upon long term openings, and eventual rupture of the OMM. The growing interest in cell death biology, fostered by the relevant contributions of yeast to the understanding of basic biological processes, brought the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae into the scene. Yeast cells lack some of the major regulators of apoptosis but still possess homologues of mitochondrially enclosed pro-apoptotic factors, as well as orthologues of the molecular components generally ascribed to PTP, including the ADP/ATP carrier (AAC) and Porin (Por1). These particular features of S. cerevisiae, along with the availability of genetic and molecular tools, provided an excellent opportunity to study Bcl-2 family members in a “controlled” environment, or the contribution of the PTP and its components to cell death. In this work, the particular contribution of AAC’s thiol goups, its oxidation, Por1, and of a possible interaction between both proteins to acetic acid-induced yeast cell death, was explored. We observed that oxidative modifications of Aac2p, namely the crosslinking of thiols, do not contribute to the acetic acid-induced cell death program. Such idea is supported by the apparent absence of a particular Aac2p oxidation pattern. Nevertheless, the AAC was previously found to be required for acetic acid-induced cytochrome c release, and its absence promoted the survival of yeast cells. Deletion of Por1, on the other hand, decreased the viability of yeast cells treated with acetic acid. It was hypothesized that the two proteins could share the same pathway in the regulation of cell death. To test it, cytochrome c release was evaluated in mitochondria isolated from Δaac1/2/3, Δpor1 and Δaac1/2/3Δpor1 cells following acetic acid exposure. The data obtained suggest that absence of Por1 does not affect cytochrome c releaseduring acetic acid induced-death, but it may be important for its regulation. When both the AAC and Por1 were absent, yeast mitochondria could still release cytochrome c, raising the possibility of an AAC-independent mechanism. Furthermore, we found both proteins have distinct effects that regulate the cellular response to different stresses. Indeed, absence of the AACs somehow contributed to increased osmotic stress and cell wall resistance. Finally, S. cerevisiae was used as a model to study mechanistic aspects relative to the function of Bcl-2 family proteins. Namely, we assessed the role of sphingolipids in the action of the human pro-apoptotic regulator Bax. We found that absence of Isc1p, an inositol phospholipase C that degrades complex sphingolipids into ceramides in yeast, favored the viability of yeast cells expressing an active form of Bax. It was further revealed that this effect is not associated with changes to the action of Bax; rather, it might be related with the cellular consequences of Bax-action. A parallel with the effect of Uth1p absence in yeast cells expressing Bax suggests that the absence of Isc1p could affect the selective degradation of mitochondria by mitophagy, and thus produce a different cell death response. This work provides new insights into the physiological events underlying the contribution of mitochondrial proteins, previously associated with cell death responses, and sphingolipid metabolism to cell death induced by acetic acid and Bax, respectively. Once again, the yeast S. cerevisiae proved to be an excellent model for the research of cell life and death.

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